Getting CLARITY: Hydrogel process creates transparent brain
CLARITY process: interview with Stanford bioengineer and psychiatrist Karl Deisseroth. Pituus: 3:58
“ehjien systeemien tutkiminen tällaisella molekyyliresoluutiolla ja maailmanlaajuisella laajuudella – pystyäkseen näkemään hienot yksityiskohdat ja kokonaiskuvan samaan aikaan-on ollut biologiassa suuri saavuttamaton tavoite, ja tavoite, johon selkeys alkaa puuttua”, deisseroth sanoi.
“tämä kemiantekniikan taidonnäyte lupaa muuttaa tapaa, jolla tutkimme aivojen anatomiaa ja sitä, miten sairaus muuttaa sitä”, sanoi Yhdysvaltain mielenterveysinstituutin johtaja Thomas Insel. “Kaksiulotteiset menetelmät eivät enää rajoita tärkeimmän kolmiulotteisen elimemme syvällistä tutkimista.”
Intact adult mouse brain before and after the two-day CLARITY process. Oikealla olevassa kuvassa aivojen hienojakoiset rakenteet näkyvät heikosti, kun sanojen “numero”, “tutkimaton”, “Manner” ja “venyy.”
tämän tutkimuksen tutkimus tehtiin pääasiassa hiiren aivoilla, mutta tutkijat ovat käyttäneet selkeyttä seeprakaloihin ja säilyneisiin ihmisaivonäytteisiin, joiden tulokset ovat samankaltaisia, ja luoneet polun tuleviin tutkimuksiin ihmisnäytteistä ja muista eliöistä.
“selkeys lupaa mullistaa käsityksemme siitä, miten paikalliset ja globaalit muutokset aivojen rakenteessa ja toiminnassa muuttuvat käyttäytymiseksi”, sanoi Paul Frankland, joka on neurotieteiden ja mielenterveyden vanhempi tutkija torontolaisessa sairaiden lasten tutkimuslaitoksessa, joka ei ollut mukana tutkimuksessa. Franklandin kollega, vanhempi tutkija Sheena Josselyn, Ft, lisäsi, että prosessi voi muuttaa aivot “salaperäisestä mustasta laatikosta” joksikin olennaisesti läpinäkyväksi.
tutkimaton paikka
mutkikkaan harmaan aineen ja johtojen muodostama kumpu, joka on aivot, on monimutkainen ja tutkimaton paikka. Neurotieteilijät ovat kamppailleet täysin ymmärtää sen piiri heidän pyrkimys ymmärtää, miten aivot toimii, ja miksi, joskus, se ei.
Karl Deisseroth
selkeys on tulosta Deisserothin laboratoriossa tehdystä tutkimustyöstä, jossa läpinäkymättömiä alkuaineita — erityisesti lipidejä — pyrittiin poistamaan aivoista ja kuitenkin pitämään tärkeät piirteet täysin koskemattomina. Lipidit ovat rasvamolekyylejä, joita on kaikkialla aivoissa ja kehossa. Erityisesti aivoissa ne auttavat solukalvojen muodostamisessa ja antavat aivoille suuren osan sen rakenteesta. Lipidit aiheuttavat kuitenkin kaksinkertaisen haasteen biologiselle tutkimukselle, koska ne tekevät aivoista suurelta osin läpäisemättömät sekä kemikaaleille että valolle.
neurotieteilijät olisivat halunneet purkaa lipidit paljastaakseen aivojen hienojakoisen rakenteen ilman viipalointia tai lohkeilua, mutta yksi suuri ongelma: näiden rakenteellisesti tärkeiden molekyylien poistaminen saa jäljelle jäävän kudoksen hajoamaan.
Ennakkotutkimuksissa on keskitytty sen sijaan viipalointi – /lohkomismenetelmän automatisointiin tai aivojen käsittelemiseen orgaanisilla molekyyleillä, jotka helpottavat vain valon läpäisyä, mutta eivät makromolekyylikoettimia. Selkeyden vuoksi deisserothin tiimi on ottanut oleellisesti erilaisen lähestymistavan.
“käytimme kemiallista tekniikkaa muuttaaksemme biologisen kudoksen uuteen tilaan, joka on ehjä, mutta optisesti läpinäkyvä ja läpäisevä makromolekyyleille”, sanoi Chung, lehden ensimmäinen kirjoittaja.
tämä uusi muoto syntyy korvaamalla aivojen lipidit hydrogeelillä. Hydrogeeli rakentuu aivojen sisältä käsin käsitteellisesti samanlaisessa prosessissa kuin kivettyminen, käyttäen aluksi vetistä suspensiota lyhyistä yksittäisistä molekyyleistä, joita kutsutaan hydrogeelimonomeereiksi. Ehjät, kuoleman jälkeiset aivot upotetaan hydrogeeliliuokseen, ja monomeerit infusoivat kudoksen. Kun monomeerit sitten” lämpiävät ” eli kuumenevat hieman suunnilleen ruumiinlämpöön, ne alkavat jähmettyä pitkiksi molekyyliketjuiksi, jotka tunnetaan polymeereinä, muodostaen verkon koko aivoihin. Tämä verkko pitää kaiken koossa, mutta mikä tärkeintä, se ei sitoudu lipideihin.
kun kudos on tukittu tällä tavalla, ryhmä pystyy voimakkaasti ja nopeasti uuttamaan lipidejä elektroforeesiksi kutsutun prosessin avulla. Jäljelle jää 3D, läpinäkyvät aivot kaikkine tärkeine rakenteineen – hermosoluineen, aksoneineen, dendriiteineen, synapseineen, proteiineineen, nukleiinihappoineen ja niin edelleen – ehjinä ja paikoillaan.
