Claudin-1: n vasta-ainetavoittaminen potentiaalisena kolorektaalisyöpähoitona

CRC-näytteet

geeniekspressioprofilointia varten valitsimme 143 kasvainnäytettä 143 potilaalta, jotka kuuluivat kolmeen kohorttiin: prospektiivinen yhden keskuksen tutkimus REGP (19 potilasta) (GSE62322) , retrospektiivinen monikeskus cosival-tutkimus (68 potilasta) ja prospektiivinen monikeskustutkimus biocolon (56 potilasta) (Gse62080 ja gse72970) . Näissä kolmessa tutkimuksessa Sisällyttämisperusteet olivat: histologisesti osoitettu paksusuolen adenokarsinooma, pitkälle edennyt ja bidimensionaalisesti mitattavissa oleva kasvain (vaihe IV), Ikä 18-75 vuotta ja Maailman terveysjärjestön (WHO) suorituskykyluokka ≤2. Ennen hoitoa kaikille potilaille tehtiin leikkaus primaarikasvaimen resektioon tai endoskooppiseen biopsiaan.

western blot-analyysissä käytettiin 13 uutta kasvainnäytettä prospektiivisesta yhden keskuksen tutkimuksesta REGP, mutta ne eivät sisältyneet 143 näytteeseen.

immunohistokemian analyysia varten kudosnäytteet 52 muulta CRC-potilaalta valittiin takautuvasti Montpellier pathology Filesin Syöpätutkimusinstituutista vain silloin, kun samalta potilaalta oli saatavilla normaalit limakalvo -, adenooma-ja adenokarsinoomanäytteet.

asianomaiset eettiset komiteat hyväksyivät kaikki tutkimukset, joissa käytettiin ihmiskudosnäytteitä, ja kaikille osallistujille tiedotettiin tutkimuksen tavoitteista ja menetelmistä sekä allekirjoitettiin kirjallinen tietoon perustuva suostumus ennen ilmoittautumista.

Geeniekspressioanalyysi

paksusuolen näytteet (normaalit paksusuolen, primaarikasvaimen ja maksan etäpesäkkeet reg/P-tutkimusta varten, mutta vain primaarikasvainnäytteet KOSIVAL-ja BIOKOLONITUTKIMUKSIA varten) kerättiin leikkauksen yhteydessä standardoidulla menetelmällä korkealaatuisen RNA: n saamiseksi . Näytteet hybridisoitiin sitten ihmisen genomin U133 Plus 2.0 matriisiin (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

tunnistaaksemme uusia terapeuttisia kohteita vasta-ainepohjaiselle hoidolle mCRC: ssä vertailimme normaalin limakalvon (n = 17), primaarikasvaimen (n = 20) ja maksan etäpesäkkeiden (n = 19) kudosnäytteiden geeniekspressioprofiileja.

koska CRC: n heterogeenisuus on otettava huomioon vertailtaessa geeniekspressioprofiileja, primaarikasvainnäytteet (n = 143) luokiteltiin käyttäen kolmen riippumattoman ryhmän ehdottamiin geeniekspressioprofiileihin perustuvia CRC: n molekyyliluokituksia ja tuoretta konsensusluokitusta . Lyhyesti, De Sousa E. Melo et al. ehdotettu ryhmä kasvaimia kolmeen luokkaan: CCS1 (CRC mikrosatelliitti epävakautta, MSI), CCS2 (syöpä kromosomipoikkeavuus, CIN) ja CCS3 (Uusi alatyyppi) . Sadanandam ym. tunnistettu viisi molekyylitason alatyyppiä, jotka perustuvat solun fenotyyppiin: Pikarinmuotoinen, Transitiovahvistava (TA), Enterosyytti, varren kaltainen ja tulehduksellinen . Marisa ym. kuvattu kuusi molekyylitason alatyyppiä (C1-C6), joilla on seuraavat pääpiirteet: C1 = Cin ja immuunireittien alasääntely, C2 = MSI, C3 = mutatoitunut KRAS, C4 = kantasolujen fenotyypin kaltainen, C5 = CIN ja WNT-reittien ylös säätely, ja C6 = CIN ja normaalin kaltainen geenin ekspressioprofiili . Lopuksi kansainvälinen yhteenliittymä esitti kuudesta aiemmin julkaistusta allekirjoituksesta luokituksen, jossa oli neljä konsensuksen alatyyppiä: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolic (CMS3) ja mesenkymal (CMS4) (tarkistettavaksi ). CRC-näytejakauma molekyylitason alatyypin mukaisesti esitetään lisätiedostossa 1: taulukossa S1.

