Genominlaajuinen kondensiinisidonnan analyysi teoksessa Caenorhabditis elegans

Kondensiinit i ja II jakavat kaksi SMC-alayksikköä MIX-1 ja SMC-4, ja ne erotetaan kolmesta ei-SMC-alayksiköstä (Kuva 1a). Kondensiini IDC eroaa kondensiini I: stä vain yhdellä alayksiköllä, SMC-4-muunnoksella DPY-27. Käytimme yhtä tai kahta erilaista vasta-ainetta kutakin kondensiinialayksikköä vastaan ChIP-seq: lle ja tunnistimme ne sitoutumispaikat, jotka ovat yleisiä useissa vasta-aineissa ja biologisissa toisinnoissa (Lisätiedosto 1: taulukko S1). Vasta-aineiden validointi ja odotettavissa olevat Co-immunoprecipitaatio interaktiot lauhden holokompleksista on esitetty lisätiedostossa 2. ChIP-rikastuksen mediaanipisteiden parirelaatio ryhmitelty kondensiini I-IDC ja II alayksiköt erikseen, mikä vahvistaa yksittäisten alayksiköiden jakautumisen kolmen kondensiinityypin välillä (Kuva 1B).

kolmen kondensiinikompleksin korkean resoluution sitoutumiskuviot ovat samanlaisia

C. eleganeilla kondensiini I: llä ja II: lla on osittain päällekkäisiä , mutta eri kromosomipaikkakuntia mitoosissa ja meioosissa, ja kondensiini IDC on suunnattu nimenomaan X: lle . Siksi odotimme löytävämme erilaisia ChIP-seq-malleja kondensiini I: lle, IDC: lle ja II: lle. sen sijaan kondensiini I: n, IDC: n ja II: n alayksiköiden sidontakuviot olivat yleensä samanlaisia (Kuva 1c). Tämä samankaltaisuus ei johtunut vasta-aineiden ristireaktiivisuudesta, koska HCP-6-vasta-aine, joka ei osoita ristireaktiivisuutta eikä immunopresipitoi kondensiini I-IDC-alayksikköä , osoitti laajaa rinnakkaislokalisoitumista kondensiini I-IDC-alayksiköiden kanssa (ks.HCP-6 Kuvassa 1c). Lisäksi, jos kondensiini II: n päällekkäisyys johtui ristireaktiosta kondensiini IDC: n kanssa, olisimme odottaneet kondensiini II: n sitoutumispaikkojen rikastumista X: llä, mikä ei toteutunut (Kuva 1D). Verrattuna lauhden II, lauhden IDC alayksiköt johdonmukaisesti oli suurempi siru pisteet X, mikä viittaa ero kromosomiyhteyden kahden lauhden komplekseja kaapattu siru (huomaa eri asteikot X ja kromosomi I Kuvassa 1c). Koska teimme ChIP-seq-testin sekavaiheen alkioilla, suurin osa soluista (yli 95% arviolta 4′,6-diamidino-2-fenyyliindoli (DAPI) – värjäyksellä) oli interfaasissa. Lauhdutin I-alayksiköiden puute autosomeissa (Kuva 1c ja Lisätiedosto 3: Kuva S1A) ja aiempi havainto, että kondensiini I paikantuu mitoottisiin kromosomeihin ydinkuoren hajoamisen jälkeen, viittaavat siihen, että suurin osa siru-seq-signaalista on interfaasista. Tämän tueksi kondensiini II: n osoitettiin olevan interfaasin aikana ydinvoima , ja sen sitoutumispaikat jakautuivat tasaisemmin kaikkien kromosomien kesken (Kuva 1D).

KLE-2, HCP-6 ja CAPG-2 ovat kondensiini II-spesifisiä, eli edustavat kondensiini II-sidontaa. Lauhdutin I ja IDC jakavat kaikki kolme ei-SMC alayksikköä, joten jäljempänä viitataan ChIP-seq-signaaliin DPY-26: sta, DPY-28: sta ja CAPG-1: stä lauhdutin I-IDC: stä. Keskittyäksemme kompleksina sidottuihin sivustoihin laskimme keskimäärin sirusignaalin kondensaattorityyppisistä CAP-alayksiköistä. Keskiarvotietojen lisäksi varmistimme, että jokainen analyysi piti paikkansa yksittäisillä alayksiköillä, ja esitämme HCP-6: n ja DPY-28: n lisälukuina. Tunnistimme joukon korkean luottamuksen lauhden I-IDC ja II sitovia sivustoja valitsemalla vain ne ChIP-seq piikit, jotka olivat yhdenmukaisia kahdessa tai useammassa ei-SMC-alayksikössä (Kuva 1D). Kuten aiemmin todettiin, 97% kondensiini I-IDC: n sitoutumisesta tapahtui X-kromosomissa . Kondenssiini II jakautui samalla tavalla autosomien ja X: n kesken.Kondenssiini II sitoutui X-kromosomin vahvempiin kondenssiini I-IDC-alueisiin (Kuva 1E ja Lisätiedosto 3: kuva S1B).

