Gap junction protein Connexin-43 is a direct transkriptional regulator of n-cadherin in vivo

Embryo manipulation

Adult X. 1986 kuvattuna 45. X. laevisin alkiot saatiin ja vaiheistettiin aiemmin kuvatulla tavalla 46, 47. Hermoharjun kohdentamiseksi eläinten vatsakalvon blastomeereihin ruiskutettiin alkioita kahdeksansoluisessa vaiheessa yhdeltä puolelta kaikissa kokeissa, paitsi silloin, kun käytettiin alkion lysaatteja. Tällöin kaksisoluvaiheen alkioiden molemmille puolille ruiskutettiin alkioita. Alkion mikroinjektiot suoritettiin 48. Merkkiaineina käytettiin tarvittaessa fluoreseiinidekstraania (FDX; Invitrogen, D1821, 20 ng) tai rodamiinidekstraania (RDX; Invitrogen, D1824, 20 ng). Oligomorfolinos vastaan X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5 ‘-TTCCCTAAGGCACTCCACCCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAAATGGTTGTCGA-3′) ja BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′- AACGGACCGGGTTAAGGCTCCCT-3′) syntetisoitiin ja toimitti Gene Tools LLC. Käytettiin ekvimolaarisia konsentraatioita standardikontrollista morfolino (CTLMO: 3′-ATATTAACATTGACTCC-5’). Morfolinojen määrät vastaavat kahdeksansoluisen vaiheen alkioiden toiselle puolelle ruiskutettuja määriä, kun taas toista puolta käytettiin sisäisenä kontrollina. Kun alkioita käytettiin alkion lysaattien keräämiseen, ne ruiskutettiin kaksisoluisina molempina eläinperäisinä blastomeereina ja käytettiin kaksinkertaisia edellä mainituista annoksista. Testataksemme cx43mos: n tehokkuutta endogeeniseen cx43 mRNA: han teimme western blot-analyysin. Molemmat Cx43MOs alensivat tehokkaasti endogeenisen Cx43FL: n ja Cx43iso: n proteiinipitoisuuksia (Kuva. 3 A, b). Btf3mo-tehokkuuden vahvistamiseksi testasimme neuraaliharjasolujen immunostisoimalla btf3-proteiiniekspressiota, joka osoitti btf3: n vähentyneen btf3mo-soluissa verrattuna Ctlmo: Hon (täydentävä Kuva. 3 A).

in situ-hybridisaatio suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla 49, 50. Lyhyesti alkiot kiinnitettiin MEMPFA: han, minkä jälkeen ne hybridisoitiin yön yli digoksigeniini-merkittyjen koettimien kanssa, inkuboitiin AP-vasta-aineella ja AP-aktiivisuus kehitettiin käyttäen NBT/BCP-substraatteja. Digoksigeniinimerkittyjä RNA-luotaimia valmistettiin foxd348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) ja sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0, 8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml) ja twist (0, 7 µg/ml) arvioitiin neural crest-induktion, twistin (0.7 µg/ml) neural crest migrationille, n-cadherinille (1 µg/mL) ekspressiotasojen arvioimiseksi ja btf3 (0, 7 µg/mL) ekspressiokuviolle. Kokonais-mount immunostisointi suoritettiin edellä kuvatulla tavalla 55 käyttäen Cx43-vasta-ainetta (1:1000, Sigma, C6219). Alkiot kiinnitettiin lyhyesti MEPMFA: han ja inkuboitiin yön yli vasta-aineella kuvatussa laimennoksessa.

eläinten lakki-eksplantit leikattiin Xenopus blastulasista (vaihe 8) standarditekniikalla 48 ja 56,ja ne valmistettiin in situ-hybridisaatiota varten edellä kuvatulla tavalla. Eläinkokeissa 500 pg mRNA ruiskutettiin kaksisoluisen vaiheen alkioiden kahden blastomeerin eläinpuolelle. ISH-analyysi tehtiin 20-25 alkiolla tilaa kohti kutakin itsenäistä koetta varten.

