Klodronaattia sisältävien liposomien aiheuttama Makrofagivaje vähentää Neointimaalin muodostumista Ilmapallovaurion jälkeen rotilla ja kaniineilla

by Posted on

Tulehdussoluilla on merkittävä rooli verisuonten korjaamisessa, ja ne otetaan käyttöön välittömästi vamman jälkeen.1, 2 makrofagi-infiltraatio aterektomiassa ja veren monosyyttien aktivaatiotilanne korreloivat lisääntyneeseen restenoosin määrään.3,4 makrofagien vaikutukset restenoosissa johtuvat todennäköisesti niiden kyvystä ilmaista lukuisia kasvutekijöitä, sytokiineja ja entsyymejä, jotka edistävät restenoosin kehittymistä.5 oletimme, että monosyyttien ja makrofagien systeeminen inaktivaatio voi johtaa neointimaalisen muodostumisen vaimenemiseen ja että makrofageilla on keskeinen rooli restenoosin patogeneesissä.

Makrofagivaje voidaan saavuttaa klodronaattia sisältävien liposomien systeemisellä injektiolla.Klodronaatti kuuluu bisfosfonaatteihin (BPs), jotka ovat luuta etsiviä aineita, jotka ovat voimakkaita osteoklastien estäjiä. Muiden BPs: ien tavoin klodronaatilla on huono solukalvon läpäisevyys.7 liposomit imeytyvät helposti retikuloendoteelijärjestelmän soluihin, erityisesti makrofageihin. Liposomivälitteinen klodronaatin toimitus inaktivoi ja tappaa makrofageja tehokkaan fagosytosis8: n jälkeen, mutta se ei ole myrkyllistä nonfagosyyttisoluille.6

menetelmät

liposomit

Klodronaatti (Sifavitor) ja rodamiini RE (Avanti polaariset lipidit) kapseloitiin liposomeihin, jotka koostuivat 50 µmol/L distearoyylifosfatidyyliglyserolista (DSPG) (Avanti), 100 µmol/L kolesterolista (Sigma-kemikaalit) ja 150 µmol/L 1,2-distearoyyli-Sn-glysero-3-Fosfokoliini (Dspc) (Avanti) Käänteisfaasihaihdutustekniikalla, kuten muualla on kuvattu.9 liposomien keskimääräinen koko oli 190±18 nm, 24, 5 mmol/L, klodronaatti ja 20 mmol/L.

LC: n biologisen aktiivisuuden validointi määritettiin makrofagin kaltaisista 264-soluista. LC mutta ei vapaa klodronaatti vähensi merkittävästi elinkykyisten solujen määrää ja proliferaatiota annosriippuvaisesti eikä vaikuttanut sileälihassolujen (SMCs) tai endoteelisolujen (EC) elinkykyyn eikä proliferaatioon enintään 500 µmol/L pitoisuuksilla (tietoja ei näy) julkaistujen tietojen mukaan.8,10

Rabbit Model

New Zealand White rabbits (Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel) punnitsi 2,5-3.5 kg käytettiin Jerusalemin Hebrew University of Jerusalemin ja National Institutes of Healthin (USA) eläinten hoitoa koskevien ohjeiden mukaisesti. Eläimille syötettiin aterogeeninen ruokavalio, jossa oli 2% kolesterolia ja 6% maapähkinäöljyä, alkaen 30 päivää ennen pallolaajennusta. Hyperkolesterolemia todettiin (plasman kolesteroli >1200 mg/dL). Eläimet nukutettiin ksylatsiinilla (7 mg/kg) ja ketamiinilla (40 mg/kg). Hepariinia (200 U/kg), atropiinia (0, 05 mg) ja norfloksasiinin nikotinaattia (70 mg) annettiin. Pallovamma tehtiin vasempaan yhteiseen kaulavaltimoon 3 mm: n pallolaajennuksella pallokatetrilla (Cordis, 2×1 minuutin inflaatio 8 atm). Eläimet jaettiin satunnaisesti laskimonsisäiseen liposomaaliseen tai vapaaseen klodronaattiin (15 mg/kg), tyhjiin liposomeihin tai puskuriin. Koeryhmän tyypille sokaistunut tutkija teki kokeet. Pentotalilla tehdyn eutanasian jälkeen valtimot perfuusiokiinnitettiin in situ 150 mL: lla 4% formaldehydiliuosta (pH 7.4), käsitelty morfometriseen analyysiin ja värjätty Verhoeff elastiinin värjäyksellä, Mayerin hematoksyliinilla ja eosiinilla ja modifioidulla Movat pentakromilla.

Rottamallia

urospuolisia Sabrarottia (Harlan Laboratories), joiden paino oli 350-420 g, käytettiin. Rotan kaulavaltimovammamalli tehtiin aiemmin kuvatulla tavalla.11,12 Liposomaalista klodronaattia (15 mg/kg) pistettiin päivinä -1 ja +6. Elimet kerättiin 14.päivänä ja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla.