Kondensiinisidontapaikat rikastetaan aktiivisilla promoottoreilla

niiden alueiden tunnistamiseksi, joissa kondensiinit ensisijaisesti sitoutuvat, analysoimme kondensiinisidontapaikat useiden genomihuomautusten perusteella. Kondenssiinisitoutumispaikat rikastuivat merkittävästi promoottoreissa, lähellä tRNA-geenejä ja ei-koodaavia RNAs-geenejä (Kuva 2a, Lisätiedosto 4: Kuva S2). Eliminoidaksemme sen mahdollisuuden, että lauhdeniin sitoutuneita tRNA-geenejä esiintyy vain promoottoreissa, poistimme tRNA-geenit, jotka olivat 1 kb: n sisällä transkription aloituspaikasta (TSS), ja määritimme, että tRNA: n ja lauhdeniinisitoutumispaikkojen päällekkäisyys pysyi merkittävänä (23% ja 6% trnoista päällekkäin lauhden I-IDC: n ja II: n paikkojen kanssa, P = 0.0002). Kondensiinisidonta tRNA-geeneissä viittaa siihen, että TFIIIC-välitteinen kondensiinirekrytointi saattaa säilyä C. elegansin ja hiivan välillä .

Kondenssipaikat rikastuvat promoottoreilla ja tRNAs: llä, ja sitoutuminen korreloi positiivisesti transkription kanssa. A) kondensiinisitoutumispaikkojen rikastuminen tai ehtyminen erilaisissa genomihuomautuksissa annetaan. Satunnaisrikastus ja p-arvot laskettiin permutaatiotestillä, jossa kondensiinipiikit jaettiin satunnaisesti 10 000 kertaa. Sekä kondensiini I-IDC: n että II: n osalta sidontapaikat rikastuvat merkittävästi 1 kb: n promoottoreissa ja lähellä koodaamatonta RNAs: ää (P = 0.0002), ehtyminen geeniruumiissa (transkription aloituspaikka (TSS) transkription loppupaikkaan (TES)) (P = 0, 0002), eikä merkittävää rikastumista tai ehtymistä geenien 3′ kohdalla (p > 0, 05). (B) Kondensiinisirun signaali on linjassa ilmaistujen geenien TSSs: ssä (ylin 25% RNA-tasolla, kiinteät viivat) ja ei ilmaistuja geenejä (alempi 25% RNA-tasolla, murskatut viivat). Ympäröivät pisteet edustavat 95 prosentin luottamustasoa. Kontrollina immunoglobuliini G: n (IgG) Sirusignaali TSS: ssä piirretään harmaalla. C) Spearman rank-korrelaatiokerroin sirun mediaaniarvon välillä 500 bp: n promoottoreilla ja RNA-tason välillä vastaavissa geeneissä annetaan koko genomille ja X-kromosomille. Kondensiinisitoutumisen ja transkription välillä on lievä positiivinen korrelaatio. (D) sirun mediaaniarvo 500 bp: n sisällä TSS: n yläjuoksulla piirretään kunkin geenin RNA-tasoon. Kondensiinipromoottoriin sitoutuvat geenit (jotka on määritelty päällekkäisyyksillä kondensiinipaikan kanssa 1 kb: n sisällä TSS: stä) on korostettu oranssilla (kondenssiini I-IDC) ja sinisellä (kondenssiini II). E) 50 bp: n GC-pitoisuus piirretään kondensiini I-IDC: n ja II: n sitovien huippujen välillä. Kontrollina määritettiin ja piirrettiin 1500 satunnaiskoordinaatin GC-pitoisuus samalla tavalla kuin varsinaiset kondensiinihuiput. Keskimääräinen GC-pitoisuus on korkea kondensiinisitoutumishuipun tuntumassa.

