Clostridium chauvoei-bakteerin osoittaminen ja tunnistaminen PCR: llä kliinisistä isolaateista, naudan ulosteista ja biokaasulaitoksen substraateista

näytteet epäillyistä mustalakkitapauksista

lihasnäytteistä epäillyistä mustalakkitapauksista, tulokset FAA-levyillä olevasta viljelmästä, jota seuraa PCR pesäkkeestä materiaali oli sopusoinnussa tai suoritettu jopa paremmin kuin biokemiallinen tunnistusmenetelmä (taulukko 2). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia Uzal et al. . Tämä tutkimus osoitti, että DNA: n valmistaminen viljelystä ennen PCR: ää antoi paremmat tulokset kuin PCR, jota käytettiin suoraan biomassaan.

viljelmä, jota seuraa biokemialliset tunnistusmenetelmät, on monimutkainen näytteissä, joissa on runsaasti kontaminoivaa kasvistoa, koska tarvitaan puhdasta viljelyä ja herkkyys oli huomattavasti pienempi kuin viljelmillä ja PCR: llä. Kahdeksassa tapauksessa C. chauvoei-bakteeria ei voitu havaita viljelyn ja biokemiallisen tunnistuksen avulla, mutta organismi havaittiin PCR: llä (Taulukko 2). Blackleg-diagnoosin tekemiseksi lihaskudosta otetaan ruumiinavauksessa, koska C. chauvoei-bakteerin määrä on todennäköisesti suurempi lihaskudoksessa kuin veressä. Yksittäinen verinäyte oli otettu väärin, mutta kysymys oli mustalasta.

myös aiemmassa tutkimuksessa, jossa tutkittiin mustalepän puhkeamista, viljelystä ja PCR: n osoittamisesta saatiin paremmat tulokset kuin biokemiallisesta analyysistä . Yhdessä tapauksessa yhden lihaksen primaariviljelmä veriagarilevyllä oli C. septicumin peitossa, mutta se antoi PCR: ssä selkeät positiiviset tulokset C. chauvoeille.

useimmissa kliinisissä blackleg-tapauksissa C: n määrä. chauvoei infektoituneessa kudoksessa on korkea ja se voidaan helposti havaita PCR-menetelmällä riippumatta kontaminoivasta kasvistosta. Lisäksi PCR-menetelmä on paljon nopeampi kuin perinteinen biokemiallinen toteamismenetelmä, joka kestää vähintään viisi päivää, ja on tärkeää, että kannalla on puhdas viljelmä, mikä saattaa vaatia ylimääräistä aikaa viljelyn tekemiseen. Kasviston saastumisen välttämiseksi lihaskudoksen ei pitäisi olla liian pieni; noin 100-200 g riittäisi. Ilman puhdasta viljelyä kantoja ei voida käyttää myöhempiin tutkimuksiin tulevaisuudessa, mikä on haitta PCR-detektion käyttämisestä ainoana menetelmänä.

C. chauvoei-bakteerin kokeellisesti infektoimista naudoista tehtiin PCR-analyysit jauhelihaksesta ja muista elimistä, ja C. chauvoei-bakteeria havaittiin kaikissa testatuissa elimissä . Epäiltyjen mustalakkitapausten jauhelihapalat testattiin suoraan PCR: llä ja verrattiin viljelyyn. PCR-menetelmällä saatu toteaminen antoi paremmat tulokset kuin viljelmällä ja biokemiallisella tunnistuksella , mikä on ristiriidassa tämän tutkimuksen tulosten kanssa, jossa vain 12 prosenttia (3 kappaletta 24: stä) veri-tai lihaskappaleista ylitti PCR: n havaitsemiskynnyksen, kun taas 9 prosenttia lihamehunäytteistä ylitti havaitsemiskynnyksen (Taulukko 2). Inhiboivia aineita on todennäköisesti lihaskudoksissa. PCR-monistuksen entsymaattisen reaktion estäjiä on tunnistettu maksasta, pernasta ja munuaisista, ja samanlaisia inhibiittoreita saattaa esiintyä lihaskudoksessa. Tulokset steriileissä fysiologisissa suolaliuosnäytteissä maseroiduista lihaspaloista (26%) eivät vastanneet hyvin biokemiallisen testin tuloksia. Suora PCR lihaskudokseen tai muihin vastaaviin näytteisiin ei todennäköisesti sovellu korvaamaan viljelyvaiheita, joita seuraavat biokemialliset testit tai PCR.