Morfometrinen analyysi

kahdeksasta kymmeneen osaan kustakin levystä analysoitiin tietokoneistetulla morfometrisellä analyysillä (nih-Kuva) tutkija, joka oli sokaistunut koeryhmän tyypille. Jakso, jossa luminaali kapeni eniten neointimalla, analysoitiin aiemmin kuvatulla tavalla.11 jäljellä oleva lumen, sisäisen elastisen laminan (alkuperäisen lumenin) rajoittama alue ja ulkoisen elastisen laminan (koko valtimon alueen) rajoittama alue mitattiin suoraan. Neointimaalin paksuuntumisen aste ilmaistiin neointiman ja alkuperäisen lumenin alueen suhteena (%stenoosia) sekä neointimaalin ja väliaineen alueen suhteena (N/M). Remodeling, constrictive (negatiivinen) ja expansiivinen (positiivinen) ja remodeling suhde (RR) arvioitiin vertaamalla suhde koko valtimon alueen ilmapallo-loukkaantunut segmentin kuin viereisen, ei-jujured viite segmentin.

Virtaussytometria

Antikoagulanttiverta (200 µL) inkuboitiin 30 minuutin ajan (4°C, pimeässä) hiiren antihenkilön RPE-konjugoidulla anti-CD14: llä (DAKO). FACS-lysing-liuosta (laimennos 1: 20) lisättiin 15 minuutin ajan. Jäljelle jääneet solut pestiin (×1500 RPM, 5 minuuttia, 4°c) FACS-väliaineessa (PBS, 1% BSA, 0, 02% natriumatsidi) ja suspendoitiin 1 mL: n FACS-väliaineeseen virtaussytometriaa varten. Monosyytit tunnistettiin niiden suhteellisen koon, sivusironnan ja fluoresenssin perusteella.

liposomien jakautuminen

kaniineille annettiin ruiskeena rodamiinilla merkittyjä liposomeja (0, 4 mg / kg) ja LC tai puskuria päivänä -1 ja eutanisoitiin päivinä +1 ja +6. Veren monosyytit erotettiin Ficoll-gradientin (Sigma) ja sentrifugoinnin (×1500 RPM, 5 minuuttia) avulla. Kerätyt kudokset huuhdeltiin suolaliuoksella, osat kiinnitettiin dioihin ja havainnoitiin konfokaalimikroskopialla (Zeiss lsm 410).

immunohistokemia

räjähtäneet näytteet erotettiin lyhyen suolaperfuusion jälkeen ja jäädytettiin välittömästi OCT-yhdisteeseen kryosektiota varten (Ted Pella, Inc). Diat poistettiin, inkuboitiin 1%: lla H2O2: ta metanolissa (10 minuuttia) endogeenisen peroksidaasin estämiseksi ja sitten 10%: lla hevosen seerumia PBS: ää (20 minuuttia). Primaarisia vasta-aineita kanin RAM-11: lle (DAKO) tai PCNA: lle (PC10, DAKO) levitettiin 1 tunnin ajan 37°C: n lämpötilassa. Sen jälkeen osat pestiin PBS: llä, jota seurasi biotinyloitu sekundaarinen vasta-aine (hevosen anti-hiiri IgG, Vector Laboratory) ja avidin-biotiini-peroksidaasikompleksi (ABC Elite kit, Vector Laboratory) 30 minuutin ajan. Värin kehittyminen saatiin aikaan 5 minuutin altistuksella 3,3 ‘ – diaminobentsidiinitetrahydrokloridille (Dab-peroksidaasisubstraatti, Sigma Chemical Co) peroksidaasisubstraatin (Sigma) läsnä ollessa. Dioja torjuttiin hieman Gill No. 3 hematoksyliinilla (Sigma). Positiivista värjäystä arvioitiin mikroskoopilla (Olympus, BX40) arvolla 2×/0.25 10×/0.25 suurennettua ja digitoitua videokuvaa. Makrofagien esiintyvyys arvioitiin positiivisesti värjäytyneiden solujen pinta-alan keskiarvona 5-6 suuritehoisessa kentässä.

IL-1β tuotanto ja transkriptio

näissä tutkimuksissa käytettiin erillisiä eläinryhmiä. Valtimot ja maksa homogenoitiin kollagenaasipuskurissa, ja uute IL-1β mitattiin kaupallisten ELISA-sarjojen avulla (R&D-järjestelmät).

käänteiskopio–polymeraasiketjureaktioanalyysissä (RT-PCR) kaulavaltimoiden RNA erotettiin RNA-eristyspakkauksella (Life Technologies). RNA: n laatua, kokoa ja määrää tutkittiin, ja vyöhykkeiden arvot normalisoitiin β-aktiiniin mRNA-lausekkeeseen.13

matriisin Metalloproteinaasi-2-aktiivisuus

kollagenaasipuskurissa olevan valtimoiden homogenaatin supernatantti analysoitiin kollagenaasiaktiivisuuden varalta. Näytteet eroteltiin liivatekyllästetyistä (1 mg / mL: Difco) SPS 8% polyakryyliamidigeelit pelkistämättömissä olosuhteissa, ravistetaan 30 minuuttia 2, 5% Triton X-100:ssa (BDH), inkuboidaan kollagenaasipuskurissa (16 tuntia, 37°C) ja värjätään 0, 5% Coomassie G 250:lla (Bioradi) metanolissa/etikkahapossa/H2O: ssa (30: 10: 60). Taajuusalueen voimakkuus määritettiin tietokoneistetulla tiheysmittauksella (molekyylidynamiikka tyyppi 300A).