Immunohistokemiallinen analyysi

näytteet koottiin kudosmikroluokkaan (TMA) käyttäen kolmea kudosydintä (joiden halkaisija on 0,6 mm) edellä kuvatulla tavalla . Lyhyesti TMA: n 3-µm: n osat de-parafinisoitiin ja uudelleenhydrisoitiin lajiteltuihin alkoholeihin. Lämmön indusoima antigeeninetsintä suoritettiin inkuboimalla TMA-osioita EDTA-puskurissa (pH 9) 98 °C: n lämpötilassa vesihauteessa 20 minuutin ajan. Endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden neutralisoinnin jälkeen TMA-osioita inkuboitiin polyklonaalisella anti-CLDN1-vasta-aineella (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) tai vasta-ainelaimennimella (Dako, Glostrup, Tanska) yksinään 60 minuutin ajan. Primaarinen vasta-aineiden sitoutuminen visualisoitiin Envision® – järjestelmän ja Dako Autostainer®: n avulla (Dako, Glostrup, Tanska). CLDN1-positiivisten solujen prosenttiosuus ja värjäytymisvoimakkuus (0, ei värjäystä; 1, kellertävä; 2, ruskea; ja 3, tummanruskea) arvioitiin kunkin yksittäisen TMA-pisteen osalta.

Western blot-analyysi

potilaiden Kasvainkudosnäytteet jauhettiin suoraan lysis-puskurissa (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7, 4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0, 5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM natriumortovanadaatti, yksi cocktail-proteaasinestäjätabletti 10 ml) käyttäen sekoitinmyllyä® mm 300 yksikköä (QIAGEN, Valencia, ca). Proteiinipitoisuus määritettiin Bradford-määrityksellä (Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Tämän jälkeen 50 µg kokonaisproteiinia irtosi 12%: lla SDS-sivusta ja siirtyi nitroselluloosakalvoille (Whatman® Protran®, huokoskoko 0,45 µm). Epäspesifiset sitoutumiskohdat estettiin rasvattomalla maidolla 5% (wt/vol) PBS: ssä ja 0, 1% (vol/vol) 20 (PBS-T) huoneenlämmössä 1 tunnin ajan, minkä jälkeen kalvoja inkuboitiin polyklonaalisella anti-CLDN1-vasta-aineella (JAY-8) 4 °C: ssa yön yli. Kalvot pestiin ja inkuboitiin sopivalla piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella 1 tunnin ajan. paljastus tehtiin kemiluminesenssijärjestelmällä (Amersham Biosciences); β-tubuliini-lauseketta käytettiin normalisointiin.

Subsellulaarinen proteiinin uutto

proteiinin uutto suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla . Kutakin näytettä varten 20 µm: n paksuiset osat leikattiin kryotomilla, sekoitettiin nestemäiseen typpeen ja jauhettiin varovasti mikro-survimella. Subsellulaarisessa proteiinin uuttamisessa käytettiin ProteoExtract Subsellulaarinen Proteome Extraction Kit-valmistetta valmistajan ohjeiden (Calbiochem) mukaisesti. Subsellulaariset fraktiot (10 µg/kukin) ladattiin 12%: n SDS-SIVUISIIN geeleihin. Immunoblottaus tehtiin edellä kuvatulla tavalla seuraavilla primaarisilla vasta-aineilla: anti-CLDN1 (JAY-8),- CD71 (Invitrogen),- Histoni H3 (Pierce) ja-β-tubuliini (Sigma T4026).

