heterokromatiinin stabilointi kellolla edistää kantasolujen nuorentumista ja ruston uudistumista

vasta-aineet

Western blotting: anti-CLOCK (#5157, 1:1000), anti-HP1a (#2616s, 1:1000) ja anti-HP1y (#2619, 1:3000) solun signalointiteknologiasta; Anti-kap1 (Ab22553, 1:2000), Anti-lamiini B1 (ab16048, 1:1000) ja anti-LBR (Ab32535, 1:1000) abcam:sta; anti-β-aktiini (SC-69879, 1: 3000) Santa Cruzin bioteknologiasta.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) R&D-järjestelmistä.

virtaussytometria: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (bd Biosciencesin 560198, 1:200), Anti-cd45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) ja anti-CD19 (555415, 1:200); Anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) ja anti-pDPN (17-9381-42, 1:200) ebiosciencestä (San Diego, CA, USA); Anti-cd29 (303004, 1:200) ja anti-cd13 (301705, 1:200), anti-cd166 (343903, 1:200) ja anti-CD164 (324805, 1:200) biolegendistä (San Diego, CA, USA).

soluviljelmä

CLOCK+/+ HECS (HECS, linja H9, WiCell Research Institute) ja CLOCK−/− HECS säilyivät syöttöainekerroksissa, jotka koostuivat mitomysiini C-inaktivoiduista hiiren alkion fibroblasteista (mefs) hESC-viljelyalustassa. HESC – viljelyaine sisälsi DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM epäolennaisia aminohappoja (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM β-merkaptoetanoli (Thermo Fisher Scientific), 1% penisilliini/streptomysiini (Thermo Fisher Scientific) ja 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Vaihtoehtoisesti hesc: t viljeltiin Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-pinnoitetuilla levyillä mTeSR Mediumissa (Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada).

sekä hmsc-johdettuja että primaarisia hmscs: iä säilytettiin MSC-väliaineessa, joka sisälsi Memaa (Thermo Fisher Scientific) täydennettynä 10% fetal bovine serumilla (FBS) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0, 1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penisilliiniä/streptomysiiniä (Thermo Fisher Scientific) ja 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR/Cas9-välitteinen geenieditointi HECS

CRISPR/Cas9-välitteinen geenieditointi tehtiin aiemmin kuvatuilla menetelmillä, joihin tehtiin joitakin muutoksia.33,34,65 lyhyesti sanottuna kellon eksonia 5 (CLOCK-gRNA) ohjaava RNA kloonattiin gRNA-kloonausvektoriksi (#41824, Addgene) (lisätietoja, taulukko S1). Kun KIVENESTÄJÄÄ Y-27632 (S1049, Selleck) käsiteltiin 24 tunnin ajan, HECS (5 × 106) suspendoitiin uudelleen 100 µL Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) sisältävään plasmidicocktailiin, joka koostui luovuttavasta plasmidista, joka sisälsi homologiahaarat, CLOCK-gRNA ja hCas9 (#41815, Addgene), ja elektrolysoitiin 4D-Nukleofektorijärjestelmään (Lonza). Tämän jälkeen solut kylvettiin MEF-syöttösoluihin. G418 (100 µg/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) lisättiin positiivisen valinnan aloittamiseksi 2-4 päivää elektroporaation jälkeen. Kahden viikon valinnan jälkeen G418-resistentit kloonit poimittiin ja siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle karakterisointia ja laajentamista varten. Genomisessa PCR: ää ja western blottingia käytettiin genomiseen muokkaustunnistukseen. Lisäksi poistimme NEOMYSIINIRESISTENSSIKASETIN CLOCK – / – hecsissä elektroporaatiolla pCAG-FLpo-2a-puro-vektorilla. Kolme päivää transfektion jälkeen puromysiiniä (Thermo Fisher Scientific) käytettiin 1 µg/mL puromysiiniresistenttien solujen rikastamiseen 48 tunnin ajan. 8-12 päivän valinnan jälkeen uudet pesäkkeet poimittiin ja laajennettiin myöhempää tutkimusta varten.