tilastot

tiedot ilmoitetaan keskiarvona±SD. Histologisia löydöksiä vertailtiin kontrolliryhmän ja hoitoryhmän välillä parittamattoman opiskelijan t-testillä. Veren monosyyttien ja sytokiinien vertailu ajan mittaan tehtiin 2-suuntaisella ANOVA-analyysillä. Eroja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä, kun P<0, 05.

tulokset

Postangioplastisen hyperplasian ehkäisy

SMCs: n massiivinen proliferaatio ja solunulkoinen matriksin muodostuminen havaittiin verrokkieläimillä ilmapallovaurion jälkeen (kuva 1, a ja b). Tyhjillä liposomeilla, suolaliuoksella tai vapaana klodronaattina suoritetun hoidon välillä ei havaittu merkitseviä eroja (tulokset yhdistettiin kontrolleiksi). N / M-suhde oli 1, 4±0, 44 (Kuva 1e) ja luminaalistenoosi 75±8%. LC (15 mg/kg, päivät -1 ja +6) pienensi N/M-suhteen arvoon 0,66±0, 2 (Kuva 1, c, d ja e) ja luminaalistenoosin arvoon 41±8%. Lievää laajenevaa luutumista esiintyi molemmissa kontrolleissa (RR=1. 22±0, 24) ja LC-hoitoa saaneilla eläimillä (RR=1, 29±0, 25). LC-hoito ei vaikuttanut mediaaliseen alueeseen, luun morfologiaan eikä mineraalikoostumukseen (tietoja ei näy). Avointa infektiota tai havaittavia systeemisiä haittavaikutuksia ei havaittu.

Kuva 1. Hyperkolesteroleeminen kanin kaulavaltimo 30 päivää pallovamman jälkeen. Käsittelemättömiltä (kontrolli) ja käsitellyiltä (15 mg/kg liposomaalista klodronaattia, päivät -1 ja +6, n=12) kaniineilta saaduista täysikokoisista (A, c ja E, g) ja suuremmista suurennoksista (b, d ja f, h) otetuista Mova-pentakromin (A-D-D) ja Verhoeff-kudoselastiinin värjäyksistä (e-h). Kontrollieläimiä hoidettiin joko puskurilla, vapaalla klodronaatilla (ekvivalenttiannoksilla) tai tyhjillä liposomeilla, ja ne ryhmitettiin kontrollieläimiksi (n=30). Huomaa smcs: n, vaahtosolujen ja solunulkoisen matriisin väheneminen käsitellyssä eläimessä. I, pylväsdiagrammi, jossa näkyvät luminaali -, mediaali -, intimaali – (IEL) – ja KOKONAISVALTIMOALUEET ja neointimaalinen hyperplasia ilmaistuna neointima-ja media-alan keskiarvona (N/M).

makrofagikadon vaikutuksen selvittämiseksi ei-hyperkolesteroleemisessa eläinmallissa (ei vaahtosoluja) käytettiin rotan kaulavaltimon vammamallia.Merkitsevä neointima tukahdutettiin LC-hoidolla, eikä mediaalinen ja valtimoiden kokonaispinta-ala muuttunut merkitsevästi (taulukko).

Liposomaalisen Klodronaatin vaikutukset Neointiman muodostumiseen ja uudestisyntymiseen kuumailmapallossa loukkaantuneen rotan Kaulavaltimomallissa
Lumen, mm2 Intima, mm2 väliaine, mm2 ulkoinen Elastinen Lamina, mm2 n/M % ahtauma Remodeling
rotat saivat LC-hoitoa (15 mg/kg laskimonsisäisesti, päivät-1 ja +6); valtimot analysoitiin 14 päivän kuluttua vammasta (n=12 hoidetussa ryhmässä ja 24 kontrolliryhmässä).
*P<0, 05.
valvonta 0.23±0.02 0.19±0.02 0.12±0.04 0.54±0.02 1.62±0.1 44.2±3.1 1.27±0.3
käsitelty 0.33±0.04* 0.04±0.01* 0.13±0.03 0.52±0.02 0.35±0.06* 12.3±4.3* 1.23±0.6

vaikutusmekanismi

veren monosyyttien ja kudoksen makrofagien väheneminen

monosyyttien lähtötaso oli 2, 8±0, 5% valkosoluista. Ennen leikkausta, 24 tuntia LC-injektion jälkeen, monosyyttien määrä väheni jyrkästi ja oli <0,2% valkosolujen kokonaismäärästä (kuva 2, a ja b), kun taas valkosolujen määrä pysyi muuttumattomana. Kolme päivää leikkauksen jälkeen veren monosyyttien määrä nousi lievästi 3, 5±0, 4%: iin verrokkieläimillä ja 0, 7±0, 7%: iin LC-hoitoa saaneilla eläimillä, mikä palautui lähtötasolle 6 päivän kuluttua (kuva 2C).

