Clostridium bolteaen ja Clostridium clostridioformen vertaileva genomiikka paljastaa lajispesifisiä genomisia ominaisuuksia ja lukuisia oletettuja antibioottiresistenssiä määrittäviä tekijöitä

genomien yleiset ominaisuudet paljastavat lajien sisäisiä ja lajien välisiä vaihteluita

yhteensä 1-21 kontigia olivat luotu kokoonpano lukee Illumina (134-185-kertainen kattavuus) kuuden kantoja C. bolteae (Taulukko 1). Yhteensä 10-48 kontigia (82-264-kertainen kattavuus) syntyi kuudesta C. clostridioforme-kannasta. Genomin kokonaiskoko vaihteli lajien ja kantojen välillä. C. bolteaen koko vaihteli 6159 kb kannan 90A7 osalta 6480 kb kannan 90b3 osalta, jossa on 5833 ja 6059 DNA-koodaussekvenssiä (CDSs) ja neljä 16S rRNA-geeniä. C. clostridioformen genomikoko oli pienempi, 5467 kb kannalla 90A3 – 5970 kb kannalla 90A6, jossa oli vastaavasti 5231-5916 CDSs ja neljä 16S rRNA-geeniä. 16S rRNA-sekvensseihin perustuva fylogeneettinen puu osoitti, että tutkitut C. bolteae ja C. clostridioforme olivat läheistä sukua C. hathewayi -, C. aldenense -, C. citroniae -, C. saccharolyticum-ja C. symbiosum-lajeille, jotka kuuluvat Firmicutesin Clostridium-klusteriin XIVa, kuten aiemmin on raportoitu (tietoja ei näy).

C. bolteae-ja C. clostridioforme-sukujen genomit ovat suuria genomeja, joissa geneettinen redundanssi on yleistä (tietoja ei ole esitetty). Redundantit geenit olivat mukana monenlaisissa aineenvaihduntareiteissä, kuten hiilen aineenvaihdunnassa, kuljetuksessa, raudan aineenvaihdunnassa ja aminohappojen biosynteesissä. Geenien väliset erot CDSs: ien määrässä heijastivat geneettisen redundanssin vaihtelua enemmän kuin tiettyjen toimintojen saamista tai menettämistä. Lisäksi genomeihin integroitui liikkuvia elementtejä eli transposoneja, Insertiosekvenssejä, plasmideja tai fageja (integraasi, kapsidiproteiini,…), jotka viittaavat lateraalisiin geeninsiirtoihin. Joillakin niistä oli mikrobilääkeresistenssigeenejä (KS.alla).

tutkiaksemme näiden kahden lajin pangenomia vertasimme 12 uudesta sekvensoidusta genomista saatuja 97 210 CDSs: ää viiden muun genomin (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149faa.1, ja C. clostridioforme WAL-7855). Kaikki CDSs: t ryhmiteltiin BlastClust-algoritmin avulla suurella tiukkuudella, yli 90% sekvenssin identiteetin cut-off ja 90% pituuden päällekkäisyys. Klustereita löytyi yhteensä 10 530. Lajeja oli yhteensä vain 2294 (21,78%).

käyttämällä vain äskettäin sekvensoituja genomeja arvioimme kuuden C. bolteae-ja kuuden C. clostridioforme-suvun (laji) perimän ja (kanta-spesifiset) geenit (Taulukko 1). Kaikkiaan 3714 geeniä muodosti C. bolteae-bakteerin perimän. Lajille spesifisten geenien määrä vaihteli 73: sta 846: een. C. clostridioforme-tutkimuksessa 3660 geeniä määritteli ydingenomin. Nämä kaksi lajia jakoivat yhteensä 2409 klusteria; 1305 geeniä oli spesifisiä C. bolteae-lajille ja 1251 C. clostridioforme-lajille.