hMSC-sukupolvi ja luonnehdinta

hMSCs erotettiin HECS: stä aiemmin julkaistun protokollan mukaisesti.25,86,87 lyhyesti, HECS dissosioitiin embryoidisiksi elimiksi (EBs) ja hoidettiin erilaistumisväliaineella (MEMa (Invitrogen) täydennettynä 10%: lla FBS: ää (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mm Neaas (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß ja 1% penisilliini/streptomysiini (Gibco)) Matrigel-pinnoitetuilla levyillä 10 päivän ajan, kunnes 95% yhtymäkohta. Seuraavaksi yhdistetyt MSC: n kaltaiset solut pilkottiin ja pinnoitettiin Matrigel-pinnoitetuille levyille, jotka oli käsitelty MSC-viljelyalustalla, joka sisälsi Memaa (Invitrogenia) täydennettynä 10% FBS: llä, 0,1 mM Neaas: lla, 1 ng/mL bFGF: llä ja 1% penisilliiniä/streptomysiiniä (Gibco). Sitten yhdistetyt MSC: n kaltaiset solut siirrettiin gelatiinipäällysteisille levyille. HMSCS puhdistettiin erilaisilla vasta-aineilla, jotka vastasivat HMSC-spesifisiä markkereita (CD73, CD90 ja CD105) FACS: n toimesta. Kolmoispositiivisille cd73 -, CD90-ja CD105-soluille oli ominaista pinta-antigeenimarkkerit, mukaan lukien positiiviset markkerit, kuten CD44, CD166, CD29, HLA-ABC ja CD13, ja negatiiviset markkerit, kuten CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 ja PDPN. HMSCs: n toimivuutta todennettiin myös erilaistumalla kondrosyytteihin, adiposyytteihin ja osteoblasteihin. Hmscs: stä johdetuille osteoblasteille, kondrosyyteille ja adiposyyteille oli ominaista von Kossa-värjäys (gms 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) ja osteokalsiinivärjäys (osoittaa osteogeneesiä), toluidiinisininen (T3260, Sigma) ja aggrecan-värjäys (osoittaa kondrogeneesia) ja Öljypunainen O (O1391, Sigma) – värjäys (osoittaa adipogeneesiä) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

primaaristen hmsc: iden eristäminen ja viljely

primaariset Hmsc: t eristettiin eri yksilöiden ikenistä.23,33,34,65 ikenestä erotetut kudokset leikattiin pieniksi (1 mm2) paloiksi saksilla tryple™ Express Enzyme (1 ×) plus Dispase IV-entsyymillä ja inkuboitiin edelleen 37 °C: ssa 30 minuutin ajan. Pilkottu kudossuspensio neutraloitiin MSC-viljelyalustalla ja sentrifugoitiin 200 × g: n kokoon 5 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tuloksena olevat pelletit suspendoitiin uudelleen MSC-viljelyaineeseen, joka sisälsi Memaa (Invitrogen) täydennettynä 10% FBS: llä (Gibco), 1 ng/mL bFGF: llä ja 1% penisilliini/streptomysiinillä (Gibco) ja pinnoitettiin gelatiinipäällysteisille levyille primaaristen hMSCs: ien kasvua varten.

Luciferase reporter assay

PER2-dLuc-plasmidi oli E. E. Zhangilta saatu ystävällinen lahja.88 solua, joissa on PER2-dLuc, kasvatettiin yhtymäkohtaan 24-well-viljelmälevyissä ja synkronoitiin 20 µM forskoliinin (S2449, Selleck) kanssa 2 tuntia. väliaine korvattiin sitten MSC-viljelmälevyllä, joka sisältää 0,25 mM luciferin (LUCK-1g, GoldBio). Soluja tarkkailtiin LumiCycle luminometrillä 37 °C: ssa 5-7 päivän ajan; saadut tiedot analysoitiin LumiCycle Analysis software (Actimetrics) – ohjelmalla. Ensimmäisen 24 tunnin jakson tiedot jätettiin tilastollisen analyysimme ulkopuolelle.

In vitro hMSC-synkronointi-ja vuorokausianalyysi

hMSCs: ää pinnoitettiin gelatiinipäällysteisillä levyillä MSC-väliaineella, kunnes 95% yhtymäkohta. Synkronointia varten soluja sitten käsiteltiin 20 µM forskoliinia 2 tuntia ja uudelleen tallennettu MSC keskipitkällä pesun jälkeen kahdesti PBS. Soluja kerättiin alkaen 24 tunnin jälkisynkronoinnista 3 tunnin välein 9 aikapisteen ajan, minkä jälkeen seurasi RNA-uutto ja RT-qPCR-detektio. Nonparametric-testiä JTK_CYCLE käytettiin aiemmin kuvatulla tavalla vuorokausirytmin värähtelyjen todentamiseen.89 Hmscs: n Ajankulkuketjua, joiden p-ja q-arvot olivat < 0.05, pidettiin rytmikkäinä.

