Circular RNA differential expression in blood cell populations and exploration of circRNA deregulation in pediatric acute lymfoblastic leukemia
CircRNAomes of B-, T-cell and monocyte populations
CircRNA expression in B-, T-cell and monocyte populations of healthy donors was studied using high-depth ribodepleted RNA-12 näytteen SEQ-tiedot, joissa on 4 rinnakkaisnäytettä kutakin lajiteltua solupopulaatiota kohti perifeerisen veren mononukleaarisoluista, PBMCs (GEO-sarjan tunnus: GSE110159; täydentävät menetelmät ja täydentävä Taulukko 1).
CircRNA-kvantifioinnin ja-huomautuksen toimitti CirComPara25, joka yhdisti 9 circRNA-tunnistusohjelmistoa (CIRI226 Findcirc27; CIRCexplorer228 bwa29: llä, STAR30: llä, Segemehl31: llä ja TopHat232: lla; DCC33: lla, circRNA_finder34: llä ja Segemehl31: llä) luotettavimpien backsplicien saamiseksi. Kahden tai useamman circRNA-tunnistusalgoritmin jaetun tuotoksen on itse asiassa osoitettu vähentävän vääriä positiivisia ennusteita35, 36. CirComPara suorittaa read pre-processing-laatusuodattimia, kuten sovittimen trimmausta, read mean-laatuvalintaa ja suodatusta lukupituuden mukaan. Lisäksi CirComPara laskee lineaarisesti saumatut lukemat, jotka ovat linjassa kunkin circRNA: n backsplice-liittymien kanssa arvioidakseen circRNA: n isäntägeenistä ilmaistujen lineaaristen transkriptien ilmentymisen. Nämä arvot yhdistettiin ympyrälauseketta mittaaviin backspliced-lukulukuihin, joilla pyrittiin laskemaan lausekkeiden osuus ympyrälausekkeiden ja lineaaristen isoformaattien välillä (Circular to Linear expression Proportion, CLP; KS.menetelmät). Edelleen, CLP upottaa käsitteen circular lineaarinen expression korrelaatio, niin että CLP vaihtelu eri olosuhteissa välittää riippumattomuus välillä circRNA ja sen isäntä-geenin lineaarinen ekspressio33.
kaiken kaikkiaan 68 007 sirkrnaa 10 148 yksittäisestä geenistä havaittiin vähintään kahdella menetelmällä. Kuten Hansen et al.36, algoritmit enimmäkseen sovittu erittäin ilmaistaan circRNAs, kun taas ne havaitaan vain yksi algoritmi oli yleensä alhainen luku (täydentävä Kuva. 1).
lisäksi haettiin osajoukko, jossa oli 6 228 circrnaa (3 323 geenistä), jotka ilmentyivät kaikissa vähintään yhden solutyypin biologisissa toisinnoissa, ja sitä kutsuttiin nimellä “high confidence” (HC) circRNAs (Supplementary Table 2). Tässä tutkimuksessa raportoitujen circRNAs-arvojen vertailu Nicolet et al.17 vahvistettu vastaavuus 83%: lle aiemmassa tutkimuksessa haetuista 489 HC-circrnoista ja paljasti 5 824 ylimääräistä HC-sirkrnaa, joita ei vielä tutkittu verisolupopulaatioiden ekspressiovaihtelun osalta (täydentävä Kuva. 2 A).
6 228 HC: n sirkrnoista 5 970 ja 5 821 ilmaistiin B – ja T-soluissa ja 5 144 monosyyteissä (Kuva. 1 A). Suurin osa circrnoista (4 763; 80%) havaittiin kaikissa kolmessa solutyypissä, mukaan lukien ubiquitous circZNF60937, circHIPK338 ja novel circRNAs. Uudet circrnat (esim.circPICALM) ovat todennäköisesti spesifisiä hematopoieettiselle osastolle. CircRNAs jaettu kaksi solutyyppiä, joissa enimmäkseen yhteisiä lymfosyyttien.