Neural crest manipulation and imaging

Neural crest transplantations suoritettiin kuten aiemmin raportoitiin 57. Vaiheesta 18 otetut alkiot leikeltiin kulmaveitsillä-ja siirrettiin tunnistamattomiksi isäntäalkioiksi. In vitro-kokeissa kallon hermoharjaräjähdykset leikeltiin vaiheessa 18 standarditekniikalla 58, 59 ja pinnoitettiin fibronektiinillä (Sigma, F1141)päällystetyillä astioilla53. Yksittäissolumäärityksissä neuraaliharjasolut dissosioituivat hetkeksi Ca2+ / Mg2 + – vapaassa Danilchick medium53: ssa. Kutakin tilaa kohti analysoitiin kymmenen alkiota, jotka oli siirretty fluoresoivalla NC-merkinnällä.

Immunostisointi tehtiin neuraaliharjaräjähdyksillä54 käyttäen anti-N-cadherinia (1:50, rotta IgG, klooni MNCD2, DSHB), anti-e-cadherinia (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Kuvantaminen in vitro neural crest migration suoritettiin käyttäen time-lapse-kuvausta,kuten on kuvattu aiemmin 53, 60. Hermoharjasoluja viljeltiin lyhyesti fibronektiinillä päällystetyissä muovisissa tai lasisissa petrimaljoissa, ja time lapse-mikrokopia aloitettiin tunnin in vitro-viljelyn jälkeen. Solujen liikkuvuuteen ja siirtymiseen käytettiin yhdistemikroskooppeja (joko Eclipse 80i Nikon-mikroskooppi Hamamatsu-digitaalikameralla tai Dmrxa2 Leica-mikroskooppi Hamamatsu-digitaalikameralla, jota ohjataan yksinkertaisella PCI-ohjelmalla), jotka oli varustettu moottoroiduilla vaiheilla ja 10×/0.30 NA kuiva-objektiivilla. NC-kulttuurit valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Kuvia hankittiin 5 minuutin välein 12 tunnin ajan. solujen morfologisessa kuvantamisessa käytettiin TCS SP8-mikroskooppia, jossa oli 63 × /0.90 NA veteen upotettavat objektiivilinssit ja jota ohjattiin LAS–AF-ohjelmistolla. Kiinteät solut kuvattiin 63 × /1,4 NA: n öljykylpytavoitteella ja Las–af-ohjelmiston ohjaamalla Leica TCS SPE-konfokaalimikroskoopilla.

konstruktioiden lokalisoinnin tai endogeenisten IF-tasojen osalta analysoitiin 10-15 NCC: tä kutakin tilaa kohti koetta.

solujen migraatio ja solujen morfologia-analyysi

Kemotaksis-määritys tehtiin standardimenetelmällä61 käyttäen hepariiniakryylihelmiä (Sigma, H5263), jotka oli päällystetty 1 µg/mL puhdistetulla ihmisen stroomasoluista johdetulla tekijä 1: llä (Sigma, SRP3276). Solujen motiliteetti ja kemotaksis analysoitiin käyttäen ImageJ (https://imagej.nih.gov) – analyysityökaluja, kuten on kuvattu edellisessä53,60. Lyhyesti, jokainen yksittäinen solu seurattiin manuaalisesti käyttäen ImageJ: n manuaalista Seurantaliitännäistä, tiedot kerättiin ja analysoitiin ImageJ: n chemotaxis-liitännäistä. Solujen morfologiaa arvioitiin käyttämällä circularity index (complete circle = 1) ja estimoitiin ImageJ-analyysityökaluilla. Solujen dispersio analysoitiin käyttäen Delaunayn kolmiomittausalgoritmia (ImageJ Plugins) ja piirrettiin keskimääräiseksi selittäväksi kolmion alueeksi, kuten on kuvattu ennen 54. Solun ulkoneva alue analysoitiin neural crest solujen reunalla explant mittaamalla outgrowing alue, joka on peräisin kaksi peräkkäistä aikaväleillä 4 min aikaväli; nämä kaksi peräkkäistä kehyksiä vähennettiin tuottaa uuden area12. Solukemotaksien ja soludispersion analysointia varten analysoitiin 10-15 eksplanttia tilaa kohti kutakin itsenäistä koetta varten. Solujen motiliteettia, solujen morfologiaa ja solujen ulokkeita varten analysoitiin 15-25 NCC: tä per tila per koe.

