Cistron
PTX: n Biogeneesi
viisi PTX: n alayksikköä koodataan vierekkäisillä cistroneilla yhden polysistronisen operonin sisällä , jonka lauseketta säätelee BvgA/s-järjestelmä. Tämän kaksikomponenttijärjestelmän kautta toksiinin tuotantoa voidaan moduloida mgso4: n tai nikotiinihapon avulla tai kasvun aikana alhaisissa lämpötiloissa (KS.uudelleen). BvgS on sisäkalvon läpi kulkeva proteiini, joka ilmentää useita kinaasitoimintoja. Aktiivisessa tilassa se aktivoi bvga: ta fosforylaation kautta. Fosforyloitu bvga, sytoplasmainen transkription säätelijä, sitoutuu tämän jälkeen PTX-geenin promoottorialueen operaattoripaikkoihin, joissa se vuorovaikuttaa RNA-polymeraasin kanssa ja aktivoi transkription. Vaikka bvgs-signalointia häiritseviä modulaattoreita on tunnistettu, signaloinnin käynnistämiseen tarvittavaa bvgs-ligandia ei tunneta, mikä viittaa siihen, että bvgs aktivoituu oletuksena .
transkription jälkeen yksittäiset alayksiköt valmistetaan preproteiineina, jotka sisältävät pilkkoutuvia signaalipeptidejä. Kun translokaatio sisäkalvon läpi (todennäköisesti Sec-riippuvaisen reitin kautta), signaalipeptidit poistetaan. Vaikka signaalipeptideissä on leader-peptidaasi I: n substraateille tyypillisiä piirteitä, niiden pilkkominen Escherichia coli-bakteerin leader-peptidaasi I: n avulla on hyvin tehotonta. B. pertussis lep-geenin coekspressio E. coli-bakteerissa lisää merkittävästi PTX-alayksiköiden kypsymistä . Periplasmisessa tilassa muodostuu alayksikön sisäisiä disulfidisidoksia, ja holotoksiini kootaan sitten ennen eritystä ulomman kalvon läpi. PTX sisältää yhteensä 11 alayksikön sisäistä disulfidisidosta, yhden S1: ssä, kaksi jokaisessa S4: ssä ja S5: ssä sekä kolme jokaisessa S2: ssa ja S3: ssa . Kaikki ptx: ssä esiintyvät kysteiinit ovat mukana ketjun sisäisissä disulfidisidoksissa . Disulfidin muodostuminen on tärkeää toksiinin biogeneesin kannalta, sillä jommankumman kysteiinin muuttuminen S1: ssä estää tätä alayksikköä kokoontumasta B-oligomeerin kanssa . Disulfidin asianmukainen muodostuminen perustuu DsbA / DsbC-järjestelmään, jonka todettiin olevan välttämätön PTX: n kokoamisessa ja erityksessä . DsbC: n mutaatioilla, jotka koodaavat yhtä kolmesta disulfidi-isomeraasista, ei kuitenkaan ilmeisesti ole vaikutusta toksiinin kokoonpanoon, vaikka ne heikentävätkin sen eritystä, mikä viittaa siihen, että DsbC vaikuttaa komponenttiin, jota tarvitaan erityisesti PTX: n eritykseen.
eritystä ei tarvita PTX: n biologisiin vaikutuksiin, mutta holotoksiinin täydellinen kokoaminen on tärkeää tehokkaan erityksen kannalta, sillä vain S1: tä tai vain B-oligomeeria tuottaviksi rakennetuissa kannoissa on puutteita erityksessä . Täysin toimiva B-oligomeeri voi kuitenkin erittyä tietyssä määrin S1: n puuttuessa , mikä osoittaa, ettei S1: n esiintyminen ole ehdoton vaatimus B-oligomeerin eritykselle. Sen sijaan S1: tä ei yksinään voida erittää B-oligomeerin puuttuessa, mikä viittaa siihen, että eritystä määrittävät tekijät sijaitsevat B-oligomeerin sisällä, vaikka S1: n läsnäolo voi varmasti tehostaa eritystä. Eräillä S1-geenin mutaatioilla on voimakas haitallinen vaikutus eritykseen erityisesti Arg-57: n ympäristössä, mikä viittaa siihen , että tällä S1: n alueella on rooli PTX: n erityksessä. B-oligomeerin puuttuessa S1 todennäköisesti jakautuu ulkokalvolle ehkä C-terminaalisen, hydrofobisen domeeninsa kautta. Tämä voi olla paikka, jossa B-oligomeeri yhdistyy ennen eritystä ulkokalvon läpi .
holotoksiinikokoonpanon molekyylivaiheet tunnetaan edelleen huonosti. Yksittäiset alayksiköt mutanttikannoissa, jotka eivät tuota muita alayksiköitä, hajoavat nopeasti. Tietyt alayksiköiden yhdistelmät näyttävät vakauttavan toisiaan . Esimerkiksi S2-alayksikön stabiilisuutta parantaa huomattavasti S4: n läsnäolo ja päinvastoin, mikä vastaa holotoksiinin kiderakenteen paljastamaa S2–S4-dimeerimuodostumaa. On myös mahdollista, että S2–S4-dimeerin ja S1-alayksikön osakokonaisuudet muodostuvat S3: n ja S5: n puuttuessa. S2-S4-dimeerin ei ole todettu erittävän B: tä. hinkuyskää, kun taas S1: n lisääminen tähän dimeeriin voi johtaa jonkinasteiseen eritykseen.