kuva 2. Edustava virtaussytometrinen analyysi, joka osoittaa CD14+ monosyyttien määrän kontrollikaniinin perifeerisessä veressä (a) ja 24 tuntia LC-hoidon jälkeen (b). SSC ilmaisee sivusirontaa; rahalaitos, mediaani fluoresoivaa intensiteettiä. Nuoli osoittaa CD14+ – monosyyttiseen populaatioon. C, Viivakaavio esittää CD14+ monosyyttien aikavasteen ilmaistuna veren leukosyyttien kokonaismääränä LC-hoidetuilla ja kontrollipallosta loukkaantuneilla kaniineilla (N=3 kummassakin ryhmässä, *p<0, 05).

maksan ja pernan makrofagit pienenivät LC: llä (RAM 11-värjäyksellä) 6 päivän kuluttua vammasta (kuva 3). Positiivisesti värjäytynyt alue maksassa väheni merkitsevästi 21, 5±4%: sta 14, 7±2, 9%: iin ja pernassa 33, 3±1, 5%: sta 11, 4±3%: iin kontrolloiduilla kaneilla ja LC-hoidetuilla kaneilla. Vastaavasti valtimoiden RAM-11-värjäytymistä havaittiin LC-hoitoa saaneilla kaniineilla 3 ja 6 päivän kuluttua vammasta (Kuva 4).

kuva 3. Immunohistokemialliset fotomikrografit (monoklonaalisen vasta-aineen aiheuttama ruskea sytoplasmatahra Ram-11) kuvaavat makrofagijakaumaa kanin maksassa ja pernassa 6 päivää kaulavaltimon pallovaurion jälkeen (6 kania kummassakin ryhmässä). Makrofagipitoisuuden huomattava väheneminen hoidon jälkeen (15 mg/kg, -1 vrk).

Kuva 4. Konfokaalimikroskopiakuvat, jotka kuvaavat fluoresoivien liposomien (FL) sijoittumista valtimoihin (alempi ja korkeampi suurennos, ylempi ja alempi rivi) ja veren monosyytteihin, maksaan ja pernaan kaniineilla 24 tuntia vamman jälkeen (päivä +1). FL (Rodamiini PE, kontrolli) tai FL ja liposomaalinen klodronaatti (käsitelty, 15 mg/kg) pistettiin päivänä -1. Huomaa, että liposomit talletetaan valtimoon vasta loukkaantumisen jälkeen (pääasiassa väliaineissa) ja vähenevät huomattavasti liposomaalisen klodronaattihoidon jälkeen. Huomaa, että monosyyttien sekä fluoresoivan signaalin määrä maksassa ja pernassa on vähentynyt huomattavasti hoidon jälkeen.

monosyyttien ja makrofagien vähenemistä havaittiin myös fluoresoivien liposomien (FL) injektiolla. Loistesignaalin havaittiin vähenevän huomattavasti veren monosyyteissä (samoin kuin LC-hoitoa saaneiden eläinten lukumäärässä) sekä maksassa ja pernassa (kuva 5). FL havaittiin loukkaantuneissa, mutta ei ehjissä valtimoissa. FL: n samanaikainen käyttö LC: n kanssa vähensi merkittävästi fluoresoivaa signaalia loukkaantuneessa valtimon seinämässä (kuva 5).

kuva 5. Hyperkolesteroleemisten kaniinien RAM-11-immunostettujen valtimojaksojen täysikokoiset (A ja b) ja suuret suurennokset (c ja d) fotomikrografit, joita hoidettiin tyhjillä liposomeilla (kontrolli, vasen paneeli) tai liposomaalisella klodronaatilla (15 mg/kg, päivä -1; käsitelty, oikea paneeli) 3 ja 6 päivän kuluttua vammasta. Makrofageille positiivisesti värjätyn alueen (ruskea) merkittävä pieneneminen LC-käsittelyn jälkeen. Ehjissä valtimoissa ei havaittu värjäytymistä. L tarkoittaa lumenia; M, media; N, neointima; ja A, adventitia.