sitoutuminen oli suurinta 500 bp: n sisällä TSS: stä (Lisätiedosto 5: Kuva S3A) ja 45% kondensiini I-IDC: stä ja 62% kondensiini II: n piikeistä sijaitsi promoottoreissa. Kondenssiinisitoutuminen promoottoreissa korreloi positiivisesti loppupään geenin transkriptioaktiivisuuden kanssa (kuva 2b,C), mutta kaikki aktiiviset promoottorit eivät olleet sitoutuneita (Kuva 2D). Geenien ontologian termianalyysi sitoutuneista promoottoreista osoitti vähäistä (1, 3-kertaista) mutta merkittävää (P = 3, 5 e-17) rikastumista alkionkehitysfunktiolla varustetuille geeneille (Lisätiedosto 6: taulukko S2). Noin 20%: lla voimakkaasti ilmentyvistä geeneistä (yläkvartiililla RNA-tasolla) oli kondensiini II: n sitoutumiskohta 1 kb: n sisällä, ja noin 70%: lla X-kromosomin geeneistä kondensiini I-IDC: n sitoutumiskohta 1 kb: n sisällä. Siksi, vaikka transkriptiotoiminta on tärkeää, se ei riitä selittämään kondensiinisitoutumisen spesifisyyttä tietyissä promoottoreissa.

huomasimme, että kaikilla kondensiinisidontapaikoilla GC-pitoisuus rikastui huomattavasti ympäröiviin alueisiin ja satunnaisiin koordinaatteihin verrattuna (Kuva 2e). C. elegansissa X-kromosomin promoottoreiden GC-pitoisuus on suurempi kuin autosomaalisten promoottoreiden . On mahdollista, että korkeampi GC-pitoisuus on DNA-sekvenssin ominaisuus kondensiinisidonnalle, ja X-promoottorit kehittyivät sisältämään korkeampaa GC-pitoisuutta tukemaan kondensiinin IDC-sidontaa.

Kondensiinisitoutumispaikat vastaavat merkittävästi transkriptiotekijöiden osajoukkoa

määrittääksemme muita tekijöitä, jotka erottavat lauhdeniin sitoutuvat promoottorit, vertasimme lauhden ja TF: n sitoutumispaikkoja ja löysimme TF: n osajoukon, joka on sitoutunut samoihin promoottoreihin kuin kondenssit (Kuva 3A). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että useat TF: t sitoutuvat joukkoon korkean miehitysasteen sitoutumiskohtia (HOT) . Kondensiini I-IDC: stä 5% ja kondensiini II: sta 22% oli päällekkäisiä kuumien alueiden kanssa (P = 0,0002). Päällekkäisyyksien merkitys TFs: n kanssa pysyi samana, kun kuumat sivustot poistettiin analyysistä (Lisätiedosto 5: Kuva S3B). Kunkin TF: n päällekkäisyysprosentit riippuivat sidontapaikkojen lukumäärästä, ja ne esitetään lisätiedostossa 5: Kuva S3C. yksittäisistä TF: istä havaitsimme, että 69% kondensiini II: n kohteista ja 53% LIN-13: n kohteista oli päällekkäin toistensa kanssa, mikä teki lin-13: sta top TF: n, joka oli merkittävästi päällekkäinen condensiini II: n kanssa.