C. bolteae 90A7 ja 90B8 oli suurin määrä ainutlaatuisia geenejä tämän lajin (735 ja 846, vastaavasti). C. clostridioforme 90A8, jossa oli 1006 (17 %) yksilöllistä geeniä, oli tässä tutkimuksessa eniten lajikohtaisia geenejä. Näihin kantoihin yhdistyi suuri määrä liikkuvia alkuaineita. Jotkin ainutlaatuiset CDSs: t merkittiin siirtäjiksi tai säätelijöiksi. Harva niistä liittyi puolustusmekanismeihin (mikrobilääkeresistenssigeenit..) tai aineenvaihduntareittejä. Useimmat niistä, usein ympäröi CDSs alkaen phages tai transposons, olivat tuntemattomia toimintoja (tietoja ei näytetä).

lajien väliset toiminnalliset erot perusgenomeissa

tutkimuksemme haasteena oli saada luotettavaa tietoa perimän luonnoksista. Siksi keskityimme analyysiimme ytimen genomeihin. CDSs-järjestelmän luokittelu Ortologisten ryhmien klustereiden (Clusters of Orthologous Groups, COGs) mukaan antoi yleiskuvan näiden kahden lajin osoittamista funktioista. C. bolteaen ja C. clostridioforme rikastui (yli 7% COG matched-kokonaismäärästä) COG-kategorioissa K, E, G ja R suhteessa transkriptioon (309 ja 290 CDSs), aminohappojen kuljetukseen ja metaboliaan (335 ja 276 CDSs), hiilihydraattien kuljetukseen ja metaboliaan (431 ja 425 CDSs) ja yleiseen toiminnan ennustamiseen (366 ja 331cdss) (Taulukko 2).

kun taas C. bolteae ja C. clostridioforme ovat fenotyyppisesti sukua keskenään, COG-merkintää muuttamalla saatu funktiomalli poikkesi näiden kahden lajin välillä (Taulukko 2). 30 muuta nukleotidien kuljetus-ja metabolialuokkaa (F), 97 aminohappojen kuljetus-ja metabolialuokkia (E) ja 79 Signaalinsiirtomekanismeja koodaavaa CDSs-luokkaa (T) olivat spesifisiä C. bolteae-alalle. Soluseinän/kalvon/kuoren biogeneesin (M) 40 CDSs-koodausta, replikaatio -, rekombinaatio-ja korjausluokan (L) 50 CDSs-koodausta ja lipidien kuljetus-ja metabolialuokan (I) 18 CDSs-koodausta olivat spesifisiä C: lle. clostridioforme. Erot C. clostridioforme-ja C. bolteae-lajien metaboliareittien välillä näyttävät riittävän suurilta tukemaan lajin rajaamista.

hiilihydraattiradoista C. bolteae ja C. clostridioforme sisälsivät erilaisia laktoosin assimilaatiojärjestelmiä, jotka eroavat toisistaan fosforylaatiotilansa, välituotteidensa ja bioenergiansa suhteen (Lisätiedosto 1: taulukko S1). Molemmilta lajeilta löydettiin β-galaktosidaasia koodaavia geenejä, jotka hydrolysoivat laktoosia tuottavaa glukoosia ja galaktoosia. Vaihtoehtoinen laktoosikataboliareitti, laktoosi / sellobioosista riippuvainen fosfotransferaasijärjestelmä (lac / cell-PTS) löydettiin lähes kaikista C. bolteae-bakteerin genomeista. Lac / cell-PTS operon, joka on aiemmin kuvattu C. acetobutylicum-asiakirjassa , koostuu 6-fosfo-β-galaktosidaasin, fosfoglyseraattimutaasin ja jäkäläoperonin transcriptionaalisen antiterminaattorin geeneistä sekä kahdesta kopiosta laktoosi – /sellobioosiperheen IIC, IIB ja IIA-komponenttien geeneistä. Tällaisessa systeemissä laktoosi fosforyloidaan C-6-hiilellä ja sisäistetty laktoosi 6-fosfaatti hajotetaan galaktoosi-6-fosfaatiksi ja glukoosiksi 6-fosfo-β-galaktosidaasilla. Lisäksi 6-fosfo-β-galaktosidaasin geeni ja laktoosi – /sellobioosiryhmän komponenttien geenit puuttuivat C. bolteae 90A7: stä. On todennäköistä, että tämä sellobioosin tai laktoosin indusoima ja useiden repressorien säätelemä järjestelmä (kuvattu muissa Grampositiivisissa bakteereissa ) selittää C. bolteaen laktoosinegatiivisen fenotyypin . Käyttämällä meidän merkintäjärjestelmä, havaitsimme galaktoosi operoni repressori (GalR) keskuudessa lacI-perheen sääntelyviranomaisten, C. clostridioforme (kaikki, paitsi 90A8), mutta ei C. bolteae. Laboratoriokokeita tarvitaan sen määrittämiseksi, miten kahden lajin transkriptiotekijät välittävät mieltymyksiä tiettyjen hiilihydraattien hyödyntämisessä muihin nähden.

