in Vitro kolloidisen hopean arviointi immuunitoiminnassa: antilymfoproliferatiivinen aktiivisuus

Abstrakti

kolloidinen hopea (AgC) on tällä hetkellä ihmisten käytössä, ja se voidaan sisäistää hengitysteitse, injektiona, nieltynä ja ihokosketuksessa. Immunologisesta aktiivisuudesta on kuitenkin vain vähän tietoa; tarvitaan lisää tutkimuksia kolloidisen hopean avulla. Tässä tutkimuksessa AgC: n (17.5 ng/mL) tutkittiin immunologisilla parametreilla (proliferaatio ja immunofenotyypin määritys) käyttäen ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisoluja (pbmc) ja makrofageja (fagosytoosi) sekä sytotoksisuutta leukemian ja lymfooman syöpäsolulinjoihin (1, 75-17, 5 ng/mL). AgC: n havaittiin merkitsevästi () vähentävän fytohemagglutiniinin tai konkanavaliini A: n aiheuttamaa interleukiini-2: n (IL-2) tuotantoa ja proliferaatiota PBMC: ssä vaikuttamatta sen solujen elinkykyyn, mutta vaikuttaen sytotoksisesti syöpäsoluihin. IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF-γ ja IL−17A sytokiinien tuotantoon ja CD3+, CD3-CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ ja CD16+CD56+ PBMC-fenotyyppeihin AgC ei vaikuttanut. Tämä tutkimus osoittaa, että kolloidinen hopea on vaaraton ja myrkytön immuunijärjestelmän soluille ja että sen kyky häiritä immuunivastetta vähentämällä solujen proliferaatiota mitogeeneillä stimuloitaessa osoitti AgC: n antilymfoproliferatiivisen potentiaalin.

1. Johdanto

aineiden bioaktiivisuus on seulottu sellaisten ominaisuuksien tunnistamiseksi, jotka liittyvät antitumoraaliseen tai antiproliferatiiviseen vaikutukseen . Tätä vaikutusta sisältäviä valmisteita on käytetty kliinisessä käytännössä syövän tai tulehdukseen liittyvien sairauksien, kuten autoimmuunisairauden, hoitoon. Hopeatuotteita on käytetty tuhansia vuosia hygieniaan ja mikrobilääkkeisiin. Vuodesta 1964 lähtien kolloidinen hopea (AgC) on rekisteröity biosidimateriaaliksi Yhdysvalloissa ; Meksikossa AgC: tä käytetään yleisesti veden ja elintarvikkeiden desinfiointiaineena . Yleensä nämä tuotteet ovat metallisten nanohiukkasten sekoitusta, jonka hapetustila on nolla (Ag+0) ja hopeasuolojen sekoitusta, jonka hapetustila on Ag+1, +2 tai +3 . On tutkimuksia, jotka osoittavat, että antibakteeriset ja antitumor-ominaisuudet riippuvat hopean hapettumistiloista . Hopeananopartikkelien (AgNPs) ja hopeaionien (Ag+) myrkyllisyys vaihtelee pinnallisten varausvuorovaikutustensa vuoksi. Hopeaionit ovat myrkyllisempiä, koska ne voivat olla vuorovaikutuksessa negatiivisten proteiiniryhmien kanssa tuottaen rakenteellisia muutoksia solukalvolla ja sytoplasmaproteiineilla, kun taas AgNPs voi olla vuorovaikutuksessa DNA: n kanssa aiheuttaen vaurioita ja rakenteellista estoa; jotkut tutkimukset ovat ehdottaneet, että nämä nanorakenteet voivat tuottaa lisääntynyttä myrkyllisyyttä pitkillä altistusajoilla johtuen siitä, että agnps vesiliuoksissa voi hapettaa ja vapauttaa hopeaioneja; kolloidisten hopealiuosten onnistunut käyttö voidaan selittää tämän toimintamekanismin avulla . AgC: n syöpäaktiivisuus MCF-7-syöpäsoluissa johtuu todennäköisesti laktaattidehydrogenaasin vähenemisestä ja superoksididismutaasiaktiivisuuden lisäämisestä aiheutuneesta apoptoosista; sen sijaan PBMC: ssä laktaattidehydrogenaasin aktiivisuus väheni AgC: n myötä, mutta se ei korreloinut solukuoleman kanssa . Ihmisen immunologisista ja syöpäparametreista on niukasti tieteellistä tietoa kolloidisen hopean vaikutuksista nanohiukkasten ja ionien sekoituksena hopeananohiukkasten tutkimukseen verrattuna. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia kolloidisen hopean antiproliferatiivisia ominaisuuksia ja sen vaikutusta solujen immunofenotyypitykseen, sytokiinien tuotantoon ja fagosytoosiin PBMC: ssä.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Kolloidinen hopea (AgC)