Kondensiini II sitova päällekkäisyyksiä transkriptiotekijöiden ei-satunnaisesti, ja ekspressioanalyysi viittaa repressiivinen funktio condensiini II. (A) transkriptiotekijä sivustoja modENCODE ovat paremmuusjärjestykseen kertainen rikastaminen päällekkäisyyttä kondensiini sitovia sivustoja. Kertainen rikastus määritetään prosenttiosuuksien päällekkäisyyden suhteena Havaittujen lauhdutuspaikkojen satunnaisten jakaumien keskiarvoon 10 000 kertaa koko genomissa. Tulokset osoittavat, että kondenssiinisidonta ei ole satunnaista suhteessa TF: n sitoutumiskohtiin. B) Venn-diagrammit näyttävät kondensiini II: n sidontapaikkojen päällekkäisyydet lin-13: n (modENCODE_3342, alkiot) ja LIN-35: n (modENCODE_3925, myöhäiset alkiot) kanssa (ylhäällä), lin-13: n kanssa (alhaalla vasemmalla) ja Lin-35: n kanssa (alhaalla oikealla). Kondensiini II: n ja LIN-13: n ja LIN-35: n päällekkäisyyksien osuus on suurempi kohdissa, joissa on molempia proteiineja. Annettu päällekkäisyys kuvaa kondensiini II-piikkien määrää, joka on päällekkäinen vastaavien lin-13-ja LIN-35-alueiden kanssa. C) kondensiini II: n, lin-13: n ja LIN-35: n keskimääräinen ChIP-seq-rikastusarvo piirretään kunkin kondensiini II: n piikin huipun poikki. Kondensiini II: n sitoutumispaikat jaetaan neljään ryhmään. Ylin ryhmä koostuu kondensiini II: n sidontapaikoista, jotka ovat limittäin LIN-13: n ja LIN-35: n kanssa, toinen limittyy vain LIN-13: n kanssa, kolmas lin-35: n kanssa ja viimeinen ryhmä Ei limity lin-13: n tai LIN-35: n kanssa. Piikit ovat pienenevässä järjestyksessä sirujen rikastuksen perusteella. Lukuisissa kondensiini II-kohteissa näkyy korkea LIN-13, mutta ei lin-35, sitova. Kondenssiini II: n sitoutuminen on vahvempaa sekä LIN-13: n että LIN-35: n sitomissa kohdissa. (D) Differential expression analysis (RNA-seq) in kle-2 null heterotsygootti versus homotsygootti toukkavaiheen 2/3 (L2/L3) toukat. Kle-2: n sitomien tai sitoutumattomien geenien osuudet transkriptiotason lisääntyessä tai vähetessä homotsygoottisessa mutaatiossa on esitetty. Transkriptiotasot suhteessa enemmän geenejä kasvaa kle-2 mutantti. TF, transkriptiotekijä.

Lin-13: lla on retinoblastoomaproteiinin (pRb) yhteisvaikutusmotiivi ja se toimii vulvalin kehityksessä C. elegans-bakteerin yhden PRB-homolog lin-35: n kanssa . D. melanogasterissa kondensiini II: n alayksikkö dCAPD3: n sitoutuminen kromatiiniin vähenee pRb-mutaation yhteydessä . Jos C. elegansissa lin-13 värvää lauhden II: n LIN-35: n kautta, niin niiden lin-13: n alueiden, joita myös lin-35 (576) sitoo, pitäisi olla enemmän päällekkäisiä lauhden II: n kanssa kuin niiden LIN-13: n alueiden, joita LIN-35 ei sido (1,033). Lin-13: n ja Lin-35: n co-miehitettyjen alueiden päällekkäisyys kondensiini II: n kanssa oli vain hieman suurempi kuin lin-13: n ilman LIN-35: tä, 60%: A ja 50%: a (kuva 3B). Vastaavasti lin-35: n ja kondensiini II: n päällekkäisyys oli suurempi niillä alueilla, joihin myös LIN-13 sitoi niitä (45%) verrattuna sitoutumattomiin alueisiin (9%). Tämä viittaa siihen, että Lin-13: n ja kondensiini II: n mahdollinen vuorovaikutus on enimmäkseen lin-35: stä riippumatonta. LIN-35 toimii C. elegansissa (hDREAM ihmisillä) säilyneessä moniproteiinikompleksissa nimeltä DRM, joka sisältää myös EFL-1: tä ja DPL-1: tä . Lin-13: n sitomat 555 DRM: n sitoutumisalueet olivat päällekkäisempiä kondensiini II: n kanssa (63%) verrattuna 787 DRM: n alueeseen, joita LIN-13 ei sitonut (13%). Jaoimme lauhden II-alueet neljään ryhmään sen mukaan, miten sidontapaikka limittyy lin-13: n ja LIN-35: n kanssa (kuva 3c). Tämä ryhmittely osoitti, että suuri määrä kondensiini II-alueita osoittaa suurta lin-13-sitoutumista, mutta ei lin-35: tä, mikä viittaa siihen, että jos pRb-välitteinen kondensiini II-rekrytointi säilyy C. elegansissa, lin-35 voi riippua lin-13: n esiintymisestä kondensiini II-rekrytoinnissa.