solulinjat

seuraavia ihmisen CRC-solulinjoja käytettiin: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (lahja C. Montagutilta, syöpätautien osasto, Hospital del Mar, Barcelona, Espanja), HCT116 (CCL-247) ja ls174t (ATCC cl-188). Cldn1-positiivisen SW480-solulinjan (SW480-CLDN1) saamiseksi SW480-solut siirrettiin vakaasti ihmisen CLDN1 cDNA-kloonilla (Invitrogen MGC collection) tai tyhjällä vektorilla (pcDNA) käyttäen jetprime™ – transfektioreagenssia (Polyplus-transfection Inc., Ranska). CLDN1-positiiviset kloonit valittiin kasvattamalla transfektoituja soluja, joissa oli 500 µg/ml genetsiiniä. CLDN1-äänenvaimennuksessa SW620 transdukoitiin shRNA: n sisältävällä pSIREN-vektorilla CLDN1: tä (SW620shCLDN1) tai luciferaasia (shLUC, negatiivinen kontrolli) vastaan. 24 tunnin kuluttua solut valittiin 1 µg/mL puromysiinillä ja vakaat kloonit yhdistettiin. Kaikki transfektiot tehtiin jetprime™ – transfektioreagenssilla.

anti-CLDN1 mAb 6 F6

vasta-ainetuotantoa varten 6-8-viikkoisille balb/c-naarashiirille (Harlan, Gannat, Ranska) annettiin vatsakalvon sisäinen (i.p.) injektio 4 miljoonaan hiiren nih-soluun, jotka transfektoitiin väliaikaisesti CLDN1 cDNA: lla (NIH-CLDN1-solut) joka toinen viikko (yhteensä viisi injektiota). Nih-CLDN1-solut sekoitettiin täydelliseen Freundin adjuvanttiin (Sigma) ensimmäistä injektiota varten ja epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin (Sigma) neljää muuta injektiota varten. Nih-CLDN1-solujen laskimonsisäinen tehosterokotus annettiin kolme kuukautta viidennen rokotuksen jälkeen. Kolme päivää myöhemmin immunisoitujen hiirten pernasolut fuusioituivat hiiren myeloomasolulinjaan P3-X63-Ag.8.653 tuottaa hiirihyppyjä. Uusien kloonien supernatantit seulottiin fluoresenssilla aktivoidulla solulajittelulla (FACS) käyttäen SW480-CLDN1-ja SW480-soluja (negatiivinen kontrolli). Seulontatulokset vahvistettiin suorittamalla ja täydentämällä seulontaa SW620-ja SW620-shCLDN1-soluilla. Anti-CLDN1 hybridoma 6 F6-klooni valittiin ja kloonattiin rajoittamalla laimennusta. Vasta-aineiden isotyypin määritys osoitti, että 6 F6 oli IgG3k.

kaikki eläinkokeet tehtiin Ranskan hallituksen koe-eläinkokeita koskevien ohjeiden (sopimus CEEA-LR-12052) mukaisesti.

Radioleimaus ja SPECT-CT-kuvantaminen

naaraat athymic nude-hiiret (6-8 viikon ikäiset) ostettiin Harlanista. 6 F6 mAb radioleimattiin 125I: llä (Perkin Elmer) ominaisaktiivisuudella 370 MBq/mg yksifotoniemissiotomografiassa (SPECT) käyttäen jodi-GEN: tä (Pierce Chemical Co.) menetelmä. 16 MBq/50 µg: n 125i-merkityn 6 F6: n ruiskutuksen jälkeen koko kehon yhden fotonin emissiotomografia/tietokonetomografia (SPECT/CT)-kuvat hankittiin 4-pään multiplexing multi-pinhole NanoSPECT-kameralla (Bioscan Inc., Washington, Yhdysvallat) eri aikoina (48, 72 ja 96 h). Samanaikaisesti hankittiin koko kehon mikro-CT-kuvia anatomisten tietojen ja SPECT-tietojen samanaikaista rekisteröintiä varten. Rekonstruoidut SPECT-ja CT-tiedot visualisoitiin ja rekisteröitiin Invivoscope®-ohjelmalla.