muita näiden kahden lajin välisiä erottavia piirteitä olivat Sekundaarimetaboliittien biosynteesiä ja kuljetusta ja kataboliaa koodaavat CDSs: t, joita havaittiin vain C. bolteae-lajilla (Taulukko 2).

mielenkiintoista on, että solujen motiliteetti-ja eritysluokan (N) geenien (34 ja 18 CDSs) määrä oli erilainen näiden kahden lajin välillä. Niistä löysimme CDSs koodaus flagella motiliteettiin tunnustettu olennaisiksi virulenssitekijöiksi useimpien liikkuvien patogeenien. Kaiken kaikkiaan kaksikymmentäneljä geeniä (46 klusteria + 3 orvoa) edusti C. bolteaen genomeissa olevaa flagellaarioperonia. Niistä flagelliinin (fliC) ja flagellaarilakin (fliD) geenit, jotka ovat yksi bakteerien monista solupinnan adhesiineista, paljastivat klusterispesifisyyden ja mikroevoluution. Flidiä koodaavia geenejä edusti yksi klusteri ja kaksi muuta geeniä C. bolteae 90A7: ssä ja 90B8: ssa. FliC sekvenssit C. bolteae 90A9, 90B3 ja 90b8 muodostivat yhden klusterin, ne 90a5 ja 90B7 ryhmittyivät toiseen ryhmään, ja sekvenssit C. bolteae 90A7 jäi orvoiksi (ainutlaatuiset geenit) jälkeen klusteroinnin (Kuva. 1). Ne olivat läheistä sukua C. citroniae-ja C. hathewayi-lajien flagelliinisekvensseille, muille Clostridium spp. xiva-ryhmään, eristetty satunnaisesti ihmisten infektioista. Lisäksi C. bolteae 90A9 ja 90b3 jakoivat synthenyssä toisen operonin, jossa oli vain 19 geeniä, mukaan lukien flagelliinigeeni (flaA), joka on läheistä sukua C. clostridioforme-geeneille (63% identiteetti). TLR5-merkinannolle ja flagelliinipolymeroinnille kriittisten säilyneiden jäämien L87, Q88, R89 ja Q96 perusteella näillä proteiineilla ennustettiin olevan tulehdusta edistäviä ominaisuuksia . C. clostridioformessa kaksikymmentä geeniä (57 muuta klusteria), jotka olivat järjestäytyneet yhteen operoniin, koodasivat flagellar-laitetta. FlaA-sekvenssejä C: ltä. clostridioforme kuului fylogeneettiseen ryhmään, joka oli läheistä sukua pötsistä eristettyjen Eubacterium cellulosovens-bakteerin flagelliinisekvensseille. Kaiken kaikkiaan flagelliinin geenit ja flagellaan liittyvä lokusorganisaatio olivat erilaisia eri lajien välillä (Lisätiedosto 2: taulukko S2 ja Lisätiedosto 3: taulukko S3), mikä viittaa siihen, että liikkuvuus, kemotaksis ja mahdolliset yhteisvaikutukset paksusuolen limakalvon kanssa ovat lajikohtaisia .

Etäisyyspohjainen flagelliinigeenien fylogeneettinen puu. Arvot solmukohdissa vastasivat bootstrap-prosenttilukuja, jotka saatiin Fylogeneettisistä puista clustalw: n, Tcoffee: n tai Promals: n monijaksoisten linjausten perusteella. Geeninimet ja Orpo-tai klusterinumerot merkittiin

lajien butyraattisynteesin reittien erot

kokonaisten genomisekvenssien Vertailu paljasti, että butyraattisynteesin väyliä, joilla on keskeinen merkitys ihmisen paksusuolen terveydelle, oli C. bolteae-ja C. clostridioforme-bakteereissa.