Western blotting

solut lysättiin SDS-puskuriin, joka sisälsi 4% SDS: ää ja 100mm Tris-HCl: ää. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä BCA-määrityspakettia (Thermo Fisher Scientific), ja ~20 µg proteiinia näytettä kohti altistettiin SDS-Pagelle ja elektransferoitiin PVDF-kalvoille (Millipore). Sitten kalvot tukittiin 5% maidolla ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja sitten piparjuuriperoksidaasi (HRP) – konjugoiduilla sekundaarisilla vasta-aineilla. Immunoreaktiiviset bändit visualisoitiin chemidoc XRS+ – järjestelmässä (Bio-Rad). Tilastolliset analyysit kvantifioi Image J software (NIH). Jokaisella ryhmällä oli kolme itsenäistä koetta. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

Siirtoelektronimikroskopia

Myöhäiskulkuelektronimikroskopia (P9) CLOCK+/+ ja CLOCK-/− HMSCS kerättiin entsymaattisesti Tryplellä (Thermo Fisher Scientific) ja sentrifugoitiin 500 × g: n lämpötilassa 5 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tuloksena pelletit oli kiinnitetty 4% paraformaldehydiä (PFA) PBS (pH 7.4) jäällä yön yli. Tämän jälkeen solut dehydratoitiin luokiteltuun etanolisarjaan, joka oli permeabiloitu ja upotettu Lowikryylihartsi HM20: een. Osat (200 nm) saatiin ja kuvattiin 100 kV: n teholla toimivalla Spirit transmission-elektronimikroskoopilla (Fei Company).

Immunofluoresenssivärjäys

coverslipsiin (Thermo Fisher Scientific) kylvetyt solut pestiin kahdesti PBS: llä. Sitten solut kiinnitettiin 4% PFA: lla 30 minuutin ajan, permeabiloitiin 0,4% Triton X-100: lla PBS: ssä 30 minuutin ajan ja estettiin 10% aasinseerumilla PBS: ssä (Jackson Immuno Research) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Salpauksen jälkeen soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 °C: ssa yön yli. Tämän jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, inkuboitiin sekundaarisilla vasta-aineilla huoneenlämmössä 1 tunnin ajan ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Ytimet värjättiin Hoechst 33342: lla (H3570, Thermo Fisher Scientific). Kuvantaminen tehtiin Leica SP5 confocal-järjestelmällä. Image J software (nih) määritti fluoresenssisignaalien määrän, voimakkuuden ja pinta-alan tilastollisen analyysin. Soluja kerättiin kolmesta biologisesta jäljennöksestä. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä. 3D jälleenrakennus H3K9me3 värjäystä kuten kuvassa. 2f suoritettiin Z-stack section-sarjalla 50 nm: n välein tavanomaisessa tilassa jopa 50 kuvalle Leica SP5 confocal-järjestelmällä ja imaris software (versio 7.4.2) jatkojalostettiin 3D-rekonstruktioon edellä kuvatulla tavalla.90

SA-β-gal-värjäysmääritys

SA-β-gal-värjäysmenetelmää tehtiin aiemmissa tutkimuksissa kuvatulla tavalla.33,34 lyhyesti, solut oli kiinnitetty kiinnityspuskurilla (2% formaldehydiä ja 0.2% glutaarialdehydiä) 5 min huoneenlämmössä. Sitten kiinteät solut värjättiin tuoreella värjäysliuoksella 37 °C: ssa yön yli. Kuvakentät valittiin satunnaisesti jokaiseen kaivoon, ja SA-β-Gal-positiivisten solujen prosenttiosuus määritettiin ImageJ-ohjelmiston avulla. Jokaisella ryhmällä oli kolme biologista toisintoa. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

klooninen laajenemismääritys

tehtiin aiemmin raportoidun mukainen klooninen laajenemismääritys.34,65 lyhyesti, 6000 solua kaivoa kohti kylvettiin 6-kaivolevyihin ja viljeltiin 9-12 päivää. Solut pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 4% PFA: lla ja värjättiin 0,2% kidevioletilla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Näkökentät skannattiin skannerilla ja mitattiin edelleen ImageJ Softwarella (nih). Jokaisella ryhmällä oli kolme biologista toisintoa. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

Co-IP

Hek293t-solut, joille oli siirretty Flag-Luc-tai Flag-CLOCK-ja Hmscs-plasmideja, lysoitiin CHAPS lysis-puskuriin (120 mM NaCl, 0.3% LEUKALIHOJA, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) ja täydellinen proteaasinestäjäcocktail (Roche)) 4 °C: ssa 4 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä sentrifugoitiin 14 500 × g: n lämpötilassa 4 °C: ssa 40 minuutin ajan. Kun kyseessä oli ko-IP eksogeenisten proteiinien kanssa, supernatantit sekoitettiin anti-Flag-vasta-aineisiin kytkettyihin helmiin (A2220, Sigma) ja pyöritettiin yön yli 4 °C: ssa.endogeenisten proteiinien kanssa Ko-IP: ssä supernatantit sekoitettiin ilmoitettuihin vasta-aineisiin yön yli 4 °C: ssa pyörimisen yhteydessä, minkä jälkeen niitä inkuboitiin proteiini A/G-Plus Agaroosihelmillä (SC-2003, Santa Cruz) vielä 4 tunnin ajan 4 °C: ssa pyörimisen yhteydessä. Helmet pestiin kuusi kertaa CHAPS-puskurilla ja eluoitiin sitten Lippupeptideillä tai keittämällä 1× SDS-lastauspuskurissa 10 minuutin ajan western blottingia varten.