molekyylibiologia, plasmidit ja reagenssit

cDNA: n synteesiä varten kokonais-RNA eristettiin 10-15 alkiovaiheesta 23-24 tai 10-15 eläinkapselivaiheesta 8 x: stä.laevis-valmistetta käytettiin jokaisessa riippumattomassa kokeessa tilaa kohti, ja jokaisessa kokeessa käytettiin kolmea teknistä toisintoa25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) mallina. Täyspitkät Cx43 (Cx43FL, aa 1-379), cx43-karboksyylin terminaalisesti typistetty konstruktio (Cx43Trunc, aa 1-212) ja Cx43-20k-konstruktio (Cx43Tail, aa 213-379) kloonattiin 5 ‘Bambi/3’ Xhoi pcs2+ – tai pCS2-EGFP-vektoreiksi. PCS2-EGFP-vektorin toimitti ystävällisesti tohtori Masa Tada. Cx43tailin indusoituva konstruktio valmistettiin yhdistämällä cx43-20ktail (aa 219-379) ihmisen gr: n ligandia sitovaan domeeniin (aa 512-777). Cx43-20k kloonattiin pcs2+: n ja pCS2-EGFP: N 5 ‘EcoRI/3’ Xhoi: ksi ja GR: N 5 ‘ECI/3’ Xhoi: ksi. Btf3-konstruktiot syntetisoitiin käyttäen X: ää. laevis-sekvenssi cDNA-kloonista (UniGene ID XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162) kloonattiin pcs2+: n tai pCS2-EGFP: N 5 ‘EcoRI/3’ Xhoi: ksi. Btf3 poisto konstruktio puuttuu nls alue RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) kloonattiin osaksi 5 ‘Bambhi/3’ Lai pCS2+. BiFC-kokeille (Kuva. 4b, c), Cx43Tail ja Cx43Trunc kloonattiin pCS2-VC155: N 5 ‘Bamhi/3’ Bamhiksi. BTF3FL kloonattiin 5 ‘Bambi / 3’ Bambi pCS2-VN9m. BiFC vektoreita ystävällisesti tarjosivat Prof James C. Smith. Kaikki konstruktiosekvenssit varmennetaan automatisoidulla DNA-sekvensoinnilla (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg/alkio,63).

kaikki fluoresoivien konstruktioiden analyysit arvioitiin normalisoimalla taustafluoresenssi ja tarvittaessa koko solualueen fluoresenssi.

käytettiin seuraavia reagensseja: flufenaamihappo (50 µM NC −inkubaatiolla −100µm alkionkäsittelyllä, Sigma, F9005), meklofenaamihappo (50 µM NC-inkubaatiolla-100µm alkionkäsittelyllä, Sigma, M4531), aktinomysiini D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) ja etanoliliukoinen deksametasoni (10 µM) lisättiin viljelyaineeseen vaiheissa 14-15 ja säilyy neural Crest migration alkion vaiheisiin (vaihe 23) asti. Indusoituvien kimeerien mahdollisen vuodon hillitsemiseksi kasvatettiin sisaruserä alkioita ilman deksametasonia ja käsiteltiin in situ-hybridisaatiota varten. Kytkentätestiä (testing gap junction channel activity) varten analysoitiin 10-15 NCC: tä per ehto per koe.

