injektoitavat ihmisen rekombinantti kollageenimatriisit rajoittavat haitallista uudelleenmuodostusta ja parantavat sydämen toimintaa sydäninfarktin jälkeen

Tutkimusasetelmat

tässä teimme tutkimuksen I) kliinisesti merkittävien kollageenivetyjen suunnittelemiseksi käyttäen ihmisen rekombinantteja tyypin I ja tyypin III kollageeneja; ii) luonnehtimme ja vertailimme rHCI-ja rHCIII-materiaalien fysikaalisia ominaisuuksia; iii) arvioida MI: n hoitoon käytettävien materiaalien terapeuttista potentiaalia hiirillä ja IV) tunnistaa rHC-hoidon Havaittujen terapeuttisten vaikutusten taustalla olevat mekanismit. In vivo-kokeissa POIKASVALTIMON ligaatio hiirillä valittiin kliinisesti merkittäväksi ja vakiintuneeksi sydäninfarktin eläinmalliksi. Funktionaalisia, histologisia ja molekyylitason arviointeja varten eläinten määrä ryhmää kohti minimoitiin kolmesta viiteentoista hiireen, kuten kuviolegendoissa on määritelty. Hiiret jaettiin satunnaisesti hoitoryhmiin ja kaikki analyysit tehtiin sokkona.

rHC-matriisien valmistus ja karakterisointi

1% kollageeniliuosta valmistettiin liuottamalla 0, 1 g kylmäkuivattua kollageenia (Fibrogeenistä saatu rHCI ja rHCIII) 10 ml:aan erittäin puhdasta ddH2O:ta kondroitiinisulfaattia (CS; Wako), n-etyyli-N-(3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidia (EDC) ja n-hydroksisukkinimidia (NHS) lisättiin tuottamaan lopullinen seos, jonka massasuhde on 1:4:0.5:0.3 kollageenille:cs: NHS: EDC. Materiaalit valmistettiin jäällä suljetulla järjestelmällä, joka mahdollistaa homogeenisen sekoittamisen ilman kuplien lisäämistä. Perusteellisen sekoittamisen jälkeen pH säädettiin arvoon 7.4 mennessä NaOH (1,0 N). Matriisit ilman CS: ää valmistettiin samalla tavalla, mutta PBS: ää lisättiin kompensoimaan CS: n tilavuus. Matriisit, joissa on Alexa-Fluor®594-NHS, valmistettiin lisäämällä geeleihin 20 µL väriainekantaliuosta (1 mg/mL DMSO: ssa) ennen NaOH: n lisäämistä (25 nmol väriainetta hydrogeeliä kohti) ja sen jälkeen 20 sekoitusvaihetta.

materiaalin viskositeetti

Viskositeettimittaukset suoritettiin Brookfield R/S plus reometrillä (Brookfield) 37 °C: n lämpötilassa.C25–2/30 kartiomainen Kara puristettiin materiaalin (50 µm: n Siirtymä) lämpötilasäädellylle jalustalle. Viskositeetti mitattiin luiskan pyörimislohkolla nopeudella 1 / min, joka oli ennalta asetettu viiden yksikön leikkausnopeuteen 30 minuutin aikana.

ristisilloitusaste

Differentiaaliskannauskalorimetria (DSC)-kokeita tehtiin ristisilloituksen asteen arvioimiseksi. Mittaukset suoritettiin lyhyesti q2000−differentiaaliskannauskalorimetrillä (TA-Mittarit) alueella 8-80 °C käyttäen skannausnopeutta 5 °c min-1. Kollageenimatriisit (5-20 mg) pintakuivattiin suodatinpaperilla ja sinetöitiin ilmatiiviisti alumiinikannella (Tzero; TA Instruments) alumiinisessa näyteastiassa (Tzero; TA Instruments). Denaturaatiolämpötila (TD) mitattiin endotermisen huipun alkaessa.