LC-MS / MS-analyysi ja proteiinin tunnistaminen

immunopresiitaatiolla saadut eluoidut proteiinit altistettiin 10-prosenttiselle SDS-Pagelle ja värjättiin Coomassie briljanttisinisellä (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Proteiininäytteitä sisältävät geelinauhat poistettiin, leikattiin pieniksi tulpiksi, dehydratoitiin (100% asetonitriiliä), pelkistettiin (10 mM DTT 25 mM NH4HCO3: ssa 45 min 56 °C: ssa) ja alkyloitiin (40 mM jodiasetamidi 25 mM NH4HCO3: ssa 45 min huoneenlämmössä pimeässä). Seuraavaksi geelitulpat kuivattiin ja pilkottiin sekvensointikykyisellä modifioidulla trypsiinillä (40 ng / kaista) 25 mM nh4hco3: ssa yön yli 37 °C: ssa.lopuksi entsymaattisen reaktion päätti muurahaishappo, jonka lopullinen pitoisuus oli 1%. Saatu liuos siirrettiin sitten näytepulloon LC-MS / MS-analyysiä varten.

nanoLC-MS/MS-kokeet suoritettiin Q-Eksaktisella massaspektrometrillä (Thermo Scientific) datasta riippuvaisessa tilassa, joka mahdollisti MS-tiedonhankinnan suurella 70 000 (m/z 200) resoluutiolla m / z alueella 300-1 600. Raakadata Q Exactive analysis analysoitiin Proteome Discovery (versio 1.4) käyttäen Sequest HT search engine proteiinin tunnistaminen ja perkolaattori false discovery rate (FDR) analyysi. Tiedot haettiin uniprot human protein database-tietokannasta (päivitetty 06-2013). FDR-analyysi tehtiin Perkolaattorilla, ja FDR < 1% asetettiin proteiinin tunnistamisen kynnysarvoksi. Peptidien luottamusväli asetettiin korkealle peptidisuodatuksessa.

RT-qPCR ja RNA-Seq

kokonais-RNA uutettiin viljellyistä ihmissoluista tai hiiren nivelistä Trizolin (Thermo Fisher Scientific) avulla, ja genominen DNA poistettiin DNA-vapaan pakkauksen (Thermo Fisher Scientific) avulla. cDNA luotiin Go Script Reverse transkription Systemillä (Promega). RT-qPCR suoritettiin käyttämällä qPCR Mix (Toyobo) CFX384-Reaaliaikajärjestelmässä (Bio-Rad). Jokaisella ryhmällä oli neljä hyvää kopiota. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä. Kaikki RT-qPCR-kokeet tehtiin vähintään kolmella kokeellisella toistolla ja toistettiin itsenäisesti vähintään kaksi kertaa. Hiiren nivelen RNA-seq: n osalta polvinivelen RNA-näytteet samasta hoitoryhmästä, jossa oli iäkästä hiirtä, joille oli ruiskutettu Lentiviruksia, jotka ilmentivät Luc: tä (n = 12 hiirtä) tai kelloa (n = 12 hiirtä), sekoittuivat massaltaan yhtä paljon, ja RNA-seq tehtiin kahdella teknisellä replikaatiolla. Hmsc-RNA-seq: n osalta tutkittiin kaksi biologista toisintoa. Sekvensointikirjasto rakennettiin käyttäen Nebnext Ultra RNA Library Prep-pakettia Illuminaa varten valmistajan protokollan mukaisesti. Generoidut kirjastot sekvensoitiin Illumina HiSeq X-Ten-alustoilla paripääteisellä sekvensoinnilla 150 bp: n lukupituudella. Laadunvalvonta ja sekvensointi suoritettiin NoVo-geenien Bioinformatiikkatekniikalla. QPCR: ssä käytetyt alukkeet on esitetty lisätiedoissa taulukossa S2.