Grenetiinistabiloitu kolloidinen hopea ostettiin MICRODYNISTÄ (México) 0, 35% kantaliuoksena. Se steriloitiin suodattamalla (0, 2 µm suodatin, Millipore, USA) ja laimennettiin pitoisuudeksi 10, 5 µg/mL rpmi-1640: llä, jota täydennettiin 10% FBS: llä in vitro-määrityksissä.

2.2. Reagenssit

Fytohemagglutiniini (5 µg/mL) ja konkanavaliini A (5 µg/mL) ostettiin Sigma-Aldrichista (St. Louis, MO, USA). Doksorubisiinia (LEMERY S. A. de C. V., México) säilytettiin 3, 4 mM:n kantaliuoksena rpmi 1640: ssä huoneenlämmössä ja LPS: ää (E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich) valmistettiin 10 ng/mL ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisolujen hoitoon.

2.3. AgC-Karakterisaatio

kolloidisen hopean morfologiaa tutkittiin kenttäemissioiden pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (sem) (Nova NanoSEM200 FEI). Kolloidinen liuos (50 µL) asetettiin hiilinauhalle ja kuivattiin huoneenlämmössä. Nanohiukkasten koko-ja jakaumamittaukset määritettiin NS 90 Malvern Instruments (UK) – nanokomponentilla suoritetulla dynaamisella valon sironnalla (DLS); DLS: n antamat kokojakaumat ilmoitettiin intensiteettiprosentteina ja tulokset esitettiin vähintään kolmen mittauksen keskiarvona. UV-vis: llä mitattu resonanssiplasmoni havaittiin alueella 300-600 nm NanoDrop-spektrofotometrillä 2000 (Thermo Fisher Scientific).

2.4. Perifeerisen veren Mononukleaarisolujen (Pbmc)

eristäminen terveiltä vapaaehtoisilta ihmisiltä otettiin heparinisoiduilla ruiskuilla ja pantiin steriileihin polypropeeniputkiin. PBMC: tä eristettiin edelleen Histopaque 1.077-tiheysgradientin sentrifugoinnilla 400 g: ssa 30 minuutin ajan 25°C: ssa (Sigma-Aldrich). PBMC pestiin kahdesti rpmi 1640-kasvualustalla, jota täydennettiin 10-prosenttisella sikiäin-seerumilla (FBS) ja 1-prosenttisella antibiootti-antimykoottisella liuoksella (jota kutsutaan täydelliseksi rpmi-mediumiksi) 250 grammassa 10 minuutin ajan 25°C: ssa.

2, 5. Solujen elinkyky

PBMC säädettiin tasolle 1 × 106 solua/mL täydellisessä RPMI-väliaineessa, ja 17, 5 ng/mL kolloidista hopeaa lisättiin ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5% CO2-ilmakehässä. Tämän jälkeen supernatantti poistettiin sentrifugoimalla 250 gramman painolla. solut pestiin sitten kahdesti täydellisellä RPMI-väliaineella. Solujen elinkyky määritettiin kolorimetrisellä MTT-pelkistystestillä, ja formatsaanin tuotannosta saadut Optiset tiheydet luettiin 570 nm: ssä. Solujen elinkyky ilmaistiin prosentteina elinkyvystä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Tulokset annettiin kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona ± SD.

K562 (krooninen myelooinen leukemia), MOLT-4 (akuutti lymfoblastinen leukemia), Ramos (Burkittin lymfooma) ja L5178Y (lymfooma) syöpäsolulinjat ostettiin American Type Culture Collectionista (ATCC, Manassas, VA, USA) ja säilytettiin täydellisenä RPMI-mediumina. Kennoja kasvatettiin 37°C: n lämpötilassa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. Syöpäsolulinjat (5 × 103 solua/kuoppa) pinnoitettiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37°C: ssa 5% CO2-ilmakehässä.

inkubaation jälkeen viljelyaine poistettiin ja kolloidista hopeaa lisättiin pitoisuuksina 1, 75 – 17, 5 ng/mL. Tämän jälkeen levyjä inkuboitiin 5 tunnin ajan 37°C: n lämpötilassa ja 5% CO2-ilmakehässä. Tämän jälkeen supernatantti poistettiin ja solut pestiin kahdesti rpmi 1640-väliaineella. Solujen elinkyky määritettiin trypan blue exclusion-menetelmällä, ja sytotoksisuus ilmaistiin 50-prosenttisena (LD50) ja 100-prosenttisena (LD100) solujen kasvun estymisenä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Tulokset annettiin kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona ± SD.