Kondenssiini II-mutaatio aiheuttaa transkriptiovirheitä, jotka viittaavat repressiiviseen toimintaan

hiivalla ja D. melanogasterilla kondenssiini on yhdistetty transkriptioiden tukahduttamiseen . Eräs D. melanogasterin tuore tutkimus osoitti, että kondensiini II-alayksikköä CAPD3 tarvitaan mikrobilääkkeiden peptidigeenien rykelmän transkriptioaktivointiin . Ymmärtääksemme kondensiini II: n roolin transkription säätelyssä suoritimme RNA-seq: n kle-2 null-mutant L2/L3-toukille. Maternally loaded KLE-2 mahdollistaa kle-2 null mutantin (ok1151 alleeli) kasvaa steriilejä aikuisia. Vertailimme geeniekspressiota heterotsygoottisissa ja homotsygoottisissa kle-2-mutanteissa L2/L3-toukissa ennen itulinjan proliferaatiota, jolloin se sisälsi lähes kokonaan interfaasiytimiä. Deseq2: n avulla tehdyssä differentiaaliekspressioanalyysissä tunnistettiin 356 geeniä, joiden ekspressio oli homotsygootilla merkitsevästi erilainen kuin heterotsygootilla (väärien löytöjen määrä < 5%; DESeq2: n tulokset on esitetty lisätiedostossa 7: taulukko S3). Suurin osa eri tavoin ilmentyvistä geeneistä lisääntyi (70%) sen sijaan, että ne vähenivät (30%) ekspressiossa. Geeniontologian termianalyysi ei paljastanut tiettyä geeniryhmää, johon KLE-2-mutaatio vaikutti. Samaan tapaan kuin julkaistut tiedot kondensiini-IDC: stä, KLE-2: n sitoutumisen ja geeniekspression muutosten välillä ei ollut suoraa korrelaatiota. Tärkeää on, että 46: sta eri tavoin ilmaistusta ja KLE-2-sidotusta geenistä 83% lisääntyi ekspressiossa verrattuna 67%: iin 310 geenistä, jotka eivät olleet KLE-2-sidottuja (kuva 3D), mikä viittaa siihen, että kondensiini II-sidoksen suora vaikutus on suurelta osin tukahduttava.

avoimeen kromatiiniin liittyvät Histonimodifikaatiot korreloivat positiivisesti kondensiinisitoutumisen kanssa

ymmärtääksemme kondenssiinisitoutumisen kromatiiniyhteyden analysoimme kondensiinisitoutumispaikkojen ja kromatiiniominaisuuksien suhdetta, jotka on kartoitettu modencodella . Havaitsimme yleisen positiivisen korrelaation kondensiinisitoutumisen ja aktiivisen kromatiinin merkkien välillä. Hiivassa kondenssiinisitoutumiskohtien määrä koko solusyklin ajan korreloi suoraan kromosomin pituuden kanssa. C: n numero. elegans kondensiini II: n sitoutumiskohdat eivät olleet verrannollisia kromosomin pituuteen (Kuva 4A), vaan korreloivat positiivisesti aktiivisiin histonimerkkeihin liittyvien kromosomien pituuteen (Kuva 4B). X-kromosomi oli poikkeus, ehkä sen kromatiinia muuttavien annoskompensaatiomekanismien vuoksi . Kondensiini I-IDC ja II-sitoutuminen genomiin korreloivat positiivisesti avoimien kromatiinimerkkien kuten H3K27ac ja negatiivisesti heterokromatiinimerkkien kuten H3K27me3 ja H3K9me3 kanssa (kuva 4C ja Lisätiedosto 8: Kuva S4). Tämä korrelaatio oli toimialueen laajuisella tasolla (analysoituna 1 kb Windowsissa), koska emme nähneet tiettyä histonimuunnosta, joka oli huipussaan kondenssipaikoissa “metageeni” – tyyppisessä analyysissä (tietoja ei näytetä). Immunofluoresenssitutkimuksissa sentromeeriproteiinit limittyivät kondenssiini II: n sitoutuessa mitoottisiin soluihin . Emme havainneet positiivista korrelaatiota cenp-A: n ja kondensiini II: n siru-seq: n signaalien välillä sekavaiheen alkioissa, mikä viittaa siihen, että interfaasiytimissä (useimmissa sekavaiheen alkiosolujen ytimissä) ei ole päällekkäisyyttä. Vaihtoehtoisesti, koska CENP – a sitoutuu vain pieneen osajoukkoon cenp-a positiivisia alueita genomissa per solu, cenp-A: n päällekkäisyys kondensiini II: n kanssa saattaa näkyä vain yksittäisissä soluissa. Ymmärtääksemme, mitkä kromatiinitekijät ennustavat parhaiten kondensiinisidontaa, käytimme koneoppimista. C. elegansissa H4K20me1 rikastuu voimakkaasti X-kromosomin poikki DCC: n avulla, ja näin H4K20me1 oli kondensiinin IDC-sitoutumisen erottelevin tekijä (Kuva 4D). Kondensiini II: lle erittäin ennustavia kromatiiniominaisuuksia ovat h3k27ac ja CBP, jotka molemmat ovat aktiivisten tehostajien markkereita, mikä viittaa siihen, että kondensiinisidonta rikastuu aktiivisilla tehostajilla . Niistä 201 kondensiini II-sidontapaikasta, jotka olivat 2 kb: n päässä merkitystä TSS: stä, 58 oli päällekkäin CBP-sidontapaikan kanssa (P = 0.0002).