Immunoprecitation, fraktiointi ja western blotting

kunkin tilan osalta käytettiin 10-15 alkiota alkion lysaattien valmistamiseen koetta kohti. Kokonaiset alkiot valmistettiin western blotia varten homogenoinnin jälkeen lysis-puskurissa (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0, 01% Triton-X, pH 8, 0), johon lisättiin proteaasinestäjiä (Roche, 11836153001) ja fosfataasin estäjiä (Roche, 04906837001)54, 64. Western bloteille käytettiin seuraavia vasta-aineita: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); solut suspendoitiin hetkeksi hajoamispuskuriin ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 20 000×g: n lämpötilaan 4 °C: ssa, supernatantti otettiin talteen ja tilavuus säädettiin laimennuspuskurilla. Helmet tasapainotettiin laimennuspuskurissa ja sekoitettiin uudelleen suspendoituun solulysaattiin. Seos puhdistettiin magneettisesti ja valmistettiin western blotille. X. laevisin alkioiden ydinjakeen eristäminen suoritettiin differentiaalisella sentrifugaatioprotokollalla modifikaatioilla 64, 65. Lyhyesti vaihe 18 X. laevis-alkio lysoituu käyttäen 22 G: n neulaa ja 20 µL: n homogenisointipuskuria (HB: 250 mM sakkaroosia, 20 mM Hepesiä, 10 mM KCl: ää, 1 mM EDTA: ta, 1 mM EGTA: Ta, 1 mM DTT: tä, fosfataasia ja proteaasinestäjiä) alkiota kohti. Kaikki näytteet sentrifugoitiin kokoon 250×g 5 minuutin ajan alkionjätteiden poistamiseksi. Supernatantin keräämisen jälkeen se jaettiin kolmeen eri putkeen ja kehrättiin kolmella eri nopeudella (400×g, 600×g) 5 minuutin ajan solun tumien eristämiseksi. Tumanjälkeiset supernatantit säilytettiin jatkokäsittelyä varten. Ydinpelletit pestiin vielä kerran puskurissa HG ja sentrifugoitiin sopivalla nopeudella (400×g, 600×g). Tämän jälkeen ydinpelletit suspendoitiin uudelleen 40 µL: aan 10% glyserolia/0,1% SDS/1% Triton-X: ää HB: ssä. Kuhunkin näytteeseen lisättiin sopiva määrä näytepuskuria, ja näytteet käsiteltiin akryyliamidigeelielektroforeesia ja western blot-analyysiä varten. Kuormausvirheiden välttämiseksi sama kalvo pyyhittiin kuormausohjausta vasten kuorinnan jälkeen edellä 54, 64 kuvatulla tavalla.

Western blot-aineisto analysoitiin ImageJ-analyysityökaluilla. Kuvanvahvuudet normalisoitiin ja kiinnostavan proteiinin suhde lastausohjaukseen (ts., Mapk tai α-tubuliini)laskettiin, keskimääräiset suhdeluvut piirrettiin. Leikkaamattomat blotit ovat mukana täydentävinä lukuina (täydentävinä viikunoina. 5–7).

soluviljelmät

HeLa-soluja (Leibniz Institute Collections of Microorganisms and Cell Culture, Dsmz, Saksa) viljeltiin dmem: ssä täydennettynä 10-prosenttisella sikiön vasikkaseerumilla (Life Technologies, CA, USA) 37 °C: n lämpötilassa kostutetussa 10% CO2-ilmakehässä ja transfektoitiin rotifectia käyttäen (Carl Roth, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Xenopus-alkion fibroblasteja (XTC, Ana Losadalta saatu lahja) viljeltiin 67%: ssa dmem/H2O: ta täydennettynä 10%: lla sikiön vasikkaseerumia 25 °C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO2: lla ja transfektio tehtiin viafectia käyttäen (Promega, USA). Transfektioon tarkoitetut plasmidit määritettiin ohjeiden mukaisesti ja 10-20 Hela-tai XTC-solua analysoitiin kutakin tilaa kohti koetta.

siRNA-kokeissa siirryttiin kolmen sirnan yhdistelmään, joka oli suunnattu BTF3: a vastaan edellä kuvatulla tavalla. Kontrollina käytettiin tavallista sirnaa (kokkelisirna Sigmasta). Luettelonumero näille kaupallisille siRNA vastaan btf3 ovat: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Solut kerättiin 48 h transfektion jälkeen ja käsiteltiin qPCR -, western blot-tai Immunohistokemiallisiin kokeisiin. Kuten on kuvattu vastaavissa jaksoissa.

kaikki solulinjat tutkittiin mykoplasma-kontaminaation varalta.

Immunohistokemiallinen ja falloidiinivärjäys

proteiinin osoittamiseksi nisäkässolut tai hermoharjaräjähdykset kiinnitettiin 4% formaldehydiin 0, 2% PBS-T: ssä (PBS + 0, 2% Triton X-100) 10 minuutin ajan ja estettiin 10% NGS: llä 1 tunnin ajan. Primaariset vasta-aineet inkuboitiin 4 °C: ssa 10% NGS: ssä. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2, 5 µg/ml anti-n-cadherinia (Mncd2 Developmental Studies Hybridoma Bank) ja 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) 10% NGS:ssä ja inkuboitiin 4 °C: ssa.1: 350 10% NGS. DAPI laimennettiin 1:1000 ja se sekoitettiin sekundaarisiin vasta-aineisiin.