pyyhkäisynäytteet

sen tutkimiseksi, onko tarpeen lähettää lihaskudosta C. chauvoei-bakteerin analyysiä varten vai riittääkö pyyhkäisynäytteiden käyttö näytteiden keräämiseen, simuloitiin postilaitos. Tutkituista 22 lihaskudoksesta 64% ylitti PCR: n havaitsemiskynnyksen. Postipalvelusimulaation jälkeen samoista näytteistä otetuista pyyhkäisynäytteistä 36-47 prosenttia ylitti havaitsemiskynnyksen (Taulukko 3). Olisi käytännöllisempää ottaa näytteitä pyyhkäisynäytteillä lihaskudosten sijaan, jos pyyhkäisynäytteet riittävät C. chauvoei-bakteerin analysointiin. Lihaskudoksista saatiin kuitenkin positiivisempia näytteitä kuin pyyhkäisynäytteistä, kun molemmat analysoitiin viljelmällä ja PCR: llä (Taulukko 3). C. chauvoei-bakteerin ilmaantuvuus positiivisista lihaskudostapauksista otetuissa pyyhkäisynäytteissä vaikutti satunnaiselta. Näytti kuitenkin siltä, että oli vain vähän tai ei lainkaan merkitystä, säilytettiinkö pyyhkäisynäytteitä 1, 3 vai 6 päivää.

biokaasulaitosten

Clostridium chauvoei-näytteet havaittiin 3 näytteessä 11: stä biokaasualustassa ennen pastörointia, mutta sitä ei voitu havaita pastöroinnin tai mädätyksen jälkeen (Taulukko 4). Tällaisissa näytteissä olevat bakteerit voivat olla peräisin lannasta tai teurastamon eläimistä saatavista sivutuotteista, koska näitä molempia lähteitä käytetään biokaasun tuotannossa. Yksikään tutkimuksessa otetuista tiloista ei lähetä lannaansa biokaasulaitoksiin maantieteellisen etäisyyden vuoksi, vaan eläimet lähetetään paikalliseen teurastamoon. Mustalakkitapauksia on raportoitu myös biokaasulaitoksen valuma-alueella.

biokaasun käsittelyn jälkeen mädätetyt jätteet käytetään lannoitteena. Itiöitä muodostava bakteeri voi selvitä biokaasulaitoksissa pastöroinnista ja mädätyksestä, ja biokaasulaitosten mädätetyt jäämät voivat siten pystyä levittämään mustalakkaa uusille alueille. Ei kuitenkaan C. chauvoei havaittiin jalostetussa tuotteessa, joten ehkä digestorin ympäristö ei sovellu C. chauvoei-bakteerille tai kasvisto digestorissa outgrows C. chauvoei-bakteerille. Clostridial-itiöt voivat säilyä pitkiä aikoja maaperässä, mikä on otettava huomioon C. chauvoei-bakteerin lisätutkimuksissa digesterissä.

näytteet tiloilta

huolimatta siitä, että kaikilla tutkituilla tiloilla oli raportoitu mustalakkiepäilyjä viime vuosina, kaikki uloste -, maa-ja säilörehunäytteet olivat C. chauvoei-bakteerin osalta negatiivisia. Tälle voi olla useita selityksiä. Aineksessa voi yhä olla itiöitä, mutta alle havaitsemistason. Lisäksi näytteissä voi olla PCR-estäjiä ja PCR-esto voi vaikeutua . Naudan ulosteissa on haihtuvia rasvahappoja (VFA) ja maaperänäytteissä saattaa olla jäämiä metallista, joiden molempien tiedetään häiritsevän PCR-reaktiota. PCR: ää edeltävä viljelyvaihe kuitenkin vähentää inhiboivien aineiden vaikutusta.