avoimeen kromatiiniin ja tehosteisiin liittyvät Kromatiinikertoimet korreloivat positiivisesti kondensiinisitoutumisen kanssa. A) kondensiini II: n piikkien lukumäärä piirretään kunkin kromosomin lineaarisen pituuden mukaan. B) kondensiini II-piikkien lukumäärä piirretään h4k8ac-ja h4k16ac-piikkien kattaman kromosomin pituuteen. Autosomitietoihin asennettu trendiviiva osoittaa positiivisen korrelaation (R2 = 0, 9). (C) Kondensiinisidonta 1 kb: n vierekkäisissä ikkunoissa X-kromosomin (vasemmalla) ja autosomien (oikealla) välillä korreloi positiivisesti aktiivisten merkkien (esimerkiksi H3K27ac, H2A.Z) kanssa ja korreloi negatiivisesti repressiivisten merkkien (esimerkiksi h3k27me3, H3K9me3) kanssa. (D) ryhmä luokittelija (satunnaiset metsät) opittiin ennustamaan kondensiinin sitoutumista koko genomin. 20 parasta ominaisuutta (92 kokonaisominaisuuden joukossa, Lisätiedosto 1: taulukko S1), joilla on suurin ennakoiva teho, piirretään lauhden I-IDC: lle (vasemmalla) ja lauhden II: lle (oikealla), joiden päällä on tärkein ominaisuus. Ominaisuudet asetetaan paremmuusjärjestykseen keskimääräisen tarkkuuden laskun perusteella, joka kuvaa todellisen luokituksen virhetason ja ominaisuuden sallimisen jälkeisen virhetason erotusta kaikkien luokittajien (puiden) keskiarvona.

kondensiinisitoutumispaikoilla rikastetuissa DNA-sekvenssimotiiveissa on erityispiirteitä

vaikka kondenssiini II sitoutui X: n kondensiini I-IDC: n kohtiin, kondenssiini I-IDC ei sitoutunut useimpiin autosomaalisiin kondenssiini II: n sitoutumiskohtiin (Kuva 1D). Ymmärtääksemme kondensiini IDC: n ja II: n rekrytoinnin spesifisyyttä etsimme DNA-sekvenssiominaisuuksia, jotka erottavat kondensiini II: n ja kondensiini IDC: n sitoutumisen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kondenssiini IDC värvätään ensin noin 100 paikkaan ja leviää sitten muihin kromosomipaikkoihin . 10 bp: n DNA-sekvenssimotiivi rikastettiin kondensiini-IDC: n rekrytointipaikoissa (Kuva 5A) ja motiivin mutaatio poisti kondensiini-IDC: n rekrytoinnin ekstrakromosomijärjestelmissä , mikä osoittaa, että kondensiini-IDC: n DNA-sekvenssimotiivilla on tärkeä rooli kondensiini-IDC: n rekrytoinnissa.

löysimme gcgc: tä sisältävän DNA-sekvenssimotiivin, joka rikastui kondensiini II: n sitoutumiskohtien alla (kuva 5A). On mielenkiintoista huomata, että sekä lauhden II että lauhden IDC-motiivi sisälsivät gcgc-ytimen, mutta lauhden IDC-motiivia laajennettiin toisella puolella AGGG: llä, mikä viittaa siihen, että lauhden IDC-rekrytoinnin X-spesifisyys saavutetaan AGGG: n tunnistavilla kofaktoreilla. Genomin laajuinen, 11% kondensiini II motiiveja sitoi kondensiini II. siten, kuten muut TFs (esimerkiksi), vain osa mahdollisista DNA sekvenssi motiiveja sitoi kondensiini II. Muut tekijät, kuten kromatiini saatavuutta ja tuntematon co-tekijät voivat olla mukana sitova spesifisyys. Itse asiassa, jos otimme ne kuviot, jotka olivat 2 kb ikkunassa merkittävästi rikastettu aktiivinen Histoni merkki, kuten H4K16ac, prosenttiosuus motiiveja, jotka sidottiin kasvoi 11%: sta 29%. Lisäksi samanlainen kuin condensiin IDC motif , joka on enemmän ryhmittynyt sidottuihin sivustoihin, huomasimme, että 1 kb genomiset ikkunat, jotka sisälsivät enemmän kuin yhden condensiini II-Motifin, olivat noin 2,5-kertaisesti todennäköisempiä sitoutumaan condensiiniin II verrattuna niihin, joissa on vain yksi motiivi. Siksi motif clustering ja avoin kromatiiniyhteys auttavat määrittämään sidottujen motiivien valinnan.