vesipitoisuus

materiaalien vesipitoisuus mitattiin punnitsemalla näytteen märkäpaino (W0), joka tasapainotettiin PBS: llä 96 tunnin ajan 4 °C: ssa.tämän jälkeen materiaali vakuumikuivattiin huoneenlämmössä 96 tunnin ajan kuivan massan (W) saavuttamiseksi. Hydrogeelien kokonaisvesipitoisuus (Wt) laskettiin tämän jälkeen yhtälöllä:

hajoaminen

entsymaattinen hajoaminen mitattiin käyttämällä 50-100 mg hydrogeeliä 5 ml: aan tyypin I kollagenaasia (10 U/ml PBS: ssä) 37 °C: n lämpötilassa. jäljellä oleva kiinteä massa mitattiin enintään 24 tunnin ajan.hajoamisnopeus lasketaan jäljellä olevan massan vs. aika-havaintoalojen alkuperäisestä kaltevuudesta ja ilmoitetaan mg/min.

materiaalin huokoisuus

matalan lämpötilan pyyhkäisyelektronimikroskopian (Cryo-SEM) mittaukset tehtiin -50 °C: n lämpötilassa käyttäen tescan-laitetta (malli: Vega II – XMU), joka oli varustettu kylmävaiheisella näytteenpitimellä, backscatter-elektronitunnistimella (BSE) ja sekundaarisella elektronitunnistimella (se). Huokoskoot mitattiin vähintään 250 yksilöltä 4-6 satunnaiselta näytteen alueelta ImageJ® – ohjelmiston avulla. Huokosten halkaisija määritettiin huokosten pituusakselin avulla suoralla viivalla. Kuvan pinta-alaa säädettiin Tescan Vega II-järjestelmästä65 saatua kokoasteikkopalkkia vastaan.

eläinkokeet

Ottawan yliopiston Eläintenhoitokomitea hyväksyi kaikki toimenpiteet, ja ne tehtiin National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals-oppaan mukaan.

MI-malli

MI indusoitiin 9-viikkoisilla naarailla c57bl/6-hiirillä (Charles River; hiirien määrä/ryhmä on kuviolegendoissa) ja hoito suoritettiin vakiintuneella protokollalla26,27. Hiiret nukutettiin (2% isofluraania), intuboitiin ja sydän altistettiin neljännen intrakostaalisen torakotomian kautta. Vasemman etupuolen laskeva sepelvaltimo (LAD) liitettiin sitten juuri sen syntymiskohdan alapuolelle vasemmasta eteisestä. Tämä toimenpide johtaa suureen sydäninfarktiin, johon liittyy sydämen ETU -, taka-ja apikaalisia osia, mikä vahvistettiin leikkauksen yhteydessä sydänlihaksen vaalentumisella valtimon toimittamalla alueella. Lyhytvaikutteinen buprenorfiini annettiin vähintään tuntia ennen leikkausta ja pitkävaikutteinen buprenorfiini ihon alle välittömästi ennen leikkausta perioperatiivista analgesiaa varten. 1 viikon kuluttua sydäninfarktista (lähtötilanne) hiirille annettiin satunnaisesti PBS -, rHCI-tai rHCIII-matriiseja, jotka annettiin viidessä ekvivolumetrisessä sisäkardiaaliruiskeessa (10 µl kumpaankin kohtaan, yhteensä 50 µl) 27 G: n neulalla ultraääniohjatulla suljetulla rintakehällä. Ruisku on kiinnitetty mikromanipulaattoriin (VisualSonics), ja ennen injektiota sekä neula että RMV scanhead-anturi on suunnattu sydämen pitkäakselia pitkin. Ultraäänikentän kautta mikromanipulaattoria käytetään asettamaan neulan kärki haluttuun paikkaan sydänlihaksessa injektioiden toimittamista varten (ks.täydentävä Kuva. 1 ja täydentävä Video 1). Hiiret tapettiin terminaalipuudutuksessa 2 päivän tai 4 viikon kuluttua hoidosta ja sydämet kerättiin histologiaa ja/tai mekaanisten ominaisuuksien mittausta varten.

kaikukardiografia

Transthorasinen kaikukuvaus tehtiin pitkäakselikuvauksella käyttäen vevo770-järjestelmää B-tilassa 707b-sarjan reaaliaikaisen mikrovisualisoinnin scanhead-luotaimen (VisualSonics) kanssa. Kuvantaminen tehtiin lähtötilanteessa ennen injektiota (7 päivää sydäninfarktin jälkeen) ja 28 päivää injektion jälkeen vasemman kammion ejektiofraktion (LVEF), murto-osan alueen muutoksen (FAC), systolisen lopputilavuuden (ESV), diastolisen lopputilavuuden (EDV), aivohalvauksen volyymin ja sydämen tuotoksen määrittämiseksi. Huomaa, että LVEF: ää, ESV: tä ja EDV: tä käytetään HF: n ja mi44: n jälkeisen eloonjäämisen kliinisinä ennustajina.