RNA-seq-tietojenkäsittely

RNA-seq-tietojenkäsittelyputkea on raportoitu aiemmin.34 Raw-paripäätyistä lukua karsittiin Trim Galore-ohjelmistolla (versio 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Puhtaat lukemat kartoitettiin UCSC: n ihmisen hg19-genomiin tai hiiren mm10-genomiin hisat2: n avulla (versio 2.0.4).91 sam-tiedostot muunnettiin Bam-tiedostoiksi Samtoolsilla parametrilla”- s-b-q 10″.92 tämän jälkeen lukuluvut laskettiin htseq: n avulla (versio 0.11.0), ja vain laadukkaat kartoitetut lukemat (kartoituslaatu > 20) säilyivät.93 fragmentit per Kilobase per Million (FPKM) arvo kunkin geenin laskettiin käyttäen StringTie (versio 1.2.3).94 Differentially expressed genes (DEGs) laskettiin käyttämällä DESeq2-pakettia (versio 1.22.2), jossa raja-arvo “q-arvo (adjusted p-arvo, padj) < 0, 05 ja |log2 (fold change)| > 1 hmscs: lle tai |log2 (fold change)| > 0, 5 hiiren liitoksille”. Toppgenella tehtiin Gene Ontology (GO) – rikastusanalyysi.95 Geenijoukon rikastusanalyysin suoritti GSEA (versio 2.2.4). SASP-geenijoukko saatiin aiemmasta tutkimuksesta.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam ja pLgw EcoDam-V5-EMD olivat lahjoja professori Bas van Steenseliltä (Netherlands Cancer Institute, NKI). DamID-seq suoritettiin kuvatulla tavalla, 58 muutoksineen. Lyhyesti sanottuna Hek293t-soluista syntyvät pato-ja EMD-LENTIVIRUKSET konsentroitiin ultracentrifugoimalla 19 400× g 2,5 tunnin ajan. viruspelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään. CLOCK+/ + ja CLOCK−/− hMSCs kylvettiin kuuden kaivon astioihin 2 × 105 solua kaivoa kohti. Jokaisella ryhmällä oli kolme biologista toisintoa. Seuraavana päivänä viljelyaine korvattiin 2 mL: lla tuoretta viljelyainetta, joka sisälsi joko Dam-tai Dam-EMD lentivirusta. 72 tunnin kuluttua transduktiosta solut kerättiin talteen ja genominen DNA eristettiin käyttämällä DNeasy Blood & Tissue Kit (69504, Qiagen). DPNI (R0176S, New England Biolabs) digestio, adapteri ligaatio, DpnII (R0543S, New England Biolabs) digestio, PCR-vahvistus ja puhdistus suoritettiin edellä kuvatulla tavalla.58 adapterin leikkaamista varten monistettu DNA sonikoitiin ja sulatettiin alwilla (R0513S, New England Biolabs). DNA-kirjasto rakennettiin käyttäen Nebnext Ultra DNA Library Prep Kit Illumina (E7370S, New England Biolabs). Kirjastot yhdistettiin ja niille tehtiin pariloppuinen sekvensointi 150 bp: n lukujonoilla Illumina NovaSeq-sekvenssereillä.

DamID-seq data processing

CLOCK+/+ ja CLOCK-/− HMSCS: n Dam− ja Dam-EMD-tietojen Raakalukemat trim Galore-ohjelmistossa (versio 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmatut lukemat kartoitettiin UCSC: n ihmisen hg19-genomiin Bowtie 2: n avulla (versio 2.2.9).96 PCR-kaksoiskappaletta poistettiin Markduplikaateilla.jar-ohjelma Picard-työkaluissa. Sitten, lukee lajiteltiin SAMtools (versio 1.6). Sekvensointiharhojen ja syvyyden minimoimiseksi jokaisesta näytteestä yhdistettiin kolme toistoa. Sitten sama määrä (110 miljoonaa) laadukkaita lukemia kullekin solutyypille valittiin satunnaisesti jatkoanalyysiin. Damid-signaalien visualisoimiseksi laskimme Dam-EMD: n ja Dam-signaalien (log2 (Dam− EMD/Dam)) log2− suhteen KILOBAASIA ja Miljoonaa kartoitettua lukua kohti (RPKM) CLOCK+/+ ja CLOCK-/-HMSCS: ssä kullekin 10-bp bin BIN käyttäen bamcompare-ohjelmaa deeptoolsissa (versio 2.5.4-2-5ee467f).