2.6. Sytokiinimääritys

AgC-käsitellyn PBMC: n Supernatanteista analysoitiin sytokiinipitoisuudet. IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α ja IL-17A ihmisen sytokiinit määritettiin virtaussytometrialla (Accuri C6, BD Bioscience, CA, USA) käyttäen CBA Th1/Th2/Th17-Sytokiinisarjaa BD™ (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. CBA Flex Set-analyysi suoritettiin käyttäen FCAP array v1. 0-ohjelmistoa (Soft Flow Inc., YHDYSVALLAT). Proteiiniarvot muutettiin NIBSC / WHO: n proteiinistandardeiksi myöhempiä vertailuja varten.

2.7. Proliferaatio ja IL-2-määritys

PBMC eristettiin Histopaque-tiheysgradientin sentrifugoinnilla, pestiin kolme kertaa PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen laimennin C: hen 106 soluun/mL. Solususpensio laimennettiin sitten samalla 2,5 mM: n pkh26-väriainekannalla (Sigma, St. Louis, MO), joka valmistettiin Laimennusaineessa C, inkuboitiin 3 min huoneenlämmössä, sitten lisättiin yhtä suureen määrään FBS: ää ja inkuboitiin huoneenlämmössä vielä 2 min merkinnän lopettamiseksi “Rimaniol et al., 2003 .”Tämän jälkeen PBMC: tä säädettiin pitoisuudella 1 × 106 solua/mL, käsiteltiin kolloidisella hopealla pitoisuutena 17, 5 ng/mL, PHA tai Con A, ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5% CO2-ilmakehässä; solujen proliferaatio määritettiin virtaussytometrialla. PBMC: n supernatanttien IL-2-pitoisuudet mitattiin ihmisen IL-2 High Sensitivity ELISA kit-valmisteella (havaitsemisraja 0, 4 pg/mL) ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (eBiosciences, Wien, Itävalta).

2.8. Nitriitti – /Nitraattituotannon

nitriitti-ja nitraattipitoisuudet mitattiin kolorimetrisellä Griess-reaktiolla nitraattireduktaasilla (nitraatti – / Nitriittikolorimetrinen määritys Kit Cayman, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Seerumin nitriitti – /nitraattipitoisuudet ilmaistiin nM / 200 µL: na.

2.9. Solujen pinta-antigeenien

pbmc: n virtaussytometriaanalyysi sovitettiin 1 × 106 solun/mL pitoisuudella ja käsiteltiin kolloidisella hopealla 17, 5 ng/mL pitoisuudella, ja levyjä inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. Tämän jälkeen soluja kerättiin sentrifugoimalla 600 g: n painolla 10 minuutin ajan ja lisättiin yksi vasta-ainesarja CD3+ FITC/CD8+, PE/CD45+ ja PerCP/CD4 APC tai toinen vasta-ainesarja CD3+ FITC/CD16+, CD56 PE/CD45 ja PerCP/CD19 APC (BD Multitest IMK Kit) ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämmössä pimeässä. Tämän jälkeen punasolut lysättiin lisäämällä 450 µL 1x BD FACS™ – lysäysliuosta ja inkuboimalla 15 minuuttia huoneenlämmössä pimeässä. Näytteet olivat sitten valmiita analysoitavaksi sytometrillä. Hankinta toteutettiin Accuri C6 BD-instrumentilla käyttäen BD Multiset-ohjelmistoa BD Worklist Manager-ohjelmistolla. Automatisoitua gatingia käytettiin jokaisen osajoukon populaation helppoon analysointiin.