Ex vivo kuvantaminen Alexa-Fluor®594-merkityllä matriisilla

kemiallisesti merkityt rHC-matriisit (25 nmol väriainetta hydrogeeliä kohti) ruiskutettiin infarktiin hiiren sydämeen edellä kuvatulla tavalla. Eläimet lopetettiin 2 tunnin, 2 päivän ja 7 päivän kuluttua käsittelystä, ja sydämet kerättiin ja kuvattiin ex vivo IVIS® Spectrumilla (PerkinElmer) rhci-ja rHCIII-jakautumisen havainnollistamiseksi sydämissä (λ excitaatio: 570 nm; λemissio: 640 nm). Histologiaa varten kudososat valmistettiin asetonissa ja värjättiin sitten dapilla, minkä jälkeen ne kuvattiin Leica Aperio Versa-liukukuvaskannerilla, jonka lopullinen suurennus oli ×20 ja Z-stack kahdeksalla askeleella 1, 5 µm: n tarkkuudella.

Venymäanalyysi

Transthorasic ekokardiografia tehtiin pitkäakselikuvauksella käyttäen vevo3100-järjestelmää B-tilassa MX400-sarjan reaaliaikaisen mikrovisualisoinnin scanhead-luotaimella (VisualSonics). Kuvantaminen tehtiin lähtötilanteessa ennen injektiota (7 päivää sydäninfarktin jälkeen) ja 2 päivää injektion jälkeen pitkittäisen endokardiaalisen kannan määrittämiseksi aorttaläpän sulkeutuessa (end systole). Segmentin 5 (anterior mid-segmentti) kanta, joka vastaa rajavyöhyke-aluetta, johon hoito pistetään, analysoitiin käyttäen Vevo LAB 3.1.1 software (VisualSonics)41: n vevostrain-sovellusta. Edustavia esimerkkejä suoritetuista mittauksista on esitetty täydentävässä kuviossa. 10 kaikille koeryhmille sekä terveelle (tartuttamattomalle) eläimelle.

elektrokardiografia

EKG otettiin samanaikaisesti kaikukardiografian kanssa käyttäen vevo3100-järjestelmää (VisualSonics) lähtötilanteessa ennen injektiota (7 päivää sydäninfarktin jälkeen) ja 2 päivää injektion jälkeen. Elektrokardiogrammit vietiin Vevo-laboratoriosta 3.1.1. ohjelmisto (VisualSonics). PR -, QT-ja QRS-intervallien pituus määritettiin ImageJ-ohjelmiston avulla (täydentävä Taulukko 1).

sydänlihaksen mekaaniset ominaisuudet

Hiiret lopetettiin terminaalipuudutuksella 2 tai 28 päivää hoidon jälkeen, ja sydämet kerättiin talteen. Arpea ja rajavyöhykettä käsittävästä vasemmasta kammiosta poistettiin Suorakulmaisia paloja (2,5 × 5 mm). Kudoksen vetolujuuden määrittämiseksi (Youngin moduuli) näytteet testattiin mekaanisesti Instron−mekaanisella yleismittarilla (malli 3342, Instron), joka on varustettu Series IX/S-ohjelmistolla, käyttäen ristinopeutta 10 mm min-1.