Lad− alueiden tunnistamiseksi CLOCK+/+− ja CLOCK – / – HMSCS-ohjelmissa laskimme ensin Patosignaalit (log2-suhde Dam-EMD-ja Dam-signaalit (log2 (Dam-EMD/Dam)) CLOCK+/+− ja CLOCK−/-HMSCS-ohjelmissa kullekin 2 kb bin käyttäen bamcompare-ohjelmaa deepTools-ohjelmistossa (versio 2.5.4-2-5ee467f). Sitten, toteutimme R paketti piilotettu Markov malleja t päästöt (hmmt) (versio 0.1), tunnistaa LADs (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

VERRATAKSEMME Patosignaaleja LOD-alueilla CLOCK+/+ – ja CLOCK – /− hMSCs-alueilla yhdistimme LOD-alueet CLOCK+/+ – ja CLOCK−/ – HMSCS – alueilla unionin alueisiin ja laskimme suhteellisen DamID-signaalin (DamID− signaali CLOCK−/ – hMSCs miinus DamID-signaali CLOCK+/+ hMSCs-alueilla) kullekin Union LAD-alueelle. Tämän jälkeen LAD-alueiden suhteelliset Damidisignaalit piirrettiin käyttäen R-paketin Rideogrammia (versio 0.2.2), kuten on esitetty lisätiedoissa, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR ja ChIP-seq

lyhyesti, 1 × 106 CLOCK+/+ ja CLOCK−/− hMSCs risteytettiin 1%: ssa (vol/vol) formaldehydiä PBS: ssä 8 minuutin ajan huoneenlämmössä, ja reaktio päätettiin inkuboimalla 125 mM glysiinillä 5 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen näytteitä lysäytettiin jäällä vielä 10 minuuttia. Kun Covaris S220-ultrasonikaattori (covaris) oli sonikoitu ja sentrifugoitu 10 minuutin ajan 12 000 × g: n lämpötilassa 4 °C: ssa, supernatantteja inkuboitiin yön yli 4 °C: ssa Anti-KELLOVASTA-aineella, anti-H3K9ME3-vasta-aineella tai kani IgG: llä konjugoidulla proteiini A: lla (Thermo Fisher Scientific, 10004d). Tämän jälkeen eluutiota ja käänteistä ristisidontaa tehtiin 68 °C: n lämpötilassa 2 tunnin ajan termomikserissa. Sitten DNA eristettiin fenoli-kloroformi-isoamyylialkoholin uuttamisella ja etanolin saostamisella. Puhdistetulle DNA: lle tehtiin qPCR-testi kellon tai h3k9me3-miehityksen arviointia varten toistuvissa jaksoissa. Rikastetut fragmentit rakennettiin kirjastoihin ilman piikki-in-säätöjen sisällyttämistä KAPA Hyper Prep-pakkauksiin, joissa on PCR-kirjaston vahvistus / Illumina-sarja (KK8504, New England Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeet tehtiin vähintään kaksi kertaa samanlaisin tuloksin. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

ChIP-seq-tietojenkäsittely

h3k9me3-siru-seq-Datan käsittelyyn raw-lukemat trim Galore-ohjelmistolla (versio 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmatut lukemat kartoitettiin UCSC: n ihmisen hg19-genomiin Bowtie 2: n avulla (versio 2.2.9).96 kopioitua lukua poistettiin Markduplicateilla.jar-ohjelma Picard-työkaluissa. Sitten, lukee lajiteltiin SAMtools (versio 1.6). Sekvensointiharhojen ja syvyyden minimoimiseksi jokaisesta näytteestä yhdistettiin kolme toistoa. Sitten sama määrä (130 miljoonaa) laadukkaita lukemia kullekin solutyypille valittiin satunnaisesti jatkoanalyysiin. Chip-seq-signaalien visualisoimiseksi laskimme normalisoidut lukemat määrittämällä RPKM-arvot jokaiselle 10-bp bin bin: lle. H3k9me3 peak callingissa käytettiin siceriä (versio V1.1) parametrilla “-w 200-g 3”.98 vain niin sanottua h3k9me3-piikkiä, joiden FDR-raja oli 1% tai suurempi, säilytettiin.

“h3k9me3-vuorten” tunnistamiseksi laskettiin h3k9me3-signaali miljoonamäärinä (CPM) kullakin h3k9me3-huipulla. Sitten rankattiin h3k9me3 piikit järjestyksessä kasvaa h3k9me3 signaali ja piirrettiin H3K9ME3 siru-seq käyttöaste kello + / + ja kello−/− HMSCS, kuten on esitetty lisätietoja, Kuva. S4F. nämä tontit osoittivat selkeän kohdan, jossa h3k9me3: n käyttösignaali alkoi kasvaa nopeasti. Sitten määritettiin näiden käyrien taivutuspisteet. Määrittelimme edelleen h3k9me3-huiput taivutuspisteiden yläpuolella “h3k9me3-vuoriksi” ja h3k9me3-huiput näiden pisteiden alapuolella tyypillisiksi H3K9me3-huipuiksi.