nämä kaksi lajia olivat butyraatin tuottajia erilaisin ja toisiaan täydentävin tavoin (Kuva. 2, Lisätiedosto 4: taulukko S4). Kaikilla C. clostridioformella, lukuun ottamatta 90A8: aa, oli lokus, joka koodasi asetyyli-CoA-reitin (asetyyli-CoA: sta butyryyli-CoA: han), mukaan lukien beetahydroksyylibutyryylidehydrogenaasin (hbd), tiolaasin (thl), krotonaasin (cro), butyryyli-CoA-dehydrogenaasin (bcd) ja kahden elektroninsiirtoproteiinin (ETF-alfa, ETF-beeta) geenit (Lisätiedosto 4: taulukko S4). Ainoastaan C. bolteae 90A8 ja C. clostridioforme 2149faa.1 sisälsi toisen oletuksen bcd (74.9% identiteetti) niiden genomeissa (tietoja ei näy). Lokuksen koostumus ja asetelma olivat samanlaiset kuin Faecalibacterium prausnitzii: ssa, joka on ihmisen paksusuolen merkittävä butyraattituottaja . Asetyyli-CoA-reittiä ei löydetty C. bolteaesta. Molemmat lajit jakoivat Glutaraattireitistä peräisin olevan kahden hydroksiglutaryyli-CoA-dehydrogenaasin (HgCoAd) ja glutakonyyli-CoA-dekarboksylaasin (Gcd) geenit, jotka voivat johtaa krotonyyli-CoA: han ja butyryyli-CoA: han bcd-geenien kautta .

C. clostridioforme-ja C. bolteae-sukujen genomeissa mahdollisesti esiintyvät butyraattisynteesin eri reitit. Kiinteissä viivoissa: esiintyy C. bolteae-ja C. clostridioforme-lajeissa; lihavoiduissa katkoviivaissa : esiintyy vain C. clostridioforme-lajeissa ; hienoissa katkoviivaissa : esiintyy vain C. bolteae-lajeissa 90A5 ja 90B7 (lisätietoja Lisätiedostossa 4: taulukko S4). Geenit (proteiinin nimet) näkyvät. Ato, asetyyli-CoA-asetyylitransferaasi; BCD, butyryyli-CoA-desvetyaasi; Buk, butyraattikinaasi; But, butyraatti-asetoasetaatti-CoA-transferaasi; Cro, krotonaasi ; Etf, elektroninsiirtoproteiini; Gcd, glutakonyyli-CoA-dekarboksylaasi ; HBD, Asetoasetyyli-CoA-reduktaasi ; 4Hbt, 4-hydroksibutyraatti-CoA-transferaasi; HgCoAd, 3-hydroksibutyryyli-CoA-dehydrogenaasi; Ptb, fosfaattibutyryylitranferaasi; Thl, tiolaasi

lopullinen muuntaminen butyryyli-CoA: sta butyraatiksi voidaan suorittaa butyraattikinaasilla (Buk) ja fosfotransbutyrylaasilla (ptb), joita esiintyy molemmissa lajeissa (Lisätiedosto 4: taulukko S4). Buk-sekvenssien ryhmä C. clostridioforme haarautui Buk-sekvenssin läheisyyteen C. sitroniae fylogeneettisessä puussa (Lisätiedosto 5: Kuva S1). C. bolteae-heimon Buk-sekvenssit muodostivat erillisiä monofyleettisiä ryhmiä ja fylogeneettisiin puihin jakautuneita sekvenssejä, mikä viittaa polymorfismiin ja/tai entsyymin funktionaalisiin vaihteluihin tällä lajilla. Muut lysiinireitin transferaasien geenit (ato—alfa ja beeta—alayksikkö ; but-asetaatti-CoA-transferaasi), jotka on havaittu lähellä butyraattilokusta kuudessa C. clostridioforme-genomissa, voivat olla mukana lopullisina entsyymeinä. 4-aminobutyraattireitin (4hbt) geenit voivat olla toinen vaihtoehto C: n terminaalivaiheelle. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 ja BAA613 .

asetyyli-CoA-reitin butyryyli-CoA:asetaatti-CoA-transferaasia (but), joka on Clostridium Xivan butyraattituotannon viimeinen vaihe, ei löytynyt yleisistä ydinfenomeista eikä tutkittujen C. bolteae-lajien genomeista . Ihmisen suolistossa aiemmat tutkimukset terveiden yksilöiden paksusuolen isolaateista ovat osoittaneet, että reitti on kuitenkin vallitseva . Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan arvioida glutaraattireitin kautta tapahtuvan butyraattituotannon vaikutusta paksusuolen solujen terveyteen, erityisesti autismissa, jossa C. bolteae on ylenpalttinen .