histologia / immunohistokemia

sydänlihaskudososien diat valmistettiin sydämen alajoukosta, jota ei käytetty mekaanisten ominaisuuksien mittauksiin. 28 päivää injektion jälkeen sydämet kerättiin, perfusoitiin PBS: llä, upotettiin OCT: hen ja pakastettiin nestemäiseen typpeen. 10 µm: n pätkiä leikattiin kryostaatilla. Arpien koon arvioimiseksi kudososat vahvistettiin 4%: n PFA: ssa 1 tunnin ajan ja värjättiin Massonin trichrome-menetelmällä (Sigma). Olympus bx50-mikroskoopilla otettuja kuvia, joissa käytettiin 2 × objektiivia ja kahdeksaa osaa hiirtä kohden, käytettiin etäseinämän paksuuden mittaamiseen ja arpien koon määrittämiseen mid-line arc-menetelmällä MIQuant software66: n avulla. Immunohistokemiaa varten kudososat kiinnitettiin asetoniin 20 minuutin ajan, permeabiloitiin 0,1% Tritonilla 10 minuutin ajan ja sitten estettiin 10% seerumissa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Primaariset vasta-aineet levitettiin yön yli 4 °C: ssa 10%: n seerumissa, minkä jälkeen dioja huuhdeltiin ja käsiteltiin sekundaarisilla vasta-aineilla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, ennen kuin ne asennettiin fluoresoivalla kiinnitysaineella (Dako). Verisuonten ja myofibroblastien toteamiseen PECAM-1 (tunnetaan myös nimillä CD31; Santa Cruz 101454, 1: 50) ja α-SMA (Abcam 5694, 1:200) vasta-aineita käytettiin ja havaittiin af594 anti-rat-rokotteella (Life Technologies A11008, 1:500) ja AF488 anti-rabbit-rokotteella (Life Technologies A11007, 1:500). M2-makrofageja havaittiin AF488-konjugoidulla anti-CD206-vasta-aineella (Biolegend 141710, 1:50). Sydämen troponiini I-värjäyksessä osia inkuboitiin AF488-merkityllä vehnänalkioagglutiniinilla (Lämpökalastaja, W11261) 1 tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen inkuboitiin vuohen sydämen troponiini I:n primaarivasta-aineella (Abcam ab56357, 1: 200) ja havaittiin aasin anti-vuohi AF594-sekundaarisella vasta-aineella (Life Technologies A-11058, 1: 500). Lopuksi connexin 43-värjäyksen osalta osia inkuboitiin connexin 43 / GJA1:llä (Abcam ab11370, 1:400) ja sydämen troponiini I:llä (Abcam ab188877, 1:200) primaarisilla vasta-aineilla, minkä jälkeen ne osoitettiin af488 anti-rabbit-valmisteella (Life Technologies A11007, 1: 500) ja aasi Anti-goat AF594-toissijaisella vasta-aineella (Life Technologies A-11058, 1: 500). Loisteputkikuvat saatiin Zeiss Axio-Havaintomikroskoopilla, jonka Objektiivi oli ×20, ja connexin 43 värjättyyn osaan käytettiin Leica Aperio Versa-liukukuvaskanneria, jonka Objektiivi oli 20×. Kaikkien IHC-tahrojen osalta analysoitiin neljä kohtaa hiirtä kohti ja jokaista kohtaa varten analysoitiin 2-4 kuvaa rajavyöhykkeeltä, infarktista ja syrjäseuduilta. H&e-värjäyksessä kudosjaksot vahvistettiin 10% formaliinilla. Osat värjättiin sitten ensin hematoksyliini Gillin liuoksessa nro 2 7 minuutin ajan, minkä jälkeen happaman alkoholin erilaistuminen ja sitten 0,5% eosiinia 7 minuutin ajan, minkä jälkeen nestehukka (kaikki Sigma-liuokset). Kuvat otettiin Olympus BX50-mikroskoopilla. Rajavyöhyke määriteltiin infarktin kummankin puolen VIEREISEKSI FOV-vyöhykkeeksi, joka alkaa silloin, kun 50% infarktin alueen fibroottisesta arpikudoksesta on fibroottista arpikudosta (KS. 11 kaavamainen kuvaus).