C. chauvoei on maaperän bakteeri joitakin vuodenaikojen vaihtelua voi esiintyä, esimerkiksi rankkasateet voivat edistää leviämistä itiöitä ja määrä itiöitä maaperässä voi olla helpommin saatavilla naudoille. Suurin osa näytteenotosta tehtiin alkusyksystä, jolloin sää oli aurinkoinen ja näin ollen itiöpitoisuuksien näytteissä arveltiin jäävän vähäisiksi. Näytteiden määrä on saattanut olla riittämätön ympäristön saastumisen havaitsemiseksi. Käytännön syistä hyvin suuria määriä ympäristönäytteitä saadaan kuitenkin harvoin pellolta.

maatiloilla epäiltyjä mustalehmätapauksia oli esiintynyt pääasiassa vasikoilla ja hiehoilla, mutta yhdellä tilalla ilmoitettiin tapauksesta aikuisella lehmällä. Seitsemällä A-K: n yhdestätoista tilasta oli rokotusrutiinit käytössä näytteenottohetkellä (Taulukko 1).

kaksi tilaa varastoi lantaa ennen levitystä ja muut eivät, mutta yksikään tiloista ei levittänyt lantaa laitumelle. Paikalliset eläinlääkärit ovat kertoman mukaan nähneet enemmän mustaleppätapauksia Öölannin saaren Pensaikkojen raivauksen jälkeen, erityisesti Alvaretilla (karu kalkkikivitasanko, joka on lähes 40 km pitkä ja 10 km leveä, ja jossa on erityinen kasvisto ohuen maaperän ja korkean pH: n mukaan). Alvaret on yleensä viereisten maatilojen käytössä laitumena. Näytteenottovuoden aikana ei ollut tehty juurikaan pensasraivauksia.

PCR

Kulttuuritoimenpiteet ovat kalliita ja aikaa vieviä, ja muiden C. chauvoei-bakteerin ulos kasvaneiden anaerobisten bakteerien aiheuttama kontaminaatio aiheuttaa usein ongelmia . PCR: ää käytettäessä sekä elinkelpoisten että elinkyvyttömien solujen DNA monistuu. Jos halutaan havaita vain elinkelpoisia soluja, voidaan käyttää rikastusvaihetta . Tässä tutkimuksessa FAA: n levyillä ennen PCR: ää ollutta viljelyä käytettiin elinkyvyttömien bakteerien ja väärien positiivisten PCR-reaktioiden havaitsemisen välttämiseksi. DNA: ta on helppo monistaa puhtaista viljelmistä, mutta ongelmia syntyy saastuneiden näytteiden, kuten biojätteestä otettujen näytteiden kanssa. DNA: n havaitsemista PCR: llä voivat haitata lukuisat aineet, kuten humushapot, VFA, rasvat ja proteiinit . PCR: ää edeltävää viljelyvaihetta käytettiin kuitenkin rikastusvaiheena ja siten vähentää inhiboivien aineiden vaikutusta. Parveilevan kasviston vuoksi FAA: n laatoista ei voitu puhdistaa mitään.

PCR-menetelmän Havaitsemiskynnys

toteamistaso oli 200 pmy/g. Tämä saattaa vaikuttaa heikolta toteamistasolta, mutta se voidaan selittää sillä, että näytteet, kuten lanta, maa-aines ja biokaasualusta, ovat voimakkaasti saastuneita ympäröivästä kasvistosta. Sasaki ilmoitti havaitsemistasoksi 10 pmy / g, ilmeisesti puhtaammista näytteistä. Kuitenkin, koska havaitsemistaso tutkimuksessamme oli 200 pmy / g ja koska tällaisten näytteiden odotettiin sisältävän pieniä määriä C. chauvoei-bakteeria. Näin ollen tässä tutkimuksessa käytetty menetelmä ei ole käytännössä sovellettavissa.

ympäristönäkökohdat

PCR – menetelmän havaitsemiskynnys esikasvatuksen jälkeen ei ole nykyisessä vaiheessa sopiva eläinten tartuntavapauden takaamiseksi tai laitumien tilan määrittämiseksi. Sen sijaan on käytettävä nykyisin sovellettavia suosituksia, koska menetelmää ei voida käyttää rokotusrutiinien pohjana. Alueilla, joilla mustaleppää esiintyy endeemisenä, suositellaan vuotuista rokotusta ennen laiduntamista kustannuksista ja tarvittavasta ajasta huolimatta.

tämä tutkimus antoi viitteitä siitä, että C. chauvoei ei läpäise biokaasuprosessia. C. chauvoei-bakteerin määrä biojätteessä laski ehkä mädättimessä alle menetelmän havaitsemiskynnyksen, joten pilkottujen jäämien leviämisriski on häviävän pieni. Tarvitaan lisää tutkimuksia clostridialin selviytymisestä biokaasuprosessin avulla, ennen kuin varmoja johtopäätöksiä voidaan tehdä. Mädätettyjen jäämien edut lannoitteena ovat kuitenkin ehkä suuremmat kuin mustalakan leviämisriski.