PCNA: n, IL-1β: n ja matriisin Metalloproteinaasi-2

PCNA: n positiivisesti värjäytynyt pinta-ala 6 päivän kuluttua vammasta pieneni merkittävästi kontrollieläinten 5, 6±2, 6 prosentista LC-käsitellyillä kaniineilla 1, 7±1, 3 prosenttiin (kuva 6, A ja b). Neointimaa ei juuri havaittu tässä varhaisessa vaiheessa, jolloin SMC: n lisääntyminen on maksimaalista.

kuva 6. Kanin valtimoiden fotomikrografit, jotka ovat immunologisesti jakautuvan solun ydinantigeenin aikaansaamia. Verisuonten SMCs: n lisääntyminen havaitaan 6 päivän kuluttua loukkaantumisesta (ruskea ydinvärjäys). valvonta; b, liposomaaliklodronaatilla hoidetut kaniinit (15 mg/kg, vrk -1). Positiivisesti värjäytynyt pinta-ala pieneni merkitsevästi 5, 6±2, 6%: sta 1, 7±1%: iin kontrolloiduilla eläimillä ja LC-hoidetuilla eläimillä (n=5, P<0, 05). L tarkoittaa lumenia, m mediaa ja A adventiittia.

valtimokudoksen il-1β-pitoisuuksien analysointi vamman jälkeen paljasti kellonmuotoisen kuvion, joka oli huipussaan 6 päivän kuluttua vammasta ja palautumassa perusainetasoille 30 päivän kuluttua (kuva 7a), ja LC-hoitoa saaneilla eläimillä havaittiin merkittävä il-1β-tasojen lasku 3 ja 6 päivän kuluttua. Verrokkieläimillä il-1β mRNA-transkriptio oli vahvempi päivänä 3 kuin heikompi ilmaisu 1 päivä vamman jälkeen, mutta LC-hoito vähensi molempia merkitsevästi (Kuva 7b). Maksan IL-1β-pitoisuudet laskivat myös yhden LC-injektion jälkeen päivänä -1, ja ne olivat 30 päivän kohdalla perusarvoja alhaisempia (tietoja ei näy).

Kuva 7. Liposomaalisen klodronaattihoidon (15 mg/kg, vrk -1 ja +6) vaikutus valtimoiden IL-1β-proteiiniin (A ja b) ja MMP-2-aktiivisuuteen (C) kanin valtimoissa (n=8). Il-1β mRNA-transkriptiota kanin valtimoissa (b) tutkittiin ilmapallovamman jälkeen päivänä 0 ja LC-hoitoa päivänä -1; tuloksena olevan reaktioseoksen geelielektroforeesi on osoitettu RT-PCR: n jälkeen. Kaista 1, PCR-merkit (50, 150, 300, 500, 750, 1000 bp); kaistat 2 ja 3: LC-käsitelty ja käsittelemätön päivänä +1; kaistat 4 ja 5: LC-käsitelty ja käsittelemätön päivänä +3. Huomaa vahva signaali (354 bp) il-1β mRNA: n ilmentymisestä käsittelemättömillä eläimillä (kaistat 2 ja 4), joka tukahdutettiin LC-käsittelyllä (kaistat 3 ja 5). Β−aktin mRNA-lauseketta (493 bp) käytettiin kuormituksenohjauksena samoissa näytteissä (alapaneeli). IL-1β mRNA-pitoisuudet (β−aktiini mRNA: han suhteutettu densitometrinen analyysi) olivat 0, 45±0, 24 päivänä +1, 0, 59±0, 2 ja 0, 12±0, 1 päivänä +3 LC-hoidetuilla ja käsittelemättömillä eläimillä (3 riippumatonta RT-PCR-reaktiota).

Valtimomatriisin metalloproteinaasin (MMP-2) aktiivisuus lisääntyi loukkaantumisen jälkeen, jolloin kellonmuotoinen kuvio oli huipussaan 6 päivässä (292±46) ja palasi perusainetasoille 14 päivässä (Kuva 7c). LC lievitti merkittävästi MMP-2: n aktiivisuutta, ja päivänä 6 Se oli vain 52±17.

Keskustelu

tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että makrofagien inaktivointi systeemisellä liposomikapseloidulla klodronaatilla estää luminaalihäviötä ilmapallovaurion jälkeen sekä rotilla että hyperkolesteroleemisilla kaniineilla. Nämä tulokset vahvistavat olettamustamme, että makrofageilla on keskeinen rooli kiihtyneiden arteriopatioiden patogeneesissä. Havaittu luminaalialueen suureneminen saavutettiin pääasiassa neointimaalisen hyperplasian vähenemisen kautta. Myös laajenevan remontin lievää lisääntymistä osoitettiin, mutta sen vaikutus luminalin alueen eroon oli vähäinen.