Cx3cr1-EGFP-hiirikokeet

verenkierrossa olevien mononukleaarisolujen aktivoitumisen arvioimiseksi sydänlihakseen rHC-hoidon jälkeen ostettiin Jacksonin laboratoriosta B6.129p-Cx3cr1 tm1Litt/J-hiiriä (Cx3cr1-EGFP). Nämä hiiret ilmentävät tehostettua vihreää fluoresoivaa proteiinia monosyyteissä, dendriittisoluissa, NK-soluissa ja aivojen mikrogliassa, ja ne ovat malli, joka raportoidaan mononukleaaristen solujen rekrytoinnin tutkimuksessa67. 1 viikon kuluttua sydäninfarktista hiirille annettiin 50 µl PBS -, rHCI-tai rHCIII-hoitoa edellä kuvatulla tavalla. Eläimet lopetettiin 2 päivää hoidon jälkeen, ja veri kerättiin EDTA-putkiin. Myös sydämet perfusoitiin PBS: llä ja kerättiin vasemman kammion oikea kammio ja apinen alue. Kudokset huuhdeltiin HBSS: llä ja pilkottiin 2.4U / ml liuotin I (Roche) ja 1 mg/ml kollagenaasi B (Roche) 40 minuutin ajan 37 °C: ssa.näytteet pestiin kolme kertaa PBS: llä, sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 400 g: n lämpötilassa ja eristetyt solut valmistettiin virtaussytometriaa varten (FACS Aria III; Becton Dickinson). Solut merkittiin APC anti-hiiri/ihminen CD11b (biolegend 101211), PE anti-hiiri Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-hiiri F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-hiiri CD38 (Biolegend 102717) ja Alexa Fluor® 700 anti-hiiri CD206 (Biolegend 141733), valmistajan suosittelemien laimennosten jälkeen (0.25 µg/L 1 × 106 solua kohti CD11b: n, Ly-6g/6C: n, CD38: n ja CD206: n osalta ja 1 µg/L 1 × 106 solua kohti F4/80: n osalta). KS. Täydentävä Kuva. 12 lajittelu / porttistrategia.

solujen eristäminen ja virtaussytometria monosyyttien osalta

kaksi päivää hoidon jälkeen hiiret tapettiin CO2-hengitysteitse ja sen jälkeen kaularangan sijoiltaan. Veri kerättiin hiiriltä sydänpunktion kautta 50 mM: n EDTA-liuoksessa, ja RBC lysoitiin punasolujen (RBC) liukupuskurilla valmistajan protokollan (Biolegend 420301) mukaisesti. Solut eristettiin kerätyistä hiirensydämistä dnaasia I (50 U/µL; Sigma D5025), tyypin II kollagenaasia (400 U/mL; Lämpökäsittelijä 17101015), kollagenaasia D (0, 15 U/mL; Sigma 11088866001) ja hyaluronidaasia (10 U/mL; Sigma H3506) sisältävällä digestiopuskurilla. Tunnin digestion jälkeen 37 °C: ssa eristetyt sydänsolut johdettiin 70 µm: n suodattimen läpi. Lopuksi kerätyt hiiren pernat muusattiin ja trituroitiin 70 µm: n suodattimen läpi, minkä jälkeen inkuboitiin punasolujen (RBC) liukupuskurilla. Kennopelletit kerättiin sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 4 °C: n lämpötilassa (×400 g). Kaikista kudoksista eristettyjä soluja inkuboitiin Zombie Aqua fixable Activity dye-valmisteella (1: 500, Biolegend 423101) 20 minuutin ajan huoneenlämmössä. Seuraavaksi Fc-reseptorit estettiin trustain X-reagenssilla (1:100, Biolegend 103319) 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 45 minuutin ajan huoneenlämmössä vasta-ainecocktaililla, joka sisälsi cd45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17a2), B220-af488 (1:50, biolegend RA3-6b2), F480-Af647 (1:100, Biolegend BM8) ja Ly6C-BV421 (1:80, BD Biosciences AL-21). Virtaussytometria suoritettiin BD FACS Aria III: lla ja tiedot analysoitiin FlowJo V10.5.2-ohjelmistolla (KS. 12 lajittelu / porttistrategia). Elinkykyisten solujen kokonaismäärä kullekin kudokselle eristämisen jälkeen määritettiin trypan blue exclusion-menetelmällä hemosytometrillä. Solujen kokonaismäärä kussakin valkosolupopulaatiossa määritettiin käyttämällä elävien solujen prosenttiosuutta tietyn solupopulaation osalta, ja elävien solujen kokonaismäärä laskettiin eristämisen jälkeen, mikä normalisoitiin kerättyjen kudosten mg: aan tai millilitraan verta. Gating strategia: Single cells were gated based on FSC-A and FSC-H. Live single cells were gated on low dusting for Zombie Aqua live/dead dye. Tästä elävän yksisolupopulaation leukosyytit olivat CD45+. Leukosyyttien osajoukkoja luonnehdittiin seuraavasti: neutrofiilit CD45+CD11b+Ly6G+, ly6c: n alhaiset monosyytit CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C: n korkeat monosyytit CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofagit CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T−solut CD45+CD11b−Ly6G− CD3+B220−ja B−solut CD45+cd11b−ly6g-CD3-B220+. Note for blood F480-lauseketta ei käytetty gating-strategiassa. Portit asetettiin suhteessa isotype-ohjaukseen.