ATAC-seq

ATAC-seq suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.99 lyhyesti sanottuna yhteensä 50 000 solua pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 50 µL: aan lysis-puskuria (10 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0, 1% (v/v) nonidet P40-korviketta). Ydinsuspensiota sentrifugoitiin 500 × g: ssa 10 minuutin ajan 4 °C: ssa, minkä jälkeen siihen lisättiin 50 µL transpositioreaktioseosta (10 µL 5 × TTBL-puskuria, 4 µL tte-seosta ja 36 µL nukleaasitonta H2O: ta) Trueprep-DNA-kirjaston Prep Kit V2-valmisteesta Illuminaa (Vazyme Biotech) varten. Tämän jälkeen näytteitä inkuboitiin 37 °C: ssa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen kirjastot monistettiin ja puhdistettiin käyttäen Trueprep-DNA-kirjaston Prep Kit V2-pakettia Illuminaa varten (Vazyme Biotech). Kirjaston laatua arvioitiin fragmenttianalysaattorin avulla. Lopulta kirjastot jaksotettiin Illumina HiSeq X-Ten-alustoille pariloppuisilla jaksotuksilla 150 bp: n lukupituuksilla.

ATAC-seq data processing

Atac-seq-tietojen käsittelyssä raw reading trim Galore-ohjelmalla (versio 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmatut lukemat kartoitettiin UCSC: n ihmisen hg19-genomiin Bowtie 2: n avulla (versio 2.2.9) parametrilla “-X 2000-N 1-L 25 –no-mixed –no-discordant-t”.96 kaksoiskappaletta poistettiin Markduplicatesin mukana.jar-ohjelma Picard-työkaluissa. Sitten, lukee lajiteltiin SAMtools (versio 1.6) ohjelmisto. Tämän jälkeen jokaisesta näytteestä yhdistettiin kolme toistoa. Atac-signaalien visualisoimiseksi pidensimme jokaista lukua 250 bp: llä ja normalisoimme lukuluvut RPKM: n arvolla jokaiselle 10 bp: n bin: lle. ATAC peak callingissa käytettiin macs2: ta (versio 2.1.1.20160309) parametrin “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”kanssa.100 vain niin sanottua ATAC-piikkiä, joiden q-arvo oli < 0, 01, säilyi. Atac-piikit, jotka yksilöitiin Clock+/+ – mutta ei CLOCK−/− HMSCS− järjestelmässä, määriteltiin “suljetuiksi” ATAC− piikeiksi; ATAC-piikit, jotka yksilöitiin CLOCK – / – – mutta ei CLOCK+/+ HMSCS-järjestelmässä, määriteltiin “avatuiksi” ATAC-piikeiksi. Käytettyjen ATAC-piikkien genomijakauman estimointi annotatePeaks.pl ohjelma homer software.101

sekvensointitietojen uusittavuuden arviointi

h3k9me3-siru-seq-ja ATAC-SEQ-tietojen uusittavuuden arvioimiseksi rinnakkaisnäytteiden välinen euklidinen etäisyys laskettiin seuraavasti: lukemat laskettiin ja normalisoitiin RPKM: llä 2 kb: n roskakoolla. Tämän jälkeen Euklidinen etäisyys laskettiin R: ssä (versio 3.5.1) uusittavuuden arvioimiseksi. Matalammat Euklidiset etäisyydet tarkoittavat korkeampia korrelaatioita. DamID-SEQ-tietojen toistettavuuden arvioimiseksi tehtiin pääkomponenttianalyysi (PCA) R-versiona (versio 3.5.1). RNA-seq-tietojen toistettavuuden arvioimiseksi piirrettiin scatter-käyrät regularisoidun logaritmin (rlog) normalisoidun lukumäärän perusteella DESeq2: lla ja laskettiin Pearsonin korrelaatiokerroin toistojen välillä.

eläinkokeet

teratooman muodostusanalyysi, Nod / SCID-hiiret (6-8 viikon ikäiset, ostettu Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) ruiskutettiin 3 × 106 CLOCK+/+ tai CLOCK−/− HECS-liuoksella Matrigel: mTeSR (1:4) – liuoksessa. Teratoomat korjattiin 8-12 viikon kuluttua injektiosta tarkempia analyysejä varten.