Klodronaatti kuuluu BPs-ryhmään, joka on kliinisesti käytetty luuhun liittyvissä sairauksissa, mukaan lukien osteoporoosi. Koska vapaat BPs: t ovat erittäin hydrofiilisiä ja negatiivisesti varautuneita, ne ovat lähes kykenemättömiä läpäisemään solukalvoja.7 BP luun resorboivien osteoklastien (jotka ovat peräisin makrofageina veren monosyyteistä) sisäänotto tapahtuu, kun solut nielaisevat huumepäällysteisen luun.Vapaa klodronaatti tai LC eivät estäneet SMC: n tai EY: n proliferaatiota tai neointimaalin muodostumista. Klodronaatin tehokas ja selektiivinen endosytoosi makrofageissa saavutetaan kapseloimalla klodronaattia liposomeihin.9,10,14 fagosytoosin jälkeen lysosomaalinen toiminta häiritsee liposomien rasvapohjia ja vapaa klodronaatti vapautuu soluun aiheuttaen peruuttamattomia toiminnallisia vaurioita ja apoptoosin.8, 15

LC-hoito todennäköisesti keskeytti varhaisen vaiheen vasteen vammaan, joka välittyy makrofagien siirtymänä vasteena MCP-1: n ilmentymiselle.16 LC-injektion antaminen ennen vammaa vähensi voimakkaasti veren monosyyttien määrää (kuva 2) ja makrofagien määrää ja aktiivisuutta maksassa, pernassa ja loukkaantuneessa valtimon seinämässä (kuvat 3, 4 ja 5). Loukkaantumishetkellä käytettävissä olevien monosyyttien väheneminen vähensi intimaalista hyperplasiaa, mikä saattaa olla samanlaista kuin verimonosyyttien deaktivoituminen IL-10.17: n estäessä monosyyttien/makrofagien siirtymisen loukkaantuneeseen verisuoneen lumenista ja/tai adventiiasta (kuva 5) esti näiden solujen vaikutukset SMC: n migraatioon ja proliferaatioon.

IL-1β-ja MMP-2-pitoisuudet pienenivät loukkaantuneilla valtimosegmenteillä LC-hoidon jälkeen. Nämä valtimovaurion jälkeen erittyvät aktivoituneet makrofagit edistävät neointimaalin lisääntymistä.18-20 SMC: n proliferaation väheneminen voi myös vaikuttaa IL-1β: n ja MMP-2.21: n vähenemiseen, mutta koska LC ei vaikuta SMCs: ään eikä ECs: ään eikä fibroblasteihin,makrofagi on todennäköisesti LC: n ensisijainen kohde. Intimaalisen hyperplasian estäminen rottamallissa, jossa valtimossa ei ole vaahtosoluja, tukee edelleen makrofagien systeemistä ehtymistä, koska mekanismi vähentää SMC: n proliferaatiota ja neointimaalin muodostumista. Yhdessä tämä ohimenevä systeeminen immunomodulatorinen ja anti-inflammatorinen vaikutus vähensi SMC: n migraatiota ja proliferaatiota sekä valtimoiden restenoosia.

havaintomme ovat yhtäpitäviä makrofagifunktion eri modaliteettien mukauttamisen jälkeen Havaittujen suotuisten vaikutusten kanssa. Neointiman muodostumisen väheneminen vamman jälkeen saavutettiin kaniineilla Mac-122: n salpauksella ja Mac-1: n puutteesta kärsivillä hiirillä.23 niinpä viimeaikaisten raporttien mukaan 9,17,22,23 tulehdusprosessilla on keskeinen rooli neointiman muodostumisen kaskadissa. Makrofagikato vähentää myös suonensiirtojen hyperplasiaa.24 huolimatta eri patologian kannalta laukaista, vaikuttaa aluksen, alla plakin angioplasted Valtimo, koostumus stenoottisen kudoksen, ja prosessin kesto, positiivinen vaikutus laskimoon siirteen malli viittaa yhteinen rooli makrofagien stimuloimaan verisuonten intimal hyperplasia.

vaikutukset ja rajoitukset

Vapaa klodronaatti ei läpäise soluja, ja sen puoliintumisaika systeemisessä verenkierrossa on lyhyt.6 kuolleista makrofageista ja liposomeista vuotava Klodronaatti ei kerry merkittävässä määrin muihin kudoksiin kuin luuhun. LC-hoidon jälkeen ei havaittu vaikutusta somaattiseen kasvuun eikä seerumin mineraalipitoisuuteen, sillä liposomimuodon, kuten useimpien muidenkin liposomien ja hiukkasten annostelujärjestelmien, tulos oli retikuloendoteelijärjestelmässä. Lisäksi kahdella pistoksella 15 mg/kg vapaata klodronaattia ei pitäisi olla vaikutusta normaaliin luuhun.25

makrofagien Inaktivaatioon liittyy immunosuppression ja infektion vaara. Kuten Mac-1–puutostutkimuksissa mice26: lla ja rotilla,24 tutkimuksessamme ei kuitenkaan havaittu avointa infektiota, johon liittyi ohimenevä makrofagivaje. Tässä tutkimuksessa veren monosyytit toipuivat täysin 6 päivän kuluttua injektiosta ja IL-1β-pitoisuudet palasivat perusainetasoille. Toiset ovat osoittaneet, että makrofagifunktion palautuminen 4-6 päivän kuluttua LC: n aiheuttamasta ehtymisestä ei aiheuta pitkäaikaisia toksisia vaikutuksia.6, 14 systeemiseen LC: hen liittyvän ohimenevän, osittaisen maksavajeen ja pernan makrofagien aiheuttaman makrofagivajeen kliinistä merkitystä on tutkittava tarkemmin ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa.