antibioottiresistenssiä määrittävien tekijöiden tunnistaminen

Lääkeresistenssigeenit, joita ei ollut tunnistettu automatisoidulla merkinnällä, tunnistettiin ardb: n homologisella sekvenssitutkimuksella. Resistenssigeenit ennustettiin arvolla, joka oli enintään 40% identiteetistä (50% positiivisista substituutioista) ja 70% pituudesta, joka ylitti yleensä suositellun cut-off-arvon (KS.taulukko 3). Tämän jälkeen verrattiin kuuden C. bolteae-ja kuuden C. clostridioforme-bakteerin mikrobiresistenssin lokuksen geenisisältöä ja geneettistä organisaatiota aiempiin C: stä saatuihin tietoihin. clostridioforme CM201.1 laboratoriossamme.

koska sekvenssipohjaisissa ennusteissa voitaisiin mahdollisesti tunnistaa tekijöitä, jotka eivät johda mikrobilääkeresistenssiin, tehtiin herkkyystestejä, jotta saatiin tietoa bakteerien ennustetusta vasteesta antibiooteille. Tässä tutkimuksessa mukana olleet kannat osoittivat resistenssimalleja, kuten ampisilliinia, makrolideja, linkomysiiniä ja kinoloneja, jotka ovat nykyään yleisiä anaerobeilla (Taulukko 4). Antibioottiresistenssiä määrittävien tekijöiden tunnistamiseksi tarkasteltiin sekä genomitietoja (CDSs ja selitykset) että fenotyyppisiä herkkyystestejä (taulukot 3 ja 4). Tiettyjen geenien kloonausta varten tehtiin myös alustavia määrityksiä, jotta voitiin tarkistaa niiden kyky aiheuttaa antibioottiresistenssiä (KS.jäljempänä).

antibioottiresistenssigeenit, joita käytetään anaerobisten infektioiden hoidossa

tunnistettiin yhteensä 76 klusteria ja 21 mikrobilääkeresistenssiin mahdollisesti liittyvää kannaspesifistä geeniä (Taulukko 3). Se sisältyy 42-50 CDSs C. bolteae ja 48-58 CDSs C. clostridioforme. 27-42 CDSs per genomi liittyi lääkeaineresistenssimekanismeihin beetalaktaameille, glykopeptideille, makrolideille, linkosamideille ja metronidatsolille.

seitsemän klusteria, jotka osallistuvat beetalaktaamiresistenssiin, ovat yhteisiä tai osa näiden kahden lajin perimää (Kuva. 3). Kahdestatoista genomista tunnistettiin kolmenlaisia beetalaktamaaseja, kuten A-luokan beetalaktamaasi, C-luokan beetalaktamaasi, D-luokan beetalaktamaasi ja useita metallo-entsyymejä. Kaikilla tutkituilla kannoilla, jotka valittiin niiden ampisilliiniresistenssin vuoksi, oli sama geeni blaCLO1, joka löydettiin aiemmin C. clostridioforme CM201. 1: stä (julkaisematon), mutta CM201.1: ssä havaitun integratiivisen konjugatiivisen elementin (ICE) rakennetta ei löytynyt sekvensoiduista uusista genomeista. Geeni blaCLO1 antaa E. coli-bakteerissa resistenssin aminopenisilliineille ja karboksipenisilliineille, ja klavulanaatti ja sulbaktaami estävät sen toimintaa. C. bolteae-lajien 90a9, 90B3 ja 90a8 beetalaktamaaseissa havaittiin yhdeksän aminohappomuutosta. Tätä läheistä sukua olevaa beetalaktamaasia tukivat insertiosekvenssit (IS66) ja luokan D beetalaktamaasin (cog 2602) oletettu geeni, joka on kuvattu myös Clostridium sp M62/1: ssä ihmisen suoliston mikrobistosta (HMP project). C-luokan beetalaktamaasien geenejä, joita on aiemmin löydetty enterobakteerien kromosomeista (COG2680), oli myös C-ryhmässä. bolteae ja C. clostridioforme.