2.10. FITC-Dekstraanin kertymä

dendriittisolut (DCS) saatiin PBMC: stä ja niiden annettiin tarttua 0, 22 µm: n suodatinkantoisiin viljelypulloihin (TPP, Saksa). Kun solut poistettiin 2 tunnin kuluttua 37°C: ssa, sitoutuneita monosyyttejä viljeltiin 5 päivän ajan rpmi-1640: ssä, johon lisättiin 10% FBS: ää ja 800 U/mL rhuGM-CSF: ää (Peprotech, México) ja 50 ng/mL IL-4: ää (Peprotech, México). Tämän jälkeen soluja käsiteltiin kolloidisella hopealla, jonka pitoisuus oli 17, 5 ng/mL, ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5% CO2-ilmakehässä. DCs-endosytoosia arvioitiin inkuboimalla 1 × 106 solua 1 mg/mL FITC-dekstraanilla (BD) 30 minuutin ajan 37°C: ssa.pesun jälkeen solut analysoitiin virtaussytometrialla. Kontrolleihin kuuluivat putket, joita inkuboitiin FITC-dekstraanilla 4°C: ssa endosyyttiprosessin estämiseksi, sekä 0-aikapisteessä suoritettu basaalinotto. Kertymä määritettiin FACS-analyysillä (10 000 solua pistettä kohti) . Elinkelpoisuus määritettiin trypan blue exclusion-menetelmällä.

2.11. Tilastollinen analyysi

ANOVA arvioi tulokset ja hoitojen välisiä sytokiinipitoisuuksien mediaaneja verrattiin Mann–Whitney-testillä.

3. Tulokset

3, 1. Kolloidisen hopean Luonnehdinta

veteen ja soluviljelyaineeseen liuotetun kolloidisen hopean Luonnehdinta analysoitiin dynaamisella valonsironnalla (DLS); veteen liuotetun kolloidisen hopean keskimääräinen koko oli 100 nm, polydispersioindeksi 0,2; soluviljelyaineeseen liuotetun kolloidisen hopean keskimääräinen koko oli 155 nm ja polydispersioindeksi 0,23 (Kuvat 1 a ja 1 b)). Sem-kuvassa näkyi veteen liuenneita hiukkasia, joiden hiukkaskoko oli 50-190 nm (Kuvat 1 (c) ja 1 (d)); soluviljelyaineeseen liuenneessa kolloidisessa hopeassa oli nanohiukkasten ja joidenkin hopeasuolojen yhdistelmä(Kuvat 1(e) ja 1 (f)); DLS: llä saatu keskimääräinen koko korreloi kuitenkin hiukkasten histogrammiin ja tyypilliseen plasmoniresonanssiin(Kuvat 1(g), 1(h) ja 1 (i)). Kolloidisen hopean analyysi viittaa siihen, että tällä liuoksella on semisfäärinen muoto ja heterogeeninen populaatio, joka muodostuu nanohiukkasista ja hopeasuolojen muodostamasta klusterista. Kun AgC oli määritelty, ryhdyimme arvioimaan erilaisia biologisia vaikutuksia.

Kuva 1

kolloidisen hopean kokojakauma. (a) veteen liuenneen kolloidisen hopean DLS: n keskimääräinen koko oli 100 nm ja polydispersioindeksi 0,2. b) DLS-mittaukset kolloidisesta hopeasta liuotettuna soluviljelyaineeseen, jonka keskimääräinen koko on 155 nm ja polydispersioindeksi 0,23. (c, d) sem-kuva veteen liuenneista hiukkaspopulaatioista. (e, f) sem-kuva soluviljelyaineeseen liuotetusta kolloidisesta hopeasta. (g, h) veteen liuenneiden hiukkasten histogrammi ja viljelyaine. I) kolloidisen hopean UV-vis-spektri. J)hopeasuolat, jotka muodostuvat viljelyaineeseen liuotetusta kolloidisesta hopeasta. DLS, dynaaminen valon sironta; SEM, pyyhkäisyelektronimikroskopia; ja A.u., mielivaltaiset yksiköt.