Klonogeeninen määritys

Kolorektaalisyöpäsolut kylvettiin 6-kuoppalevyyn (150, 250 tai 400 solua/kuoppa) ja niiden annettiin kiinnittyä 37 °C: ssa yön yli. Sen jälkeen jokaiseen kuoppaan lisättiin 1 ml RPMI: tä joko 6 F6 mAb: n kanssa tai ilman (lopullinen pitoisuus: 100 µg/ml), ja soluja viljeltiin kuuden päivän ajan. Oltuaan vielä kuusi päivää väliaineessa ilman vasta-ainetta levyt luettiin Celigo™ – kuvantamissytometrillä ja “yhden pesäkkeen verifiointi” – sovelluksella. Celigo™ cytometer on penchtop in situ-soluanalyysijärjestelmä, joka tarjoaa kuvia kaivoista, joissa käytetään kirkasta kenttävalaistusta (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

kolmiulotteisten (3D) sferoidiviljelmien perustaminen

erittäin matalakiinnitteisiä, pyöreäpohjaisia 96-kuoppalevyjä (Corning Costar) käytettiin sferoidin muodostamiseen. SW480 -, SW480-CLDN1-tai SW620-kennoja kylvettiin tiheydellä 5 × 104. Solut kasaantuivat ja yhdistyivät 3D-spheroideiksi 24-72 tunnin kuluessa. Kuvat kaivoista otettiin faasikontrastimikroskoopilla käyttäen 5× – objektiivia tai otettiin Celigo™ – kuvantamissytometrillä käyttäen “Tumorosphere” – sovellusta. Solujen elinkyky arvioitiin CellTiter-Glo Luminescent Cell lively Assay-menetelmällä (Promega, Madison, WI, USA). Kun kuhunkin kaivoon oli lisätty 100 µl Solutiitteri-Glo-reagenssia 10 minuutin ajan, luminesenssi mitattiin 1450 MicroBeta TriLux luminesenssi-mikrotiitterilukulaitteella (Perkin Elmer).

solusykli ja proliferaatioanalyysi spheroideista

Spheroidit valmistettiin pinnoittamalla 1000 DiFi-solua kuoppaa kohti erittäin alhaisen kiinnityksen 96-kuoppalevyillä ja kasvattamalla niitä 5 päivän ajan 100 µg/ml 6 F6 mAb: ta tai merkityksetöntä MAB: tä (retuksimabia). Solusyklianalyysiä varten solut pelletoitiin, trypsinoitiin, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 75−prosenttiseen etanoliin ja värjättiin 40 µg/ml propidiumjodidilla 100 µg ml-1 Rnaasin (Qiagen) läsnä ollessa. Solusyklin jakautuminen määritettiin Fc500 Beckman Coulterin Virtaussytometrillä FL-3-kanavan avulla. Solut aidattiin pistekaaviolla, joka näytti DNA-pulssipiikin vs DNA-pulssin alueen kaksoisolentojen poissulkemiseksi. Solusyklin jakaumat havainnollistettiin Flow Jo-analysointiohjelmistolla (Treestar, FLOWJO, Ashland, or, USA).

viljelmän 4. päivänä solujen proliferaatio mitattiin inkuboimalla soluja 5-etynyyli-2′ – deoksiuridiinilla (EdU) 24 tunnin ajan. EdU on sisällytetty DNA: han aktiivisen DNA-synteesin aikana. Sitten, kun solujen trypsiinointi ja kiinnitys/permeabilisaatio 75% etanoli/PBS, sisällytetty EdU merkittiin ja havaittiin Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen). Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 1 µg/ml: lla 4′,6-diamidino-2-fenyyli-indolia (DAPI) PBS/0, 1% Triton X100: ssa 37 °C: ssa 30 minuutin ajan. Celigo™ “Expression Analysis” (Target 1 + Mask) – sovellusta käytettiin fluoresoivan signaalin kvantifiointiin ja tietojen analysointiin. Solut tunnistettiin Dapi-ydintahran avulla ja DNA-synteesi määritettiin mittaamalla edu-inkorporaatio.