antibioottiresistenssigeenien jakautuminen C. bolteaen ja C. clostridioforme ytimen kesken ja sisällä. Homologeina pidettiin geenejä, joiden pituus oli vähintään 90% ja samankaltaisuus 90%. Resistenssigeenit ennustettiin arvolla, joka oli jopa 40% identiteetistä (50% positiivisista substituutioista), 70% pituudesta homologisella sekvenssitutkimuksella ARDB: llä. Kaikille C. clostridioforme ja joillekin C. bolteae 23S rRNA metyylitransferaasi Cfr-kaltainen

suuri määrä ennustettuja geenejä (32 CDSs) osallistui resistenssiin glykopeptideille (Lisätiedosto 6: Kuva S2). C. clostridioforme 90A8 oli yksittäinen kanta, jolla oli kaikki glykopeptidiresistenssiin tarvittavat geenit fenotyypin (MIC > 256 mg/l) mukaisesti. Vankomysiiniresistenssi tässä kannassa johtui Vanb-tyyppisestä operonista, jota kantoi tn1549: n kaltainen alkuaine. Valitettavasti kymmenen nukleotidin poisto tn1549: n relaxaasigeenin sisällä johtaa 90a8: n kyvyttömyyteen siirtää vankomysiiniresistenssiä in vitro . C. clostridioformen muut genomit sisälsivät osan VanD-tyypin vankomysiiniresistenssioperonista, mutta D-Ala-Lac-ligaasi-vanD-geeniä häiritsi stop-kodoni, joka johti typistettyyn proteiiniin (Lisätiedosto 6: Kuva S2). Lisäksi puuttuivat vanH ja vanY, jotka koodaavat d-laktaattidehydrogenaasia ja DD-karboksipeptidaasia. Samoin C. bolteaessa oli neljä CDSs: ää, vanrg vanUG vanG vanygin homolog, jotka muodostivat seriinirasemaasigeenin puuttumisen vuoksi epätäydellisen ja toimimattoman operonin. C. bolteaen ja C. clostridioformen genomeissa on runsaasti Glykopeptidiresistenssiä koodaavia CDSs: iä (mukaan lukien vand tai vanG, joiden tiedetään olevan kromosomaalisia ja jotka eivät ole siirrettävissä), mikä viittaa siihen, että ne ovat osa esi-isien kokonaisia operoneja, jotka ovat kehittyneet antibioottiselektiivisen paineen puuttuessa . Epätäydellisen van operonin esiintyminen on kiehtovaa, mutta samanlaisia havaintoja on myös muilla mikrobiomeissa elävillä anaerobeilla, kuten Clostridium difficile 630: llä tai Ruminococcus spp: llä., on raportoitu .

Linkosamideille resistenssin antavan adenylyylitransferaasigeenin homologeja oli molempien lajien perimässä (Kuva. 3). C. clostridioforme-ja C. bolteae-geenien lnua-geenit olivat 70-72% samaistuneet C. hathewayi-ja C. citroniae-geenien ortologeihin. C. clostridioforme 90B1: ssä ja 90a6: ssa oli ylimääräinen LNU-geeni (68% identiteetti lnua90a5: n kanssa), jossa ei ollut jälkiä liikkuvista alkuaineista. Linkomysiiniresistenssi on yleistä C. bolteae-ja C. clostridioforme-bakteereilla, ja se liittyy usein resistenssiin klindamysiinille. Kahden lajin lnua-proteiinit osoittivat 51-54% identiteetistä Lnua: n kanssa Stafylokokeista, mikä viittaa yhteiseen toiminnallisuuteen, mutta LNU-geenien roolia on vaikea määrittää muiden oletusmekanismien vuoksi . Samoin kaikki kannat olivat resistenttejä erytromysiinille, kun taas kaksi geeniä homolog erytromysiinin ribosomimetylaasigeenille, ermB, ennustettiin vain C. clostridioforme 90A4: n ja 90A8: n genomeissa. Tutkittuihin genomeihin sisältyvien monilääkkeisten efflux-pumppujen ja makrolidi-ja erilaisten makrolidi-Linkosamidi-Streptogramiini B—spesifisten efflux-järjestelmien, kuten MacB: n, MefA: n, VgaA: n, MsrA/MsrB: n ja CcmA: n (taulukko 3, Lisätiedosto 7: Kuva S3) yliekspressio voi johtaa makrolidi-ja linkosamidiresistenssiin . Lisäksi kunkin lajin perimästä löytyi kaksi rykelmää Ksenobioottisia asetyylitransferaaseja koodaavia CDSs-koodeja, jotka liittyvät VatB: hen (48% identiteetti) (Fig. 3). VatB inaktivoi virginiamysiinin, mutta tässä resistenssiä ei havaittu mikrobilääkeresistenssitesteillä (Taulukko 4).