PTX: n kuljetus B. hinkuyskän ulkokalvon läpi perustuu yhdeksästä eri proteiinista muodostuvaan tyypin IV eritysjärjestelmään (t4ss), joka on nimetty PtlA: ksi PtlI: n kautta . Nämä proteiinit ovat homologisia kuin t4sss muista bakteereista, mukaan lukien Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, ja Rickettsia prowasekii . Ptl-geenit sijaitsevat suoraan alavirtaan viidestä rakenteellisesta PTX-geenistä ja ovat ptx-promoottorin valvonnassa . Ptl-proteiineja näyttää kuitenkin syntyvän PTX-alayksiköitä alhaisempina pitoisuuksina, mistä on osoituksena phoA-geenin translationaaliset fuusiot eri ptx-ja ptl-geenien kanssa . Tiettyjen Ptl-proteiinien tuotanto näyttää rajoittavan PTX: n eritystä. Eksponentiaalisen kasvun aikana bakteerien on arvioitu erittävän kolmea toksiinimolekyyliä/min/ bakteerisolu , ja alayksiköiden on havaittu kertyvän periplasmiseen tilaan sekä yksittäisinä alayksikköinä että koottuina holotoksiineiksi. Alayksikön kertymistä tapahtuu koko eksponentiaalisen kasvun ajan, vaikka tiettyjen Ptl-proteiinien pitoisuudet nousevat 30-1 000 molekyyliin solua kohti. Näin ollen erittyminen toksiinin tuotannon tai kokoonpanon sijasta voi rajoittaa nopeutta. Erikoista on, että Ptl-proteiinien puuttuessa jotkin alayksikköyhdistelmät, kuten S2-S4-dimeeri S1: n läsnä ollessa , voivat erittyä, joskin holotoksiinin eritys riippuu voimakkaasti Ptl-proteiinien läsnäolosta.
Ptl-proteiinien uskotaan muodostavan kompleksin, joka ulottuu sekä sisä-että ulkokalvoihin , ja kaikkia niitä (ainakin PtlA-H) tarvitaan toksiinin eritykseen, mitä tutkitaan mutaatioilla kussakin yksittäisessä ptl-geenissä . Jotkin transissa villin tyypin ptl+ – kantoihin tuodut mutaatiot johtivat dominanttinegatiiviseen eritysfenotyyppiin, mikä vahvisti, että ainakin PtlC-PtlH ovat osa multimeeristä kompleksia. Tärkeä vaihe PTX: n erityksessä on ilmeisesti sen kyky ylittää peptidoglykaanikerros, ja PtlE: n on osoitettu ilmentävän peptidogykanaasiaktiivisuutta . Tämä 276-jäämiä pitkä proteiini sisältää aktiivisen kohdan yhtäläisyyksiä muiden glykohydrolaasien kanssa, ja alaniinisubstituutioiden tässä kohdassa on osoitettu vähentävän rekombinantti PtlE: n peptidoglykanaasiaktiivisuutta huomattavasti. Samat substituutiot luonnollisessa PtlE: ssä poistavat myös B. hinkuyskän aiheuttaman PTX: n erityksen, mikä viittaa vahvasti siihen, että PtlE on peptidoglykanaasi, jota toksiini tarvitsee peptidoglykaanikerroksen läpäisemiseen.
PTX: n eritys vaatii todennäköisesti myös energiaa. Kaksi Ptl-proteiinia, PtlC ja PtlH, sisältävät oletettuja adenosiinitrifosfaatin (ATP) sitoutumispaikkoja ja saattavat siten antaa tarvittavan energian toksiinin eritykseen. Molempien proteiinien on osoitettu olevan välttämättömiä eritykselle, ja molemmissa tapauksissa oletetut ATP-sitoutumispaikat ovat välttämättömiä toiminnan kannalta. Molempien kohdalla havaitaan dominoiva negatiivinen fenotyyppi, kun mutanttialleelit koekspressoituvat villin tyypin alleelin kanssa, mikä viittaa siihen, että molemmat toimivat multimeereinä tai ovat osa erityskompleksia. PtlH: n on osoitettu olevan yhteydessä sisäkalvoon, ja ptlh: n ATP-sitoutumiskohdan mutaatiot vaikuttavat sen solupaikkaan ja lakkauttavat sen vuorovaikutukset muiden Ptl-proteiinien kanssa . PtlC: n tarkkaa roolia ei vielä tiedetä. PtlD on myös sisäkalvon proteiini ja sisältää viisi transmembraanidomeenia. Sitä tarvitaan PtlE: n, PtlF: n ja PtlH: n stabiilisuuteen C-terminaalinen 72-jäämien kautta. Tämä C-terminaalinen alue ei kuitenkaan riitä toksiinin eritykseen . PtlF: ssä on piirteitä ulommista kalvoproteiineista (OMPs), mutta se voi liittyä myös sisäkalvoon. Pelkistämättömissä olosuhteissa PtlF ja PtlI vaeltavat kompleksina natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin aikana, mikä osoittaa PtlI: n sitoutuvan PtlF: ään disulfidisidoksen muodostumisen kautta . Oikea disulfidisidoksen muodostuminen PtlI: n ja PtlF: n välillä saattaa riippua DsbC: stä, sillä dsbC-geenin mutaatiot vaikuttavat eritykseen vaikuttamatta toksiinin kokoonpanoon .