vastasyntyneen kardiomyosyyttitutkimukset

vastasyntyneen rotan kammioperäiset myosyytit (Kvms) eristettiin vasta käyttäen vakiintunutta protokollaa68. Vasen kammiot kerätty 2 päivän vanha Sprague-Dawley rotat (Harlan) pilkottiin trypsiini (Amersham Biosciences) ja kollagenaasi tyyppi II (Worthington biokemiallinen). Eristetyt solut suspendoitiin uudelleen m-199-väliaineessa (Life Technologies), jota täydennettiin 10% FBS: llä, 19,4 mM glukoosilla, 2 mM L-glutamiinilla, 2 U/mL penisilliinillä, 0,8 µg/mL B12-vitamiinilla, 10 mM HEPES: llä ja 1 × mem: n epäolennaisilla aminohapoilla (Sigma-Aldrich). Tehtiin kaksi 60 min: n esikarsintakierrosta, joiden aikana sydämen fibroblastit kiinnittyvät lautasen pohjaan, mikä rikastutti NRVMs: ää sairastamatonta populaatiota. Nonadherent-solut (NRVMs) kylvettiin eri kollageenimatriiseihin 24-kuoppalevyillä (40 000 solua/cm2). Eloonjäämismääritystä varten 3 päivän viljellyille Kvam: ille tehtiin 3 tunnin ajan 50 µM vetyperoksidia sisältävää m-199-väliainetta, minkä jälkeen tehtiin terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)-määritys ja kuolleet solut laskettiin kolmeen satunnaiskenttään.

soluviljelmät

vakiintuneen protokollan mukaisesti luuytimestä johdetut makrofagit eristettiin 8-12 viikon ikäisistä C57BL/6J mice69-bakteereista. Hiiret lopetettiin CO2-hengittämällä ja kaularangan sijoiltaan, ja sääriluita kerättiin ja huuhdeltiin väliaineilla luuytimen eristämiseksi. Luuydin-isolaattia pipetoitiin toistuvasti, jotta saatiin yksisoluinen suspensio, joka sitten johdettiin solusiivilän läpi. Vastaeristettyjä soluja viljeltiin 1 viikon ajan DMEM: ssä täydennettynä 10% FBS: llä, 20% L929: llä ehdollistetulla väliaineella ja penisilliini-streptomysiinillä, minkä jälkeen ne pinnoitettiin uudelleen rHC–hydrogeelillä 3 päivän ajan. Solut kerättiin rHC-hydrogeeleistä 3 mM: n CaCl2 Hank-puskuriliuoksella, joka sisälsi 250 yksikköä kollagenaasi I: tä (Gibco). Makrofagipolarisaatiota arvioitiin virtaussytometrialla (FACS Aria III; Becton Dickinson) käyttäen CD86: ta ja CD206: ta (BIOLEGENDI) M1-ja M2-makrofagien tunnistamiseen. Mononukleaaristen solujen eristämistä varten koottiin luuydintä sääriluista edellä kuvatulla tavalla. Mononukleaariset solut puhdistettiin tiheysgradienttisentrifugoimalla käyttäen Histopaque® (Sigma) – menetelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut merkittiin numerolla 0.5 µg/ml Dapi (Sigma) 30 minuutin ajan 37 °C: ssa.

makrofagi – adheesiomääritys

mononukleaarisolut eristettiin huuhtelemalla 6-12 viikon ikäisten hiirten sääri-ja reisiluita. Solut puhdistettiin tiheysgradientti sentrifugoimalla käyttäen Histopaque® (Sigma) valmistajan ohjeiden mukaan. Mononukleaarisolut laskettiin ja merkittiin DAPILLA. Soluja pinnoitettiin eri biomateriaaleilla pitoisuudella 50 000 solua / cm2 24 tunnin ajan. solut kiinnitettiin 4%: lla PFA: Ta 5 minuutin ajan,ja solut laskettiin. Tiedot ilmaistiin suhteessa kontrolliin (päällystämättömät kuopat, ts., TCPS)minimoimaan solujen välisen vaihtelun vaikutusta.