condensiini IDC: n ja condensiini II: n Kromosomirekrytointiin liittyy sekä yhteisiä että erillisiä säätelijöitä. (A) motiivi logot 10 bp DNA sekvenssi motiiveja rikastettu yläosassa lauhden sivustoja on esitetty. B) kondensiini I-IDC: n, kondensiini II: n ja SCC-2: n sidontapaikkojen välillä on päällekkäisyyttä. Kunkin tekijän numerot osoittavat sitoutumispaikkojen kokonaismäärän. Päällekkäiset luvut perustuvat SCC-2-piikkien lukumäärään. (C) University of California Santa Cruz (UCSC) selainnäkymä esimerkki SCC-2 siru-seq signaali, joka on enimmäkseen rajoitettu promoottorit. D) SCC-2: n ja kondensiini II: n Sitominen tarkoin määritellyssä condensiini IDC: n rekrytointipaikassa X: llä (rex-1). (E) sdc-2 null-mutantissa (TY1072) kondensiini I-IDC: ssä (DPY-26), kondensiini II: ssa (HCP-6, KLE-2) ja SCC-2: ssa sitoutuminen vähenee Rex-2: ssa (vasen paneeli), mutta pysyy pitkälti samanlaisena autosomeissa (oikea paneeli). F) Laatikkokuva sirujen rikastumisen suhteesta sdc-2-mutanttiin villityyppiin SCC-2: n sitovien piikkien sisällä. Sitoutumispaikat luokitellaan autosomeissa, X: ssä, jossa on alhainen SDC-2-sidos ja korkea SDC-2-sidos. G) qPCR-analyysi DPY-27-sirujen rikastamisesta alkioissa, jotka on eristetty aikuisista, joille syötettiin vektori (kontrolli) ja PQN-85 RNAi. Sirun rikastus ilmaistaan suhteessa negatiiviseen kontrollilokukseen. Virhetangot ovat keskihajonnat kolmesta viiteen biologista toisintoa. Siru, kromatiini immunoprecipitaatio; DCC, annoskompensaatiokompleksi.

kaikilla kondensiini II: n sidontapaikoilla ei ole tätä motiivia. Niissä kondensiini II-paikoissa, joissa ei ole motiivia, sidontaan voivat vaikuttaa muut tekijät. Vaihtoehtoisesti kuviota sisältävien kondensiini II-alueiden vähäinen osuus (27%) voi selittyä sillä, että kondensiini II: ta voi levitä rekrytoinnin jälkeen. Leviämispaikkojen ei odoteta sisältävän motiivia. Esimerkiksi condensiinin IDC: n osalta suuri osa potentiaalisista rekrytointipaikoista (56%) sisältää motiivin, mutta ei levityspaikkoja (8%) . Kartoitettujen lauhden II-alueiden rekrytointikapasiteetista on tehtävä systemaattinen analyysi, jotta voidaan puuttua mahdollisiin leviämisiin.

SDC-2 vaaditaan kondenssiini I-IDC: n, kondenssiini II: n ja koossiinilataajan sitomiseksi X-kromosomin DCC-rekrytointipaikkoihin