hiiren ksenografttimallit

1, 5 × 106 SW620 solua tai 3 × 106 DiFi-solua suspendoitiin viljelyalustassa ja pistettiin ihon alle (s.C.) harlanista peräisin olevien 6-8-viikkoisten athymisten naarashiirien oikeaan kylkeen. Kun kasvaimen tilavuus oli noin 100 mm3, hiiret satunnaistettiin eri ryhmiin ja hoidettiin 0, 9% NaCl: n tai 6F6 mAb: n injektiolla (15 mg/Kg / injektio) kahdesti viikossa kolmen peräkkäisen viikon ajan ensimmäisessä kokeessa ja kolmesti viikossa toisessa kokeessa. Kasvaimet mitattiin bi-weekly kanssa caliper ja tilavuudet lasketaan kaavalla: D1 x D2 x D3 / 2.

Intraspleeninen maksan kolonisaatiomalli

jokaisessa kokeessa 6-8 viikon ikäisten athymisten alastomien naarashiirien pernaan ruiskutettiin 2 miljoonaa lusiferaasia ilmentävää SW620-solua (SW620-LUC-soluja). Perna poistettiin 2 minuutin kuluttua soluiskusta. Päivänä 1 injektion jälkeen hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen 10 hiiren ryhmään, joita hoidettiin joko 15 mg/kg 6 F6 mAb: lla tai 0, 9% NaCl: llä IP-injektiolla kolmesti viikossa. Metastaattisen muodostumisen ja levittämisen arvioimiseksi lusiferaasiekspressiota seurattiin luminesenssikuvauksella lusiferiini-injektion (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) jälkeen kerran viikossa. Viikolla 5 leikkauksen jälkeen hiiret uhrattiin, maksat poistettiin, kuvattiin ja laskettiin makroskooppisesti näkyvät etäpesäkkeet maksan pinnalla.

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen STATA 13.0-ohjelmistoa (StataCorp). Geeniekspressio-tai immunohistokemiallisissa kokeissa ryhmien välisiä eroja analysoitiin Kruskall Wallis / Dunn-testillä. Korrelaatioita CLDN1-geenin ilmentymisen ja taudin etenemisvapaan elinajan (PFS) ja kokonaiselinajan (OS) välillä arvioitiin koko ryhmässä (n = 143 potilasta) ja kasvaimen molekyylitason alatyypin mukaan. Tätä varten 143 potilasta jaettiin kahteen ryhmään perustuen cldn1-geenin mediaaniekspressioon (9, 75). PFS-ja OS-arvoja verrattiin Kaplan-Meier-menetelmällä ja eloonjäämisjakaumien eroja arvioitiin log-rank-testillä.

paritetulla t-testillä verrattiin inkubaation vaikutusta 6 F6 mAb: hen in vitro-kokeissa.

in vivo-kokeissa käytettiin lineaarista sekalaista regressiomallia tuumorikasvun ja injektiota seuraavien päivien lukumäärän välisen suhteen määrittämiseksi. Mallin kiinteään osaan sisältyi siirteen jälkeisten päivien määrää ja eri hoitoryhmiä vastaavia muuttujia. Malliin oli rakennettu vuorovaikutustermejä; satunnaiset sieppaukset ja satunnaiset rinteet otettiin mukaan aikavaikutuksen huomioon ottamiseksi. Mallin kertoimet estimoitiin suurimmalla todennäköisyydellä. Elossaololuvut arvioitiin injektiopäivästä siihen päivään asti, jolloin kasvaimen tilavuus oli 1500 mm3 Kaplan–Meier-menetelmällä. Selviytymiskäyriä verrattiin log-rank-testin avulla. Maksan kolonisaatiokokeissa ryhmien välisiä eroja arvioitiin Mann-Whitneyn U-testillä. Kaikissa kokeissa eroja pidettiin merkittävinä, kun P < 0, 05.