3.2. Solujen proliferaation ja Il-2-tuotannon määrittäminen

ensin selvitettiin, vaikuttaako aiemmin rintasyöpäsoluissa käytetty sytotoksinen annos lymfosyyttien tai makrofagien toimintaan. Tulokset osoittivat, että kolloidinen hopeakäsittely ei vaikuttanut merkittävästi () pbmc-solujen proliferaatioon eikä solujen määrään, ja mitogeeneillä Con A tai PHA tehdyt käsittelyt lisäsivät merkittävästi solujen proliferaatiota ja solujen määrää verrattuna käsittelemättömään kontrolliin; mielenkiintoista on, että AgC/Con A tai AgC/PHA-yhdistelmäkäsittelyt vähensivät merkittävästi () pbmc: n solujen proliferaatiota ja solujen määrää (Kuvat 2 ja 3). Samanlaisia tuloksia saatiin virtaussytometrialla ja fluoresenssimikroskopialla käyttäen fluoresoivaa väriainetta PKH26 (kontrolli (94%), Con A (165%), PHA (156%), AgC (91%), AgC + Con A (80%) ja AgC + PHA (77%)) (kuvat 3, 4 ja 5). AgC-hoito ei myöskään vaikuttanut IL-2: n tuotantoon verrattuna kontrolliin (15 pg/mL) (), mutta IL-2: n tuotannon havaittiin lisääntyneen, kun PBMC: tä stimuloitiin PHA: lla (176 pg/mL) tai Con A: lla (150 pg/mL), ja AGC + Con A: lla (15 pg/mL) tai AgC + PHA: lla (13 pg/mL) tehdyt hoidot vähensivät IL-2: n tuotantoa () (Kuva 4).

kuva 2

kolloidisella hopealla ja mitogeeneillä käsitellyn PBMC: n Solukelpoisuus. PBMC (1 × 106 solua/mL) käsiteltiin con A: lla (5 µg/mL), PHA: lla (5 µg/mL), AgC: llä (17, 5 ng/mL), AgC: llä (17, 5 ng/mL) + Con A: lla (5 µg/mL) tai AgC: llä (17, 5 ng/mL) + PHA: lla (5 µg/mL) ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. Solujen elinkyky analysoitiin MTT-menetelmällä. Tiedot edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± keskihajontaa. . AgC, kolloidinen hopea; PHA, fytohemagglutiniini; ja con a, concanavalin A.

kuva 3

kolloidisella hopealla ja mitogeeneillä käsitellyn PBMC: n Soluluku. PBMC (1 × 106 solua/mL) käsiteltiin con A: lla (5 µg/mL), PHA: lla (5 µg/mL), AgC: llä (17, 5 ng/mL), AgC: llä (17, 5 ng/mL) + Con A: lla (5 µg/mL) tai AgC: llä (17, 5 ng/mL) + PHA: lla (5 µg/mL) ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. Solumäärä analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± keskihajontaa. . AgC, kolloidinen hopea; PHA, fytohemagglutiniini; ja Con A, concanavalin A.

Kuva 4

kolloidisella hopealla ja mitogeeneillä käsitellyn PBMC: n soluproliferaatio ja IL-2-tuotanto. PBMC (1 × 106 solua/mL) käsiteltiin con A: lla (5 µg/mL), PHA: lla (5 µg/mL), AgC: llä (17, 5 ng/mL), AgC: llä (17, 5 ng/mL) + PHA: lla (5 µg/mL) tai AgC: llä (17, 5 ng/mL) + Con A: lla (5 µg/mL) ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. Pkh26: n ilmentymiseen perustuva solujen proliferaatio analysoitiin virtaussytometrialla. IL – 2 supernatantit arvioitiin ELISA-testillä. Tiedot edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± keskihajontaa. . AgC, kolloidinen hopea; PHA, fytohemagglutiniini; ja con a, concanavalin A.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g))

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

kuva 5

pbmc: n soluproliferaatio, jota hoidetaan kolloidinen hopea ja mitogeenit. PBMC (1 × 106 solua/mL) käsiteltiin a) negatiivisella kontrollilla, B) kontrollilla, C) PHA (5 µg/mL), d) Con a (5 µg/mL), e) AgC (17, 5 ng/mL) + PHA (5 µg/mL) tai g) AgC (17, 5 ng/mL) + Con A (5 µg/mL) ja inkuboitiin 72 tunnin ajan 37°C: ssa ja 5% CO2-ilmakehää. Solujen proliferaatiota analysoitiin mikroskopian fluoresenssilla. AgC, kolloidinen hopea; PHA, fytohemagglutiniini; ja con a, concanavalin A.