massaspektrometria

lipulla merkityn Cx43tailin samanaikaisessa immunoprecipitaatiossa massaspektrometrisessä analyysissä solut lysöitiin ja lysaatteja inkuboitiin yön yli anti-HA-ja tasapainotetuilla korkean affiniteetin helmillä 4 °C: ssa, minkä jälkeen immunoprecipitaatit pestiin ja elutoitiin 27. Tämän jälkeen happoeluutio 0,1 M glysiinillä pH 2,5, eluaattien pH säädettiin pH 8,0: aan 0,5 M Tris: llä. Proteiinin pilkkoutumista varten näytteitä inkuboitiin yön yli 2 µg: lla trypsiiniä (Trypsin Gold, Promega, USA), jonka jälkeen lisättiin 0.1 µg Lys-C: tä (Roche, Saksa) ja inkubaatio vielä 6 tuntia. peptidit suolattiin c-18: n käänteisfaasivaiheen kärjissä (Nest Group, USA), kuivattiin tyhjiössä ja varastoitiin -20 °C: ssa analyysiin asti. Kuivatut peptidiseokset otettiin talteen 3 µl: ssa 30% muurahaishappoa ja laimennettiin vedellä 23 µl: aan. Viisi µl digestiä ruiskutettiin Nano-LC-järjestelmään (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) ja peptidit erotettiin käänteisfaasikromatografialla c-18-kolonneilla, jotka on valmistettu itse (Reprosil-Pur C18-AQ, 1.9 µm, Dr. Maisch, Saksa, PicoFrit-kolonnit, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) lineaarisessa gradientissa 100% eluentti A: sta (0,1% muurahaishappoa) 55% eluentti B: hen (60% aktenitriiliä, 0,1% muurahaishappoa) 120 min. LC-järjestelmä asennettiin tuuletetuksi kolonniksi ja näyte kuormitettiin ja suolattiin virtausnopeudella 400 nl/min ja erotettiin virtausnopeudella 200 nl/min. Nano-LC-järjestelmä yhdistettiin massaspektrometriin (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Saksa), joka toimi datasta riippuvaisessa tilassa. Datan tulkinta tehtiin Mascot V2.2: lla (Matrixscience, UK) ja Progenesis LC–MS V4.1: llä (epälineaarinen dynamiikka, UK). Tietojen tulkinta suoritettiin maxquant V1.6.1.0: lla ja Perseus V1.6.1.3: lla (biokemian MPI, Saksa).

Kytkentätesti

Raon liitos solunsisäistä viestintää testattiin värikytkentätestillä. Tässä käytettiin fluoresoivaa väriainetta Kalseiini-AM (Sigma, 17783). Neuraaliharjapopulaatiota, joka leikeltiin seulomattomista alkioista, inkuboitiin kalseiini-AM-väriaineella noin 10 minuutin ajan tai kunnes väriaine lastattiin kaikkiin soluihin. Toinen neuraaliharjapopulaatio ydinmerkillä pistetyistä alkioista (nrfp mRNA-injektiot, KS.yllä) leikeltiin erikseen. Kun kaksi populaatiota oli dissosioitunut ilman kalsiumia ja magnesiumia, ne sekoitettiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 14 °C: n lämpötilassa koeputkessa. Lievän sentrifugin jälkeen neuraaliharjaräjähdykset leikattiin samankokoisiksi paloiksi ja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla ja sitten kuvattiin. Aukkoliitosten kanavaaktiivisuuden testaamiseen käytettiin aukkoliitossalpaajia; meklofenaamihappoa (Sigma, M4531) ja flufenaamihappoa (Sigma, F9005). Soluviestintää arvioitiin arvioimalla sekä merkkiaineita, ydinmarkkeria että Kalseiinia näyttävien solujen määrän suhde niiden solujen kokonaismäärään, joissa on ydinmarkkeri.