B-, T-solujen ja monosyyttien sirkrnaomen Vertailu. A) B-, T-soluissa ja monosyyteissä ilmaistujen 6 228 korkean luottamusvälin (HC) circrnojen päällekkäisyys; b) HC circRNA-ekspressioprofiilien pääkomponenttianalyysi; c) Validoidut circrnat RNaasi-R-käsittelyn jälkeen. B2M, GAPDH ja HPTR mRNAs esitetään positiivisina kontrolleina; suhteellinen ilmentymä lasketaan seuraavasti: 2−∆Cq, jossa ∆Cq on käsitellyn RNaasi-r: n ja pbmc: n RNA: n erotus; d) sirkrnojen määrä per geeni ilmaistuna kokonaisuutena ja kussakin solutyypissä.
valvomaton pääkomponenttianalyysi osoitti suhteellisen pientä vaihtelua circRNA-ekspressioprofiileissa saman solupopulaation toistoissa ja osoitti sirkrnaomien eroja, jotka selvästi erottivat solutyypit (Kuva. 1b).
RT-PCR validoi 21 HC circRNAs: n ilmentymisen eri terveiden luovuttajien Pbmc: issä (täydentävä Taulukko 3; taulukko 1; kuva. 1c). Tähän validointiin sisältyi eksonisia sirkrnoja 15 eri geenistä, kaksi vaihtoehtoista IKZF1: n isoformia ja Y-kromosomin urospesifisen ZFY: n isoformia, yksi circRNA (18:63280887-63281214: -) johdettu ainutlaatuisen suuren bcl2-intronin 328 bp: n kiertoliikkeestä ja yksi circRNA oletetusta uudesta geenistä (“intergenic”, katso alla). CircRNAs: n ympyränmuotoinen rakenne vahvistui RNaasi-R-käsittelyn jälkeen havaitulla circrnas: n rikastumisella, ja qRT-PCR havaitsi poikkeavilla alukkeilla erityisesti backsplice junction14,27. Lisäksi kaikki ennustetut takaisinkytkennät vahvistettiin Sanger-sekvensoinnilla.
uusien geenien
lähes kaikki circrnat (99, 4%), jotka on johdettu merkinnöillä merkityistä geeneistä, pääasiassa backsplice-liitoksilla, jotka ovat päällekkäisiä tunnettujen eksonien kanssa (98, 9%). Niistä 71 circrnasta, joiden molemmat päät olivat intronisilla alueilla, runsaimpia olivat lymfosyyttispesifinen circbcl2, joka validoitiin, circHLA-E, circRASSF3 ja useat circMBL1-isoformit.
lähes puolet circRNA-isäntägeeneistä ilmaisi useita (jopa 20) ympyränmuotoisia isoformeja kussakin (viikuna. 1d). Edullinen backsplice liitos käyttö ja ilmentyminen yksi tai muutama yleinen isoforms havaittiin. Eniten isoentsyymejä ilmaistiin monosyyteissä AGTPBP1: llä (20) ja PICALMILLA (15) ja lymfosyyteissä UBAP2: lla (19) ja ATM: llä (17).
kolmekymmentäneljä sirkrnaa, jotka on johdettu geenien välisiltä alueilta. Intergenic circRNAs käyttäen samaa backsplice päättyy eri yhdistelmiä tunnistettu kolme lokusta ilmentävät useita isoformeja. Viisi “intergeenistä” circrnaa, jotka on johdettu oletetusta uudesta geenistä Xq11.2-alueella (chrX:65051462-65113813) (täydentävä Kuva. 3). Lokuksen runsain circRNA, circX (intergeeninen) (X:65051462-65075912:+), jonka memczak ja colleagues12 ovat aiemmin havainneet veressä, validoitiin (Kuva. 1c).