3.3. AgC: n sytotoksinen vaikutus lymfoidi-ja Leukemiasyöpälinjoihin

tuloksemme vahvistivat AGC: n antiproliferatiiviset ja sytotoksiset ominaisuudet leukemiaan (Molt-4 ja K562) ja lymfoomasolulinjoihin (Ramos ja L5178Y) annosriippuvaisesti (1, 75-17, 5 ng/mL) () (kuva 6).

kuva 6

kolloidisella hopealla ja mitogeeneillä käsiteltyjen syöpäsolulinjojen solukelpoisuus. K562 -, Molt-4 -, Ramos-ja l5178y-syöpäsolulinjoja (5 × 103 solua/kuoppa) käsiteltiin usealla AgC-annoksella ja inkuboitiin 5 tunnin ajan 37°C: n lämpötilassa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. Solujen elinkyky analysoitiin MTT-menetelmällä. Tiedot edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± keskihajontaa. . AgC, kolloidista hopeaa.

3.4. Sytokiinin määritys

AgC-hoidon lisäksi ei vaikuttanut IL-2: n, IL-4: n, IL-6: n, IL-10: n, IFN-γ: n, IL-17A: n (0 pg/mL) tai TNF-α: n (5, 84 pg/mL) tuotantoon () verrattuna hoitamattomaan kontrolliin. Positiivisena kontrollina käytetty LPS-hoito sai kuitenkin aikaan kaikkien arvioitujen sytokiinien suuren tuotannon (Taulukko 1).

3.5. Solujen Pintamarkkereiden Fenotyypitys

tuloksemme osoittivat, että AgC−hoito ei vaikuttanut solupopulaatioiden CD3+ (79, 7%), CD3-CD19+ (10, 2%), CD3+CD4+ (52, 2%), CD3+CD8+ (33, 9%) ja CD16+CD56+ (7, 6%) ekspressioprosenttiin verrattuna kontrolliin () (Taulukko 2).

3.6. Peroksinitriitit ja FITC-Dekstraanimääritykset

kolloidinen hopeakäsittely (99%) ei vaikuttanut dendriittisolujen elinkykyyn (Kuva 7 a) eikä arvioituihin peroksinitriittipitoisuuksiin(Kuva 7 b), mutta lisäsi fagosytoosiprosenttia (Kuva 7 c) verrattuna kontrolliin ().

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 7

ihmisen makrofagien solukelpoisuus, fagosytoosi ja peroksinitriittien tuotanto. Ihmisen makrofagit (1 × 106 solua) käsiteltiin AgC: llä ja inkuboitiin 5 tunnin ajan 37°C: n lämpötilassa ja 5%: n CO2-ilmakehässä. a) solujen elinkelpoisuus analysoitiin trypan blue assay-menetelmällä. B) FITC-Dekstraanin makrofagifagosytoosi virtaussytometrialla arvioituna. c) nitraatti/nitriitti määritetty Griess-reaktiolla (nitraatti / nitriitti kolorimetrinen määrityspaketti); positiivisena kontrollina käytettiin LPS: ää. Tiedot edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± keskihajontaa. . AgC, kolloidinen hopea; FITC-dekstraani, fluoreseiini-isotiosyanaatti-dekstraani; ja LPS, lipopolysakkaridi.