tilastollinen analyysi

otoskoko estimoitiin aiemmin julkaistua työtä seuraamalla, eikä erityistä tilastollista menetelmää käytetty. Kokeita ei satunnaistettu ja koska luonne kokeiden, kirjoittajat eivät sokaistuneet jako aikana sekä kokeiden ja tulosten analysointi. Vain elinkelpoiset alkiot ja räjähteet analysoitiin. Väärin ruiskutettuja alkioita ei otettu mukaan In situ-hybridisaatiokokeisiin. Oikea injektio määritettiin lineaarisilla merkkiaineilla. Testiparametrejamme mitattiin sattumanvaraisesti, kun elinkelpoiset ja oikein ruiskutetut alkiot oli valittu.

prosenttilukujen vertailu tehtiin käyttäen ennakoimattomuustaulukkoa66. Datajoukkojen normaaliutta testattiin Kolmogorov-Smirnovin, D ‘ Agostinon ja Pearsonin testeillä ja Shapiro–Wilkin testillä Prism6: lla (GraphPad). Normaalijakaumaa seuraavia tietokokonaisuuksia verrattiin opiskelijan t-testiin (kaksihäntäiset, epätasa-arvoiset varianssit) tai anovaan, jossa dunnettin monivertailut testin jälkeen Excelillä tai Prism6: lla (GraphPad). Aineistoja, jotka eivät noudattaneet normaalijakaumaa, verrattiin käyttäen Mann Whitneyn testiä tai nonparametristä ANOVAA (Kruskal Wallis with Dunn ‘ s multiple compares post-test) käyttäen Exceliä tai Prism6: ta. Ristivertailuja tehtiin vain, jos anovan Kokonaisp-arvo oli alle 0,05. Kaikissa kuviolegendoissa N = riippumattomien kokeiden lukumäärä; n = otoksen kokonaiskoko.

X. laevis n-cadherinin osittainen promoottoritunnistus

Xenopus n-cad: n peruspromoottorin tunnistamiseksi käytimme seuraavaa strategiaa. Perus promoottori alue poikasen ja nisäkkäiden n-cadheriini geenit on kuvattu 5 ‘ – UTR alueilla, asemassa -3000 – -1 bp kunnioittavat translaation aloitus site41, 67. Käyttämällä X. laevis Genome Project resourcea (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) tunnistimme X. laevis n-cadherinin geenin 5’-UTR: ssä 2800 bp: n alueen (Supplementary Fig. 4). Koska tietojemme mukaan cx43tail, BTF-3 ja Pol II muodostavat kompleksin, käytämme ElemeNT tool68: aa etsimään mahdollisesti aktiivisia TATA-laatikoita eristämältämme alueelta. Meidän in silico analyysi paljastaa TATA laatikko rikas alue välillä kantoja -166 -618 bp, suhteessa käännös aloittaa sivuston (täydentävä Kuva. 4). Lopuksi suunnittelemme päällekkäisiä alukkeita vahvistamaan 200 bp: n palasia tällä alueella. Primers sekvenssit on lueteltu siru-osiossa ja niiden sitovat alueet on korostettu täydentävässä Kuvassa. 4.

kromatiini-immunopresipitaatio (siru)

kromatiini-immunopresipitaatiossa (siru) noudatimme standardimenetelmää X. laevis embryos69, 70. Jokaista itsenäistä koetta varten käytimme kahta teknistä kopiota ja 250-300 Xenopus-alkiota per ehto. Laevis-alkioita korjattiin 15 minuutin ajan ja käytettiin 3 µg Pol II-vasta-ainetta (Diagenode, C15100055) tai GFP-Siruluokan vasta-ainetta (Abcam, ab290). DNA: n erottamisessa noudatimme protokollaa 69,70. Elementtianalyysiresurssin avulla etsimme X: stä oletettuja TATA-laatikoita. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5 ‘-GCCAAGTT-3’,

P8F: 5′ – GGAAGCAATGCTC-3′,

P8R: 5′-AGTCTGCTAGGAGACAACG-3′

ja niiden suhteellinen sitoutumiskohta on esitetty täydentävässä Kuvassa. 4b. siru kokeet kvantifioitiin seuraavasti: normalisoitu suhde bändi intensiteetti kunkin ehdon keskiarvoksi se ja kertainen lisätä suhteessa IgG ohjaus laskettiin ja piirrettiin kertaiseksi rikastumista. Band intensiteetti rekisteröitiin käyttämällä ImageJ geelit analyysi plugin. Päällystämättömät geelit on esitetty täydentävässä Kuvassa. 7c, k.