molempien lajien ydindenomeissa havaittiin joukko CDSs-homologeja metronidatsoliresistenssigeeneihin (nim), ja metronidatsoli oli hyvin aktiivinen tutkituilla lajeilla . Bacteroides fragilis-bakteerissa on osoitettu, että nim-geenien lisääntynyt ilmentyminen is-alkuaineista alavirtaan johtaessa johtaa metronidatsoliresistenssiin . Koska nim-geenit eivät ole suoraan ylävirtaan, metronidatsoliresistenssi C. bolteae-ja C. clostridioforme-bakteereille ei ole vielä selvillä.

odottamaton havainto uusista resistenssigeeneistä

muiden lääkeaineresistenssien osalta genomitiedot paljastivat kloramfenikoli-ja rifampiiniresistenssimekanismeihin liittyviä geenejä (Taulukko 3). Useimmissa genomeissa löysimme CDSs: n koodaamassa A-ryhmän kloramfenikoliasetyylitransferaasia, joka voi inaktivoida kloramfenikolia. Kuitenkin vain C. bolteae 90B3 ja 90B8 olivat resistenttejä kloramfenikolille. Kannan 90b8 genomi sisälsi toisen kopion kissan geenistä, jota kantoi tn4451: n kaltainen transposoni (96%: n identiteetti tn4451: llä ja 90%: n identiteetti tn4453: lla). 90b3: n genomissa oli CDS-homolog, joka koodasi 23S rRNA-metyylitransferaasia, joka levisi suurelta osin Grampositiivisissa bakteereissa. Odotetusti kanta 90B3 oli resistentti myös florfenikolille, tiamuliinille ja linetsolidille (MIC = 16 mg/l). Muita 23s rRNA-metyylitransferaasin (Cfr-like ) CDSs-yhdisteitä havaittiin ympäristössä, jossa oli runsaasti transposoituvia alkuaineita (Tn 6103-6110-CTn4) C. clostridioforme-ja C. bolteae-sukujen 90a5 ja 90b7 genomeissa, mutta rRNA-metylaatio ei näyttänyt vaikuttavan herkkyyteen kloramfenikolille (Fig. 3).

genomitietojen analyysi mahdollisti CDSs-homologioiden tunnistamisen Rifampin-ADP-ribosyylitransferaasigeeneille (arr) C. bolteae-geeneissä, mutta ei C. clostridioforme-geeneissä. Arr-geenien ympäriltä ei löytynyt liikkuvia alkuaineita tai jälkiä liikkuvista alkuaineista, jotka viittaisivat niiden olevan tämän lajin kotoperäisiä. Tämä uusi Arr sekvenssit haarautunut läheisyydessä arr proteiineja C. saccharoperbutylacetonicum ja jotkut syanobakteerit fylogenetic puu (Lisätiedosto 8: Kuva S4). Ne erosivat enterobakteerien Arr-2-proteiineista ja Mycobacteriumin ja Streptomyces spp: n Arr-proteiineista.. Kaikki kannat, lukuun ottamatta 90A7: ää, olivat herkkiä rifampiinille. Koska rpoB: ssä ei ole mutaatioita (tiedetään aiheuttavan rifampiiniresistenssiä), C-resistenssi. bolteae 90A7 (MIC: 32 mg/l) johtui todennäköisesti aar Cbol90A7: n positiivisesta mutaatiovalikoimasta. Muiden C. bolteae-bakteerin rifampiiniherkkyys johtui todennäköisesti siitä, että arr: stä virtaussuuntaan ei ollut promoottoreita (kuten silico-analyysi ennusti) tai että arr: n sisällä ei ollut nukleotidisubstituutioita, jotka johtaisivat aminohappojen korvautumiseen ja funktionaaliseen inaktivaatioon (tietoja ei ole osoitettu).

kaikkien kantojen resistenssistä moksifloksasiinia ja siprofloksasiinia vastaan kaikissa C. bolteae-kannoissa havaittiin useita substituutioita gyrb: n “kinoloniresistenssiä määrittävällä alueella” (QRDR). Emme löytäneet mitään substituutioita tällä alueella gyrA, eikä kuvattu proteiini kinoloniresistentti epidemia kanta, C. difficile 027 . Siksi gyrb oli todennäköisesti ensisijainen kohde kinoloniresistenssin saavuttamisessa näillä kahdella lajilla. Lisäksi kaikissa kannoissa oli useita CDSs-koodeja AcrB-sisäkalvon kuljettajalle. Nämä kuljettajaproteiinit ovat osa resistenssi-nodulaatiojakauma-monilääkepumppua, jonka tiedetään lisäävän kinolonien ulosvirtausta joissakin Gramnegatiivisissa bakteereissa . Lisätutkimuksia tarvitaan niiden vaikutuksen määrittämiseksi Clostridium spp: n herkkyyden menetyksessä. fluorokinoloneille.