Going things one better
CLARITY then goes one better. Säilyttäessään hermorakenteiden täyden jatkuvuuden selkeys ei ainoastaan mahdollista yksittäisten hermoyhteyksien jäljittämistä pitkillä etäisyyksillä aivojen läpi, vaan tarjoaa myös tavan kerätä solun toimintaa kuvaavaa rikasta molekyylitietoa, joka ei ole mahdollista muilla menetelmillä.
“ajattelimme, että jos voisimme poistaa lipidit rakenteettomasti, voisimme saada sekä valon että makromolekyylit tunkeutumaan syvälle kudokseen, mikä mahdollistaisi 3-D-kuvantamisen lisäksi myös ehjien aivojen 3-D-molekyylianalyysin”, sanoi Deisseroth, joka pitää D. H. Chenin professuuria.
käyttämällä fluoresoivia vasta-aineita, joiden tiedetään etsivän ja kiinnittyvän vain tiettyihin proteiineihin, deisserothin ryhmä osoitti, että se voi kohdistaa tiettyjä rakenteita selkeyden — muunneltuihin — tai “kirkastettuihin” – hiiren aivoihin ja saada nämä rakenteet ja vain nuo rakenteet syttymään valaistuksessa. Tutkijat voivat jäljittää hermopiirejä koko aivojen läpi tai tutkia syvällisesti paikallisten piirien johdotusten vivahteita. He näkevät solujen väliset suhteet ja tutkivat solujen alirakenteita. He voivat jopa tarkastella proteiinikompleksien, nukleiinihappojen ja välittäjäaineiden kemiallisia suhteita.
a three-dimensional rendering of clarified brain imaged from below (ventral half). Ohilentovideo jyrsijän aivoista löytyy täältä.
“kyky määrittää molekyylirakenne eri solujen ja niiden kontaktien kautta vasta värjäystä on ydin kyky selkeys, erillinen optinen läpinäkyvyys, jonka avulla voimme visualisoida suhteita aivojen komponenttien pohjimmiltaan uusilla tavoilla,” sanoi Deisseroth, joka on yksi 15 asiantuntijaa “dream team”, joka kartoittaa tavoitteita $100 miljoonaa aivotutkimusaloite ilmoitti 2.huhtikuuta presidentti Obama.
ja vielä yksi merkittävä kyky tutkimuksen kannalta, tutkijat pystyvät nyt poistamaan kirkastuneet aivot huuhtelemalla fluoresoivat vasta-aineet ja toistamalla värjäytymisprosessin uudelleen käyttämällä eri vasta-aineita tutkiakseen eri molekyylikohteita samoissa aivoissa. Tämä värjäys/värinpoisto prosessi voidaan toistaa useita kertoja, kirjoittajat osoittivat, ja eri tietokokonaisuudet linjassa keskenään.
oven avaaminen
selkeys on näin ollen mahdollistanut erittäin yksityiskohtaisen, hienorakenteisen analyysin ehjistä aivoista – jopa ihmiskudoksista, jotka ovat säilyneet useita vuosia, työryhmä osoitti. Ihmisaivojen muuttaminen läpinäkyviksi mutta vakaiksi näytteiksi, joissa on helposti johdotus ja molekyylitason yksityiskohdat, voi parantaa aivojen toiminnan ja sairauksien rakenteellisten perusteiden ymmärtämistä.
Three-dimensional view of stained hippokampus showing fluorescent-expressing neurons (green), connecting interneurons (red) and supporting glia (blue).
neurotieteen välittömän ja näennäisen hyödyn lisäksi deisseroth varoitti, että selkeys on edistänyt kykyämme käsitellä tietoja. “Massiivisten tietomäärien muuttaminen hyödylliseksi oivallukseksi aiheuttaa valtavia laskennallisia haasteita, joihin on puututtava. Meidän on kehitettävä parempia laskennallisia lähestymistapoja kuvan segmentointiin, 3-D-kuvan rekisteröintiin, automaattiseen jäljitykseen ja kuvan hankintaan”, hän sanoi.
tällaiset paineet todellakin lisääntyvät, kun selkeys voisi alkaa tukea laajamittaisten ehjien biologisten järjestelmien ja elinten, ehkä jopa kokonaisten eliöiden, syvempää ymmärtämistä.
“tulevaisuuden tutkimuksen kannalta erityisen kiinnostavia ovat järjestelmän sisäiset suhteet, ei ainoastaan nisäkkäiden aivoissa, vaan myös muissa kudoksissa tai sairauksissa, joiden täydellinen ymmärtäminen on mahdollista vain silloin, kun voidaan tehdä perusteellinen analyysi yksittäisistä, ehjistä järjestelmistä”, deisseroth sanoi. “Selkeys voi olla sovellettavissa mihin tahansa biologiseen järjestelmään, ja on mielenkiintoista nähdä, miten muut biologian haarat voivat käyttää sitä.”
muita kirjoittajia ovat ylioppilas Jenelle Wallace; jatko studentsSung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin ja Logan Grosenick; tutkimusavustajat Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak ja Charu Ramakrishnan; tutkijatohtorit Aaron Andalman, PhD, ja Tom Davidson, PhD; entinen perustutkintoa opiskelija Hannah Bernstein; ja entinen henkilökunta tiedemies Viviana Gradinaru.
tutkimusta tukivat National Institute of Mental Health (Grant MH099647), National Science Foundation, Simons Foundation, Stanfordin yliopiston rehtori ja rehtori; Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby ja Yu säätiöt, DARPA korjausohjelma, ja Burroughs Wellcome rahasto.
Stanfordin biotekniikan laitos tuki myös työtä. Laitosta operoivat yhdessä Teknillinen korkeakoulu ja lääketieteellinen korkeakoulu.