metatsoaaneissa ei tunneta hyvin proteiineja, jotka osallistuvat kondenssirekrytointiin kromosomeihin. Hiivassa kondenssiinisidonta on päällekkäistä koossiinikuormituskompleksin Scc2/4 kanssa, mikä lisää kondenssiiniyhteyttä kromosomeihin . Testataan, säilyykö scc2/4: n kanssa päällekkäisyys hiivan ja C: n välillä. elegans, suoritimme ChIP-seq analyysi SCC-2 (tunnetaan myös nimellä PQN-85) ja totesi, että merkittävä 95% SCC-2 sivustoja päällekkäin kondensiini I-IDC X, ja 60% kanssa condensiini II genomin-wide (Kuva 5B). Päällekkäisyydet pysyivät samanlaisina, kun kuumat alueet jätettiin pois (Lisätiedosto 9: Kuva S5A). Kaikki kondensiinipaikat eivät ole päällekkäin SCC-2: n kanssa, mikä viittaa siihen, että toisin kuin hiiva, kondensiini ei riipu SCC-2: sta sitomiseen . SCC – 2-Sidonta oli suurempi promoottoreilla ja korreloi positiivisesti transkription kanssa (Lisätiedosto 9: Kuva S5B). Gagaa sisältävää DNA-sekvenssimotiivia oli 58%: ssa SCC-2: n sidontapaikoista (Lisätiedosto 9: Kuva S5C). Toisin kuin Drosophila Niped-B , ja samanlainen kuin S. cerevisiae Scc2 , SCC-2-sitoutuminen ei ollut suurta transkriboiduilla alueilla, mutta pysyi intergeenisenä (Kuva 5C).

kondenssiini II: n sitoutumiskohtien lähes täydellinen päällekkäisyys (96%) kondenssiini I-IDC: n kanssa X-kromosomissa tukee yhteisten mekanismien olemassaoloa eri kondenssiinien kromosomisitoutumiselle. Koska condensiini II ja SCC-2 ovat sitoutuneet condensiinin IDC-rekrytointisivustoihin X: llä (Kuva 5D ja Lisätiedosto 9): Kuva S5D), oletimme, että condensiinin IDC rekrytoijat rekrytoivat myös condensiinin II ja SCC-2. Hermafrodiittispesifinen kondensiini-IDC: n rekrytointi X-kromosomiin saadaan aikaan SDC-2: lla, SDC-3: lla ja DPY-30: llä . Suoritimme HCP-6: n ja KLE-2: n (condensiini II), DPY-26: n (condensiini I-IDC) ja SCC-2-siru-seq: n sdc-2 null-mutanttialkioilla. Sdc-2-mutantissa DPY-26, HCP-6, KLE-2 ja SCC-2-Sidonta poistettiin X-spesifisellä kondensiini IDC-rekrytointipaikalla (rex-2) (Kuva 5E). On epäselvää, miksi HCP-6: n ja KLE-2: n sitoutuminen Rex-2: ssa väheni sen sijaan, että se muistuttaisi autosomaalista kondensiinipaikkaa. SCC-2: n sitoutuminen AUTOSOMEIHIN ja SDC-2: sta riippumattomiin X-kromosomin kohtiin pysyi samanlaisena sdc-2-mutanteilla verrattuna kohtiin, joihin SDC-2 sitoutui (Kuva 5F). Tuloksemme viittaavat siihen, että SDC-2, hermafrodiittispesifinen TF, joka värvää condensiinin IDC: n X-kromosomiin, värvää myös condensiinin II: n ja cohesiinin lastauskompleksin alayksikön SCC-2: n samoihin paikkoihin (Lisätiedosto 10: Kuva S6). Aiemmissa geneettisissä tutkimuksissa on todettu, että sdc-2-null-mutaatio ei aiheuta alkiokuolleisuutta uroksilla, joten kondensiini II: n ja SCC-2: n rekrytointi SDC-2: n toimesta ei ole välttämätöntä kromosomien yleisen tiivistymisen ja erottelun kannalta . On mahdollista, että SCC-2: lla ja kondensiini II: lla on hermafrodiittispesifinen geenisäätelytehtävä SDC-2: lla.

testataksemme, onko SCC-2: lla vaikutusta kondensiini-IDC: n kromosomiyhdistelmään rekrytointipaikalla, teimme kvantitatiivisen PCR-analyysin DPY-27-sirusta kontrollissa SCC-2 knockdown-alkioihin. Syöttämällä RNAi: ta pystyimme kaatamaan SCC-2: n tasot noin 80%: lla (Lisätiedosto 9: Kuva S5E). SCC-2 knockdownin yhteydessä DPY-27: n sidonnassa Rex-1: ssä tai rex-2: ssa ei tapahtunut merkittävää muutosta (Kuva 5G). Johdonmukaisesti immunofluoresenssianalyysi kondensiini I: n ja II: n sitoutumisesta meioottisiin kromosomeihin ei osoittanut merkittävää eroa villityypin ja scc-2-mutanttien välillä .