4. Keskustelu

tiedetään, että useilla syövän hoidossa käytettävillä solunsalpaajilla (syklofosfamidi, vinblastiini, vinkristiini, bleomysiini ja sisplatiini) on antiproliferatiivisia ja sytotoksisia vaikutuksia, mutta pieninä annoksina ne voivat stimuloida immuunivastetta . Minkä tahansa aineen vaikutus immuunijärjestelmään on testattava, koska kaikki tämän järjestelmän vauriot voivat vaikuttaa kehon homeostaasiin. Tässä tutkimuksessa kolloidisen hopean analyysi viittaa hopeasuolojen muodostamien nanohiukkasten ja-klusterien heterogeeniseen populaatioon, joka on todennäköisesti peräisin vuorovaikutuksista täydellisen viljelyaineen sisältämien proteiinien kanssa. Biologisissa nesteissä olevien hopeahiukkasten aggregaatiovaikutus johtuen proteiinien ja lipidien läsnäolosta on raportoitu . Lisäksi tuloksemme osoittivat, että AgC (17.5 ng/mL) voi estää mitogeenien indusoiman IL-2: n tuotannon. Näin ollen PBMC: n aiheuttama immunosuppressio voi välittyä IL-2: n vapautumisen eston kautta. Joidenkin lääkkeiden, kuten siklosporiinin ja atsatiopriinin, immunosuppressiivista aktiivisuutta on vahvistanut lymfosyyttien proliferaation ja sytokiinien (inf-γ, IL-2, RANTES, TGF-β ja TNF-α) tuotannon estäminen, kun lymfosyyttejä stimuloidaan reagensseilla, kuten PHA, Con A tai pokeweed-mitogeeni . IL-2 on T-solujen itsevaltias kasvutekijä, ja immunosuppressiivisella takrolimuusilla (FK506) tai mykofenolihapolla annettu hoito on selektiivisesti estänyt sen tuotantoa . Tiedetään, että immunosuppressiivisia lääkeaineita (kortikosteroideja) käytetään lymfaattisten maligniteettien hoitoon, koska ne aiheuttavat pahanlaatuisissa imusoluissa apoptoosin . Osoitimme AGC: n (155 nm) antiproliferatiiviset ja sytotoksiset ominaisuudet (annokset vaihtelevat 1,75-17,5 ng/mL) leukemisissa ja lymfomatoottisissa solulinjoissa huolimatta aiemmista raporteista, joissa mainittiin, että läpimitaltaan 10-100 nm: n hopeahiukkaset ovat sytotoksisempia kuin isommat hiukkaset . On tarpeen tietää selektiivisyyden mekanismi PBMC: n ja myelooisten ja lymfaattisten syöpäsolujen välillä, ja tulevia tutkimuksia olisi kehitettävä reseptorivälitteisen apoptoosin alalla, kuten “Vega and De Maio, 2005 .”Koska glukokortikoidiresistenssi lymfoomahoidossa, kasvainsolut jatkavat laajentumistaan glukokortikoidien läsnä ollessa . Tästä syystä AgC voisi tarjota uuden kliinisen vaihtoehdon harkittavaksi, mutta tarvitaan lisää tutkimuksiin liittyviä tutkimuksia. Toisaalta tuloksemme osoittavat, että sytokiinien tuotanto ja T -, B-ja NK-solujen ilmaisemat pintamarkkerit eivät vaikuta AgC-vasteeseen (17, 5 ng/mL), toisin kuin muut immunosuppressorit, kuten rapamysiini tai soraphen, joiden immunosuppressorivaikutus johtuu signalointireitin häiriöstä ja rasvahappojen aineenvaihdunnasta . Lisäksi on näyttöä siitä, että immuunijärjestelmän solut voivat aktivoitua biomateriaalien vaikutuksesta, vaikka MHC/peptidi/TCR-indusoituja signalointireittejä ei odoteta olevan. Vaihtoehtoiset nonkognaattireitit voivat kuitenkin johtaa plasman kalvopinnan ristisilloittuvien glykoproteiinien aktivoitumiseen, kuten mitogeenin indusoimaan lymfosyyttien proliferaatioon . Peroksinitriittien osalta kolloidinen hopea (17,5 ng/mL) ei indusoinut niiden tuotantoa, mutta fagosytoosiaktiivisuus lisääntyi luultavasti kolloidisen hopean epäspesifisen sisäänoton vuoksi. Muut kirjoittajat ovat kuvanneet, että hopeananopartikkelit alueella 5, 10, 15 ja 100 nm lisäävät mitokondrioiden toimintaan vaikuttavia reaktiivisia happilajeja ja että hopeahiukkasten fagosytoosi estää solusyklin S-vaiheessa ja stimuloi tulehduksellista signalointia reaktiivisten happilajien generoinnin kautta, minkä jälkeen TNF-α: n eritys, joka vähensi rotan maksasolujen elinkelpoisuutta .

yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus osoittaa kolloidisen hopean myrkyttömyyden immuunijärjestelmän soluihin nähden ja sen kyvyn häiritä immuunivastetta vähentämällä solujen proliferaatiota mitogeeneillä stimuloitaessa, mikä viittaa siihen, että kolloidista hopeaa voidaan pitää immunosuppressiivisena aineena, mutta lisää tutkimuksia on tehtävä sen tehokkuuden ja vaikutusmekanismin osoittamiseksi.

kilpailevat intressit

kirjoittajat ilmoittavat, ettei tämän paperin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.

kiitokset

tätä tutkimusta tukee Laboratory of Immunology and Virology, Faculty of Biological Sciences, Autonomous University of Nuevo Leon, San Nicolás de los Garza, nl, Meksiko, yhteistyössä “Red Temática de Inmunología en Cáncer y Enfermedades Infecciosas”, rekisterinumero 253053, CONACYT.