suuri määrä raportteja farmakologisista yrityksistä estää intimaalista hyperplasiaa eläimillä ei johtanut myöhempään restenoosin estoon ihmisillä. Nykyinen tutkimus käyttää LC: tä tutkimusvälineenä selvittääkseen tulehduksen roolia verisuonten korjauksessa ja synnynnäisen immuniteetin moduloinnin mahdollista arvoa intimaalisen hyperplasian vähentämisessä. Hyöty havaittiin kahdessa eläinmallissa, rotalla ja hyperkolesteroleemisella kanilla, joilla oli erilaisia vammoja ja eriasteisia tulehduksia, tukee monosyyttien ja makrofagien merkittävää roolia verisuonten korjaamisessa ja lisää restenoosin eston ennustavaa arvoa ihmisillä.

makrofagipitoisia alueita esiintyy herkästi ateroskleroottisissa leesioissa potilailla,joilla on epästabiili angina pectoris ja akuutti sydäninfarkti, 3 ja makrofagit todennäköisesti välittävät ateroskleroottisen plakin repeämistä ja äkillistä sepelvaltimotautia.27 lisätutkimukset ovat aiheellisia sen tutkimiseksi, voiko liposomaalisten bisfosfonaattien aiheuttama makrofagivaje auttaa vakauttamaan muita tulehdusvälitteisiä verisuonisairauksia ja kardiomyopatioita, mukaan lukien akuutit sepelvaltimotautioireet.

yhteenvetona voidaan todeta, että LC: n antaminen esti neointimaalin proliferaatiota ilmapallovaurion jälkeen rotilla ja hyperkolesteroleemisissa kanimalleissa. Ehdotettu mekanismi on systeeminen selektiivinen, ohimenevä monosyyttien/makrofagien aktiivisuuden modulaatio. Vaikka makrofagit ovat neointimaalisessa kudoksessa suhteellisen niukkoja, niillä on suuri merkitys neointimaalin proliferaatiossa. Siksi varhainen modulaatio ja makrofagien inaktivointi 1 viikon ajan vamman jälkeen vähentävät merkitsevästi postangioplastia valtimoiden kaventumista myöhemmin.

tätä tutkimusta tukivat osittain “Hadasit” Medical Research Fund ja Hebrew University Research Funds (Drs Danenberg ja Golomb); Israel Science Foundation No. 126/00 (Drs Golomb ja Danenberg); Biorest (Drs Danenberg ja Golomb); ja teknisen kehityksen keskus, Suomi (tohtori Mönkkönen). Tri Golomb on sidoksissa David R. Bloomin farmasian keskukseen Jerusalemin heprealaisessa yliopistossa.