seuraavaksi selvitimme, missä määrin lauseke puoltaa kehälinjaa suhteessa lineaarisiin transkriptioihin, jotka ovat päällekkäisiä selkäliitosten kanssa. CLP-arvot ovat välillä 0-1: 0, kun ei havaita ympyrälauseketta, 0 < CLP < 0, 5 edustaa ympyrälausekkeita ilmaistuna vähemmän runsaina kuin vastaavat lineaariset isoformit, 0, 5 tarkoittaa, että ympyrälausekkeilla ja lineaarisilla transkripteillä on vastaava runsaus, 0.5 < CLP ≤ 1 osoittaa kehämäisiä isoformeja, jotka on ilmaistu runsaammin kuin vastaavat lineaariset transkriptit. Erityisesti CLP = 1, kun lineaarista lauseketta suhteessa circRNA: han ei havaita. Mielenkiintoista, 10 circRNAs ei lineaarinen lauseke havaittiin. Lisäksi CLP oli huomattavan korkea (>0, 95) 14 circrnalla (täydentävä Taulukko 4), mukaan lukien circGUSBP2 ja circNBPF10, CLP: n mediaani oli 0, 99-1 kaikissa solupopulaatioissa (täydentävä Taulukko 4), ja circAFF2, jossa KLP oli korkea monosyyteissä (0, 97). Preferentiaalinen transkriptiokehitys spesifisten geenien kypsissä verisoluissa 5,39 ja / tai ympyränmuotoisempi stabiilisuus verrattuna lineaariseen RNAs16,40: een voisi selittää nämä löydökset.
solutyyppien Vertailu paljasti solutyyppispesifisen sirkrna-ekspression ja vaihtoehtoiset circularisaatiomallit
seuraavaksi pyrittiin määrittelemään erot B -, T-solu-ja monosyyttipopulaatioiden sirkrnaomeissa. Näiden kolmen populaation parivertailuissa todettiin yhteensä 1 369 merkitsevästi toisistaan eroavaa sirkrnaa (DECs) solutyyppien välillä (täydentävä Taulukko 5), jotka on johdettu 880 geenistä. Hierarkkinen klusterointi DEC lauseke profiilit heijastuu sarjaa circRNAs upregulated kussakin solutyypissä (Kuva. 2 a). DECs yksinomaan tai yli-ilmaistuna yhdessä solutyypissä ilmoitettu populaatiospesifinen circRNAs (Kuva. 2b): 622 oli tyypillistä B-soluille, 183 T-soluille ja 438 monosyyteille (yhteensä 1 243; täydentävä Taulukko 5). Lisäksi molemmissa lymfosyyttipopulaatioissa (Fig. 2b-d). B-solulle ominaisten circRNAs-geenien geeneihin ei ole merkittävästi rikastuneita Kegg-reittejä, jotka kuitenkin sisälsivät B-solun reseptorisignaalireittiin osallistuvia geenejä, kuten SOS2 ja NFKB1, tai B-solun toimintoihin liittyviä. Päinvastoin, t-solulle ominaisia sirkrnoja ilmentävät geenit rikastivat merkittävästi T-solun reseptorin signalointireittiä. Lisäksi monosyyteille ominaisten sirkrnojen geenit rikastivat merkittävästi useita monosyyttien toimintoihin liittyviä biologisia prosesseja ja reittejä. Muilla solutyypeille tyypillisillä isäntägeeneillä sen sijaan oli solutoimintoja, jotka eivät suoraan liittyneet alkuperäsoluun (täydentävä Taulukko 6).
circRNAs: n differentiaalinen ilmentyminen kypsissä verisolupopulaatioissa. a) hierarkkinen ryhmittely (Euklidinen etäisyys; complete clustering) ekspressioprofiilin 1,369 merkitsevästi eroavat ilmaistut circrnat (DECs) solutyyppien välillä. (B) Venn kaavio, joka osoittaa päällekkäisyyttä circRNAs overexpressed kussakin populaatiossa: non-intersections osat hahmotella solun tyyppi-spesifinen overexpressed circRNAs. C) Isäntägeenit yli-ilmentymälle vain yhdessä solutyypissä: risteysalueet edustavat eri solutyypeissä yli-ilmentyviä eri kehämäisiä isoformeja ilmentäviä geenejä. (d) qRT-PCR validointi ekspression 15 circrnaa, joista 13 on merkittävästi yliekspressoituneita monosyyteissä (M), T-soluissa (T), B-soluissa (B) tai molemmissa lymfosyyttipopulaatioissa (T + B). Yhtäpitävästi RNA-seq-tietojen kanssa circZFY ja circGRHPR eivät olleet merkittävästi toisistaan poikkeavia. Backsplicessa mukana olevat geenieksonit näkyvät sulkeissa circRNA-nimen jälkeen. Ilmentymä suhteessa B-solujen keskiarvoon. Mann-Whitneyn U-testi, p-arvo * < 0.05, ** < 0.01.