kaiken kaikkiaan C. bolteae-ja C. clostridioforme-bakteerien antibioottiresistenssiprofiilit voivat johtua useista eri mekanismeista.

vähemmän aktiiviset tai inaktiiviset antibioottiresistenssigeenit Clostridium spp

C. bolteaen ja C.clostridioforme kantoi yhtä tai kahta kopiota undekaprenyylipyrofosfaattifosfataasigeeni bacA: ta ja 2-5 kopiota effluksipumppugeenejä, bcrA: ta, jotka osallistuvat basitrasiiniresistenssiin, koska niiden herkkyys oli alhainen . Löysimme myös yhden klusterin CDSs homolog dihydrofolaattireduktaasigeenin, dfrA20: n (41% identiteetti / 97% pituus) Pasteurella multocida-bakteeria molempien lajien perimästä, mikä voisi selittää trimetopriimin huonon aktiivisuuden Clostridium spp-lajeissamme. . Lisäksi C. clostridioforme 90A6 omisti Enterococcus faeciumilta DFRA: n kanssa identtisen CD-levyn. Tämä geeni, joka on havaittu ympäristössä, jossa on runsaasti liikkuvia elementtejä, on yhdenmukainen uuden esimerkin kanssa horisontaalisesta siirrosta Enterococcus spp: n välillä. ja Clostridiales.

mielenkiintoista on, että C. bolteaen tai C. clostridioformen genomit sisälsivät erilaisia resistenssigeenejä antibiooteille, jotka ovat luonnostaan inaktiivisia näillä lajeilla. Viisi CDSs: ää olivat homologeja geeneistä, jotka fosforyloivat, asetyloivat tai adenylaattiaminoglykosideja. Neljä näistä oletetuista resistenssigeeneistä havaittiin liikkuvien alkuaineiden ympäristössä. Kolme geeniä, aadE, sat4 ja aph(3′)-III, jotka aiheuttavat resistenssin streptotrisiinille, streptomysiinille ja kanamysiinille, havaittiin osaksi transposonia, joka on rajattu kahdella IS1182 kopiolla C. clostridioforme 90A3 (kaksi kopiota), 90a6 ja 90b1. Havaittu aph(3′)-III oli identtinen aph(3′) – III: n kanssa, joka on osa E. faeciumin monilääkeresistenttiä pf856-plasmidia ja joka liittyy myös Staphylococcus aureus HT20040085: n SSCmec-alkuaineen sisäiseen domeeniin (99% identiteetistä). Samoin aminoglykosidi-6-adenylyylitransferaasigeeni ant (6′) – Ia, joka aiheuttaa resistenssin streptomysiinille, oli C: n yhteinen. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 kappaletta), 90A4, 90A6 (2 kappaletta) ja C. bolteae 90A7. Adenylyylitransferaasigeeni aad (9′) – b, joka välittää resistenssiä streptomysiinille/spektinomysiinille, löydettiin C. bolteae 90B3: sta. C. clostridioforme 90B1: n genomissa oli myös kaksi kopiota asetyylitransferaasia aac(6′)-Im. AAC(6′)-Im: n homologeja, jotka aiheuttavat resistenssin tobramysiinille ja amikasiiniresistenssille, havaittiin myös E. coli-bakteereissa (96% identiteetistä), Coprococcus sp-bakteereissa, C. difficile-bakteereissa ja Enterococcus faecium-bakteereissa (tietoja ei näy). Lisäksi kaikista kannoista havaittiin kolmea CDSs: ää, jotka koodaavat aminoglykosidikinaasia (APH), jonka tiedetään jakautuvan laajalti grampositiivisiin bakteereihin .

lukuisia tetrasykliiniresistenssigeenejä havaittiin myös C. bolteae-ja C. clostridioforme-bakteereissa. Niihin kuuluvat sekä efflux-geenit, kuten tet40, että ribosomisuojauksen taustatekijät, kuten tetO, tetW ja tet32, joiden on aiemmin raportoitu kiertävän suoliston mikrobistossa kaukaista sukua olevien bakteerien keskuudessa .