hmsc− elinsiirtomäärityksissä 1 × 106 CLOCK+/+ tai CLOCK−/ – hMSCs, jotka oli transdukoitu Lucia ilmentävillä lentiviruksilla, ruiskutettiin nakuhiirten (6-8 viikon ikäisiä) TA-lihakseen. Hiiriä hoidettiin D-luciferiinilla (LUCK-1g, GoldBio) ja kuvattiin IVIS Spectrum-kuvantamisjärjestelmällä (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Bioluminesenssikuvat hankittiin “auto” – tilassa. Jokaisella ryhmällä oli kuusi biologista kopiota. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

ikääntymiseen liittyvässä Kellotason määrityksessä eri-ikäiset hiiret (nuoret, 1 kuukausi, N = 5 hiirtä; Vanhat, 15 kuukautta, N = 10 hiirtä) lopetettiin ja nivelet kerättiin RT-qPCR-analyysiä varten. Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

sen arvioimiseksi, voisiko lentiviraalinen kellon antaminen lievittää ikääntymiseen liittyviä oireyhtymiä, 18 kuukauden ikäisten hiirten nivelonteloihin ruiskutettiin Lentiviruksia, jotka ilmentävät Lucia (n = 14 hiirtä) tai kelloa (n = 13 hiirtä) (ostettu SPF (Beijing) bioteknologiasta) ja niitä täydennettiin 8 viikon kuluttua injektiosta. Juoksumattokoe tehtiin 15 viikon kuluttua ensimmäisestä Lucia tai kelloa ilmentävien lentivirusten injektiosta. Tarkemmin sanottuna hiiriä koulutettiin juoksumatolla (SA101, SANS) 5°: n kaltevuudella 3 päivän aikana 20 minuutin ajan joka päivä nopeuden kiihtyessä 0: sta 20 m/min: iin. Testipäivänä hiiret juoksivat juoksumatolla alkunopeudella 0 m/min, minkä jälkeen nopeutta nostettiin 2 m/min 20 m / min. Koko juoksuajaksi määrättiin 20 min. Lievien sähköiskuärsykkeiden taajuus kirjattiin ja analysoitiin (Luc, n = 14 hiirtä; CLOCK, n = 13 hiirtä). Mikro-CT-skannaus tehtiin 16 viikon kuluttua ensimmäisestä injektiosta (Luc, n = 14 hiirtä; CLOCK, n = 13 hiirtä). Tämän jälkeen hiiret lopetettiin ja liitokset kerättiin histologista arviointia varten (Luc, n = 14 hiirtä; CLOCK, N = 13 hiirtä) ja mRNA-määritystä varten (Luc, n = 12 hiirtä; CLOCK, n = 12 hiirtä). Tilastollisia merkityksiä arvioitiin kaksihäntäisen parittoman opiskelijan t-testillä.

histologia ja immunohistokemia

histologisessa analyysissä kerätyt hiiren nivelet vahvistettiin 4%: lla PFA: sta 2 päivän ajan ja upotettiin parafiiniin kalsinoinnin jälkeen 14-21 päivän ajan. Kohdat (5 µm) värjättiin nopealla vihreällä FCF: llä (0,02%) ja safraniini O: lla (0.1%) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Immunohistokemiallinen värjäys tehtiin DAB-värjäysmenetelmällä, kuten aiemmin on kuvattu, tietyin muutoksin.33,34,102 ensin diat parafiinoitiin ja nesteytettiin ksyleenin ja erilaisten alkoholipitoisuuksien avulla. Antigeenin haku suoritettiin trypsiinin (ZLI-9010, ZSBB-BIO) digestiolla 20 minuutin ajan huoneenlämmössä. Vetyperoksidia (3%) käytettiin endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden estämiseen inkuboimalla 10 minuuttia huoneenlämmössä. Diat estettiin 10-prosenttisella aasiseerumilla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja inkuboitiin anti-P16-vasta-aineella (Ab54210, Abcam, 1:200) 4 °C: ssa yön yli ja toissijaisella vasta-aineella (PV-6002, ZSBB-BIO) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ennen DAB-värjäystä (ZLI-9017, ZSBB-BIO).

eettiset kannanotot

tähän tutkimukseen osallistuneet kokeet noudattivat eettisen hyväksynnän hakumuotoa koskevia periaatteita eläimiä koskevassa tutkimuksessa, ja Kiinan tiedeakatemian (Institute of Zoology) Institutional Animal care and Use Committee hyväksyi ne etukäteen. Hiirten nukutus tehtiin isofluraanilla ja eutanisaatio CO2: lla, jota seurasi kaularangan sijoiltaanmeno.

tilastoanalyysi

Tilastoanalyysit tehtiin Graph-Pad Prism-ohjelmistolla. Tiedot esitetään keskiarvoina ± sem tai SD. Vertailuja tehtiin kaksipyrstöttömällä opiskelijan t-testillä. P-arvo (p) < 0, 05 määriteltiin tilastollisesti merkitseväksi.