vaikka solutyypille ominaiset circRNA-joukot olivat hajanaisia, spesifisiä isoformeja ilmentävien geenijoukkojen päällekkäisyys osoitti vaihtoehtoisia solutyypille spesifisiä circularisaatiomalleja. Huomautus, 37 geenit ilmaistaan circRNAs ominaista kahdelle solutyypille ja osuus 14,7% geeneistä, joilla on useita solutyyppispesifisiä circRNAs (Kuva. 2c). Neljä circAKT3-isoformia osoitti solutyyppispesifistä ilmentymistä, kolme B-ja yksi T-soluille; myös neljä circMBNL1 oli solutyyppispesifisiä, 3 B-soluille ja yksi monosyyteille. Lisäksi kuusi eri grk3-kehäistä isoentsyymiä oli nimenomaan yliekspressoituneita B-soluissa, kun taas kaksi muuta yliekspressoitui vain monosyyteissä.
kvantifiointi qRT-PCR: llä B-soluissa, T-soluissa ja monosyyteissä, jotka on lajiteltu 5 riippumattomalta terveeltä luovuttajalta, vahvisti RNA-seq-tulokset kaikille 15 testatulle sirkrnalle, mikä tukee tietojen luotettavuutta ja toistettavuutta (Kuva. 2d ja täydentävä Kuva. 4).
B-soluissa vahvistettiin merkitsevä 5 circrnan suuruinen säätely, mukaan lukien circAFF3 (eksonit 4-6), circIL4R (eksonit 6-7), circSETBP1 (eksoni 2). Lisäksi korkea circRNA ilmentymä genomialueelta 9p13.2 mukaan lukien PAX5(täydentävä Kuva. 5) validoitiin: circPAX5 (eksonit 2-5) ja circZCCHC7 (Exon 2) olivat molemmat B-soluspesifisiä, kun taas suuntaus kohti circGRHPR: n säätelyä B-soluissa oli yhdenmukainen RNA-seq-tiedoista saadun arvion kanssa. PAX5: llä on merkittävä rooli B-solujen sitoutumisessa41, ja pax5: n ja ZCCHC7: n lineaaristen transkriptien rinnakkaisekspressio kuvattiin edettäessä tavallisista lymfosyyttien esiasteista pre-pro-B-soluihin42. Viittaa 9p13: n yhteissääntelyyn.2 locus, circPAX5, circZCCHC7 and circGRHPR isoforms were all overexpressed specifically in B-cells. CircPAX5 and circZCCHC7 were previously detected in CD19 + cells14. Both circZCCHC7 and circGRHPR were identified in CD34 + cells and, according to data on RNA base modification promoting efficient initiation of protein translation from circRNAs in human cells, are likely to encode peptides10.
Regarding T-cells, significant overexpression was confirmed for circIKZF1 (exons 2–3), circTNIK (exons 5–7), circTXK (exons 2–6) and, in agreement with previous reports17, for circFBXW7 (exons 3–4). Also an increasing trend for circZFY (exons 2–3) in T-cells and for circAFF2 (exon 3) in monocytes, in agreement with Nicolet et al.17, confirmed RNA-seq results, while significant upregulation of circX(intergenic) and circBCL2(intronic) in lymphocytes and of circHIPK3 (exon 2) in monocytes was validated.
Nicolet et al.17 löytyi 102 circrnaa eri tavoin ilmaistuna eri verisolutyypeissä ja-vaiheissa, joista 98 havaittiin tiedoissamme. Erityisesti 42 circrnaa johti eri tavoin ilmaistuna myös vertailussamme, joista 31 oli solutyyppispesifisiä. Kaiken kaikkiaan meidän tiedot, joissa yhdessä circRNA klustereita aiemmin liittynyt kypsä solupopulaatioiden (täydentävä Kuva. 2b). CircRNAs aiemmin osoitettu lymfoidisolupesifisiä klustereita osoitti korkein ilmentymä B-soluissa tai T-soluissa, mukaan lukien circZCCHC7 ja circFBXW7 että me kokeellisesti validoitu. Yhdeksän kymmenestä aiemmin monosyyttispesifiseksi arvioidusta sirkrnasta palautui mieleen, kun analyysimme ilmeni enemmän monosyyteissä, mukaan lukien circAFF2. Suurin osa tässä tutkimuksessa solutyyppispesifisiksi määritellyistä 1243 circrnasta, mukaan lukien 11 15 circrnasta, joille qRT-PCR vahvisti solutyyppispesifisen yliekspression tässä tutkimuksessa (Kuva. 2d), eivät olleet edustettuina Nicolet et al: n määrittelemissä klustereissa.