makrofagien siirtymätesti

luuytimen mononukleaarisoluja viljeltiin dmem: ssä, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 20% L929-vakioitua elatusainetta ja kynä/streptokokki 7 päivän ajan luuytimestä johdettujen makrofagien (Bmms) tuottamiseksi ja joissa oli Dapi-merkintä edellä kuvatulla tavalla. Bmms (2 × 105) suspendoitiin uudelleen EBM: ään, josta puuttui kasvutekijöitä ja seerumia, ja se ladattiin Transwellilevyn (Life Technologies) yläkammioon, joka oli päällystetty 100 µL: lla rHCI: tä tai rHCIII: tä. Pohjakammiossa oli täysi makrofagiaine edellä kuvatulla tavalla. 24 tunnin kuluttua insertit poistettiin ja biomateriaalin läpi siirtyneiden Bmdm: ien määrä määritettiin sokkona Zeiss Z1-fluoresenssimikroskoopilla. Tiedot ilmaistiin suhteessa kontrolliin (päällystämättömät kuopat, TS.TCPS), jotta luovuttajien välisen soluvaihtelun vaikutus olisi mahdollisimman pieni.

Makrofagipolarisaatiomääritys

Bmdm: t syntyivät DMEM: ssä täydennettynä 10% FBS: llä, 20% L929-käsitellyllä elatusaineella ja Pen/Strep: llä 7 päivän ajan edellä kuvatulla tavalla. Makrofagiaktivaatiokokeissa soluja stimuloitiin 3 päivän ajan lipopolysakkaridilla (1 µg/ml; Sigma) ja IFN-γ: lla (50 ng/ml; Sigma) M1-aktivaation osalta tai IL-4: llä (20 ng/ml; r&D-systeemeillä) M2-aktivaation osalta. Kokonais-RNA uutettiin Tri-reagenssilla (Zymo Research) valmistajan protokollan mukaan. Alkujuonne cDNA syntetisoitiin Smartscribe-Käänteiskopioijaentsyymillä (Takara Bio USA) ja satunnaisilla Heksameerin alukkeilla (Fisher Scientific). Kohdegeenin mRNA-tasot arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix: llä (Roche) ja LightCycler 480-reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Roche). Sekvenssit primer paria on lueteltu täydentävässä taulukossa 2. MRNA-ilmentymän suhteelliset muutokset määritettiin ∆∆Ct-menetelmällä, ja ne ilmaistiin pitoisuuksina suhteessa 18S: ään. tiedot ilmaistiin suhteessa kontrolliin (päällystämättömät kuopat eli TCPS), jotta minimoitaisiin luovuttajien välisen soluvaihtelun vaikutus.

eloonjääminen H2O2-altistuksen jälkeen

soluja viljeltiin 7 päivän ajan DMEM: ssä, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 20% L929: ää vakioitua elatusainetta ja kynä/streptokokki. Päivänä 7 media muutettiin 0,5 mM vetyperoksidia sisältäväksi dmem: ksi, ja soluja viljeltiin 3 tunnin ajan ennen kuin ne värjättiin 7-AAD: lla virtaussytometriaa varten. Tiedot ilmaistiin suhteessa kontrolliin (päällystämättömät kuopat, TS.TCPS), jotta luovuttajien välisen soluvaihtelun vaikutus olisi mahdollisimman pieni.

tilastoanalyysi

tilastoanalyysi tehtiin käyttäen Kaleida-kaaviota 4. 5®. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± sem. In vivo-tietojen vertailussa hoitojen välillä käytettiin anovaa, jota seurasi Holmin korjaus monivertailuissa. Arpien kokoa analysoitiin käyttämällä moninkertainen regressio, mukaan lukien hoitoryhmä (rHCI, rHCIII ja PBS) ja lähtötilanteen LVEF. RHCI ja rHCIII ennustivat merkittävästi infarktin kokoa verrattuna PBS: ään lähtötilanteen LVEF: n lisäksi. Mallin korrelaatiokerroin on 0,6 käyttäen STATA multiple lineaarista regressiota. In vitro NRVM -, makrofagi-ja sydämen fibroblastitiedot analysoitiin joko opiskelijan t-testillä tai yksisuuntaisella ANOVALLA, jossa Holmin korjaus monivertailuja varten on määritelty kuviolegendoissa.

Raportointikooste

lisätietoja tutkimuksen suunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.