alaviitteet

kirjeenvaihto Tri Haim D. Danenbergille, kardiologian laitos, Hadassahin yliopistollinen sairaala, Jerusalem 91120, Israel (sähköposti ), tai Tri Gershon Golombille, Farmasian laitos, Lääketieteellinen tiedekunta, Jerusalemin heprealainen yliopisto, Box 12065, Jerusalem 91120, Israel (Sähköposti ).
  • 1 Hanke H, Hassenstein S, Ulmer a ym. Accumulation of macrophages in the arterial vessel wall following experimental balloon angioplasty. Eur Heart J. 1994; 15: 691–698.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 2 Hancock W, Adams D, Wyner L, et al. CD4+ mononuclear cells induce cytokine expression, vascular smooth muscle cell proliferation, and arterial occlusion after endothelial injury. Am J Pathol. 1994; 145: 1008–1014.MedlineGoogle Scholar
  • 3 Moreno P, Falk E, Palacios I, et al. Macrophage infiltration in acute coronary syndromes: implications for plaque rupture. Circulation. 1994; 90: 775–778.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 4 Pietersma A, Koflard M, Wit EA, et al. Myöhäinen lumenmenetys sepelvaltimon pallolaajennuksen jälkeen liittyy verenkierrossa olevien fagosyyttien aktivaatiotilaan ennen hoitoa. Verenkierto. 1995; 91: 1320–1325.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 5 Libby P, Shcwartz D, Brogi E, et al. Kaskadimalli restenoosille: ateroskleroosin etenemisen erikoistapaus. Verenkierto. 1992; 86 (suppl III): III-47–III-52.LinkGoogle Scholar
  • 6 van Rooijen N, Sanders A. Liposomivälitteinen makrofagien ehtyminen: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J Immunol Methods. 1994; 174: 83–93.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 7 Rodan GA. Mechanisms of action of bisphosphonates. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1998; 38: 375–388.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 8 Selander K, Monkkonen J, Karhukorpi E, et al. Characteristics of the clodronate-induced apoptosis in osteoclasts and macrophages. Mol Pharmacol. 1996; 50: 1127–1138.MedlineGoogle Scholar
  • 9 Mönkkönen J, Taskinen M, Auriolal SOK, et al. Liposomien kapseloimilla kalsiumiin sitoutuvilla ja vapailla bisfosfonaateilla tapahtuva makrofagin kaltaisten ja muiden solutyyppien kasvun estäminen in vitro. J-Huumekohde. 1994; 2: 299–308.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 10 Mönkkönen J, Heath T. the effects of liposome-encapsulated and free clodronate on the growth of macrophage-like cells in vitro: the role of calcium and iron. Calcif Tissue Int. 1993; 53: 139–146.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 11 Fishbein I, Waltenberger J, Banai s, et al. Trombosyyttipohjaisen kasvutekijäreseptorispesifisen tyrfostiinin paikallinen toimitus estää neointimaalin muodostumista rotilla. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000; 20: 667–676.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 12 Golomb G, Fishbein I, Banai s, et al. Tyrfostiinin kontrolloitu toimitus estää intimaalista hyperplasiaa rotan kaulavaltimon vammamallissa. Ateroskleroosi. 1996; 125: 171–182.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 13 Chamberlain J, Gunn J, Francis S, et al. Interleukiini-1 beetan ajallinen ja alueellinen jakautuminen pallossa vahingoittuneissa sian sepelvaltimoissa. Cardiovasc Res. 1999; 44: 156–165.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 14 van Rooijen N, Sanders A. makrofagien eliminointi, estäminen ja aktivointi: kolmoset? J Leukoc Biol. 1997; 62: 702–709.CrossrefMedlineGoogle-tutkija
  • 15 van Rooijen N, Sanders A, van den Berg T. klodronaatin ja propamidiinin liposomivälitteisen solunsisäisen toimituksen aiheuttama makrofagien apoptoosi. J Immunol-Menetelmät. 1996; 193: 93–99.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 16 Cipollone F, Marini M, Fazia m, et al. Suurentuneet verenkierrossa olevat monosyyttien solunsalpaajaproteiini – 1-pitoisuudet potilailla, joilla on restenoosi sepelvaltimon pallolaajennuksen jälkeen. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001; 21: 327–334.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 17 Feldman L, Aguirre L, Ziol M, et al. Interleukiini-10 estää hyperkolesteroleemisilla kaniineilla pallolaajennuksen tai stentin implantaation jälkeen neointimaalista hyperplasiaa. Verenkierto. 2000; 101: 908–916.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 18 Libby P, Schwartz D, Brogi E, et al. Kaskadimalli restenoosille: ateroskleroosin etenemisen erikoistapaus. Verenkierto. 1992; 86 (suppl III): III-47-III-52.LinkGoogle Scholar
  • 19 Strauss B, Robinson R, Batchelor W, et al. In vivo kollageenin vaihtuvuus kokeellisen pallolaajennusvamman jälkeen ja matriisimetalloproteinaasien rooli. Circ Res. 1996; 79: 541-550.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 20 Wang X, Romanic A, Yue t, et al. Interleukiini-1betan, interleukiini-1-reseptorin ja interleukiini-1-reseptorin antagonistin mRNA: n ilmentyminen rotan kaulavaltimossa pallolaajennuksen jälkeen. Biochem Biophys Res Commun. 2000; 29: 138–143.Google Scholar
  • 21 Shofuda K, Yasumitso H, Nishihashi A, et al. Kolmen kalvotyyppisen matriisimetalloproteinaasin (MT-MMPs) ilmentyminen rotan verisuonten sileälihassoluissa ja MT3-MMPs: n luonnehtiminen transmembraanidomeenin kanssa ja ilman sitä. J Biol Chem. 1997; 272: 9749–9754.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 22 Rogers C, Edelman ER, Simon DI. MAb-arvo B2-leukosyytti-integriini Mac-1: een (CD11b/CD18) vähentää intimaalin paksuuntumista pallolaajennuksen tai stentti-implantaation jälkeen kaniineilla. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 10134-20239.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 23 Simon D, Chen Z, Seifert P, et al. Vähentynyt neointimuodostus Macissa-1−/− hiiret paljastavat tulehduksen roolin verisuonten korjauksessa pallolaajennuksen jälkeen. J Clin Invest. 2000; 105: 293–300.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 24 Hoch JR, Stark VK, van Rooijen N, et al. Makrofagikato muuttaa suonensiirteen intimaalista hyperplasiaa. Leikkaus. 1999; 126: 428–437.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 25 Rodan GA, Balena R. Bisfosfonates in the treatment of metabolic bone diseases. Ann Med. 1993; 25: 373–378.CrossrefMedlineGoogle Scholar
  • 26 Lu H, Smith C, Perrard J, et al. LFA-1 riittää välittämään neutrofiilien emigraatiota Mac-1-puutoksesta kärsivillä hiirillä. J Clin Invest. 1997; 99: 1340–1350.CrossrefMedlineGoogle-tutkija
  • 27 Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, et al. Sepelvaltimotaudin patogeneesi ja akuutit sepelvaltimotautioireet (1). N Engl J Med. 1992; 326: 242–250.CrossrefMedlineGoogle-Tutkija

Published by admin

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.