seuraavaksi tarkastimme, muuttuiko kehämäisten isoformien runsaus lineaarisen ilmaisun suhteen solutyyppien välillä. CLP: n vaihtelut näyteolosuhteissa osoittavat sirkrna: n ja isäntägeenin lineaarisen ilmentymän välisen riippumattomuuden nopeuden. Ensinnäkin havaitsimme, että runsaamman kehäekspression (CLP > 0, 5) omaavien piirien määrä oli suurin lymfoidisissa soluissa (185 monosyyteissä, 333 ja 364 B-soluissa ja T-soluissa), mikä vastaa aiempia havaintoja Pienemmästä piirikunnasta17. Sitten tunnistimme 687 circrnaa (495 geenistä), joilla on host-geenin riippumaton ilmentymä (täydentävä Taulukko 7). DECs: stä 163: lla oli merkittävää vaihtelua kehäilmaisun suhteessa solutyyppien välillä, mikä osoittaa, että havaitut vaihtelut näissä circRNA-ilmentymätasoissa solupopulaatioiden välillä eivät johdu vastaavasta lineaarisen ilmentymän vaihtelusta. CircIKZF1, jonka osalta T-solujen säätely vahvistettiin, ilmaistiin myös korkealla CLP: llä T-soluissa. Erityisesti, 25 circRNAs osoitti korkea ja merkittävästi vaihteli Pyöreä lauseke osuus (täydentävä Kuva. 6), mukaan lukien validoitu circX(intergeeninen) ja kolme muuta intergeenistä circrnaa, jotka kaikki ovat yliekspressoituneita B – ja T-soluissa. CircSMARCA5: llä oli korkein absoluuttinen ja suhteellinen kehäilmaisu B-soluissa, kun taas T-soluissa se oli huomattavasti pienempi ja monosyyteissä pienin (täydentävä viikuna. 7).
circrnojen ilmentymistä B-solujen esiasteen akuutin lymfoblastisen leukemian kuudessa sytogeneettisessä alatyypissä
edellä kuvatun transkriptominlaajuisen circRNA-resurssin perusteella tutkittiin circrnojen ilmentymistä ja mahdollista sääntelyn purkamista BCP-Allissa. Valitut circrnat osoittivat lymfosyyttispesifisyyttä ja / tai olivat peräisin leukemiaan liittyvästä lokuksesta. Näiden kriteerien mukaisesti kymmenen circrnaa, joilla on validoitu säätely B-soluissa, T-soluissa tai molemmissa lymfosyyttipopulaatioissa (Kuva. 2d) valittiin kvantifioitavaksi BCP-ALL-tutkimuksessa, mukaan lukien tunnettujen geenien (AFF2, AFF3, BCL2, FBXW7, IKZF1, IL4R, PAX5, SETBP1 ja ZCCHC7) circx(intergeeninen), joka on voimakkaasti ilmaistu lymfosyyteissä. Lisäksi, circZFY, circRNA ilmaistuna korkealla tasolla verisoluissa miespotilaiden; circHIPK3, jolle onkogeeniset ominaisuudet tunnetaan kiinteissä syöpissä43, ja circPVT1, joka on äskettäin yhdistetty akuuttiin lymfoblastiseen leukemia22: een, otettiin mukaan.
13 valitun circRNAs: n ilmentyminen mitattiin qRT-PCR: llä 32 BCP-ALL patient-derived xenograft (PDX) – näytteessä (täydentävä taulukko 8).
kaikkia leukemianäytteitä yhdessä verrattiin ensin terveiden luovuttajien B-soluihin (täydentävä Kuva. 8 ja kuva. 3a) valvomaan sääntelemättömän circRNA: n ilmentymistä leukemisissa soluissa. Seitsemällä sirkrnalla ilmaisu oli merkittävästi erilainen kaikissa näytteissä verrattuna B-soluihin. CircIL4R, circZCCHC7 and circX(intergenic), all highly expressed in lymphocytes, were less expressed in ALL. Conversely, overexpression of circAFF3, circHIPK3, circPVT1 and circPAX5 in BCP-ALL emerged. Differently from circPVT1 and circHIPK3, a functional characterization of circPAX5 and circAFF3 is still lacking. Thus, custom functional predictions, in terms of possible miRNA- binding sites, RNA binding protein (RBP) binding sites, and coding potential were obtained (Fig. 3b and Supplementary Fig. 9).
CircRNA-ilmentymä potilasjohtoisessa BCP: ssä-circAFF3: n ja circPAX5: n kaikki näytteet ja ennustetut toiminnot. (a) qRT-PCR: llä arvioitujen 12 circrnan suhteellinen ilmentymä terveissä PBMC: stä johdetuissa B-soluissa ja 32 BCP-ALL-potilasjohdannaisessa ksenograftinäytteessä, joilla on eri geneettisiä alatyyppejä: MLL uudelleenjärjestäytynyt (N = 4), BCR-ABL (3), ETV6-RUNX1 (6), TCF3-PBX1 (4), Korkea hyperdiploidi (>50 kromosomia, 7), “muut” (negatiivinen edellä mainituille uudelleenjärjestelyille, 8). Ilmentymä suhteessa B-soluihin. Vain merkittävät p-arvot (<0.05) merkitään (Kruskal-Wallis-testi, korjattu monitestiksi Benjamini -, Krieger-ja Jekuteli-menetelmällä). “B-solujen” p-arvot viittaavat B-soluihin vs kaikkiin BCP-ALL-näytteisiin (Mann Whitney U-testi, vain merkittävät arvot esitetty). (b) circAFF3: n ja circPAX5: n toimintojen ja vuorovaikutusten ennustaminen, mukaan lukien ennustetut miRNA-sitoutumispaikat, sekvenssimotiivien mahdollisesti tunnistamat RNA: ta sitovat proteiinit (RB) ja vähintään 150 nt: n avoimet lukukehykset (ORFS), jotka ulottuvat taustalevyyn.
lisäksi tutkimme ilmentymistä tavoitejoukon circRNAs koko tärkeimmät BCP – kaikki sytogeneettiset alatyypit (Kuva. 3 A). Sytogeneettisille alatyypeille ovat ominaisia erityiset geneettiset leesiot, kuten toistuvat translokaatiot (MLL: n uudelleenjärjestelyt, BCR/ABL, ETV6-RUNX1 ja TCF3-PBX1-fuusiot) ja hyperdiploidinen karyotyyppi. Sytogeneettisellä alatyypin luonnehdinnalla on keskeinen merkitys leukemiapotilaiden riskiennusteessa ja hoidon osituksessa. Eri alatyyppien leukemiasoluilla on erilliset biologiset piirteet, geeniekspressioprofiilit ja erityiset miRNA-signatures44,45. Tässä yhteydessä uutta tietoa akuuttien leukemioiden heterogeenisuudesta lisäsivät sytogeneettisten alatyyppien havaitut merkittävät circRNA-ilmentymäerot (Fig. 3 A). CircAFF2 ilmaistiin voimakkaasti tcf3-PBX1 BCP-ALL-ryhmässä ja vähemmässä määrin ETV6-RUNX1 BCP-ALL-ryhmässä verrattuna B-soluihin ja muihin sytogeneettisiin BCP-ALL-alaryhmiin. CircBCL2 (intronic) oli ylisääntelyä kaikissa ETV6-RUNX1-fuusioilla. CircSETBP1 ja circX (intergeeninen) pienenivät molemmat hyvin paljon MLL: n uudelleen järjestetyissä näytteissä. CircIKZF1 oli pienempi BCR-ABL-ja hyperdiploidisissa leukemioissa verrattuna ETV6-RUNX1-alatyyppiin, jossa ekspressio säilyi B-soluihin verrattavilla tasoilla.
