Kloramfenikoliasetyylitransferaasi klamydiatransformaation valintamarkkerina

pgfp::SW2, Wangin et alin rakentama sukkulavektori, sisälsi β-laktamaasigeenin valintamarkkerina. Se kantaa myös kissan geeniä, joka on fuusioitunut GFP-geeniin . Havaitsimme, että Pgfp: llä muunnettu E. coli:: SW2-plasmidi pystyi kasvamaan kloramfenikolia sisältävässä väliaineessa (lopullinen pitoisuus: 170 µg / ml), mikä viittaa siihen, että kissan geeniä voidaan käyttää myös valintamarkkerina klamydian transformaatiokokeissa. Kuten varoitti Wang et al., kloramfenikolin haitallinen vaikutus isäntämitokondrioihin, kuten Li et al. saattaa vaikuttaa tämän antibiootin hyödyllisyyteen klamydian transformaatiossa . In Li et al.raportin mukaan kloramfenikolin toksinen vähimmäispitoisuus oli 10 µg/ml, mikä vähensi ATP: n tuotantoa lievästi 20%. Olemme selvittäneet, että näennäisen alhaisin kloramfenikolipitoisuus, joka täysin esti inkluusiota plasmidittomassa C: ssä. trachomatis L2-kannan L2R-arvo oli vain 0, 05 µg / ml (tietoja ei näy), mikä oli huomattavasti isäntäsoluille myrkyllisiä pitoisuuksia pienempi. Siksi ajattelimme, että tätä antibioottia voitaisiin käyttää kissaa ilmentävien transformanttien valitsemiseen ilman, että isäntäsolut merkittävästi stressaantuisivat.

muutimme L2R: n pgfp:: SW2: lla ja valitsimme puolet muuntuneista soluista ampisilliinillä ja toinen puoli kloramfenikolilla. Antibiootit (2 µg/ml ampisilliinia tai 0, 1 µg/ml kloramfenikolia) lisättiin viljelmiin 10 tunnin kuluttua muuntumisesta. Siirrosta 2 alkaen niiden pitoisuudet nostettiin 5 µg/ml: aan ja 0, 2 µg / ml: aan, ja ne lisättiin inokulaation yhteydessä. Jakeiden välinen jakosuhde säilyi 1: 1 kohdasta 1 vaikka kohdasta 4. Vaikka kloramfenikolin MIC, joka määritettiin pienellä multiplicity of infection (~0,1 inclusion-forming units per cell), oli 0,05 µg/ml, joidenkin transformoitumattomien klamydioiden odotettiin muodostavan sulkeumia 0,1 – 0 läsnä ollessa.2 µg/ml antibiootti, koska käytimme korkea EB-solujen suhde transformaatio, ja tehoa klamydian kasvun estyminen antibioottien vaikuttaa moninaisuus infektio . Edellä kuvatun valintaprotokollan avulla faasikontrastimikroskoopilla valituissa viljelmissä havaittiin lähes 100-prosenttisissa soluissa poikkeavaa RBs: ää alkutaipaleella. Poikkeavia RB: tä sisältäviä sulkeumia oli vielä pienessä osassa soluista passage 2: ssa, mutta ne korvautuivat enimmäkseen näennäisesti normaaleilla sulkeumilla passage 3: ssa. Normaaleja sulkeumia havaittiin noin 20%: ssa soluista, ja poikkeavia sulkeumia havaittiin harvoin kohdassa 4. Kohdassa 5, joka johtui inokulaatiosta ja 10% sadosta kohdasta 4, sulkeumia havaittiin 80%: ssa soluista; ilmeisesti yksikään näistä sulkeumista ei sisältänyt poikkeavaa RBs: ää.

koska kloramfenikoli ei aiheuta klamydian poikkeavaa RBs: ää, arvioimme resistenssin antibiootille sen koon perusteella, mikä on valmisteen sisältämä annos. Normaalia pienempiä sulkeumia havaittiin lähes kaikissa soluissa 1. Joitakin, mutta hyvin pienikokoisia, sulkeumia löytyi kohdasta 2, ja useimmat niistä korvattiin normaalikokoisilla sulkeumilla kohdassa 3. Normaalikokoisia sulkeumia löytyi yli 20% soluista kohdassa 4. Kohdassa 5, joka johdettiin inokulaation jälkeen 10%: n siirroksella 4 sadonkorjuu ja kloramfenikolipitoisuuden nousu (0,2 µg / ml: sta 0,5 µg/ml: aan), havaittiin normaalikokoisia sulkeumia lähes 100%: n soluissa 0000000.

valinta-aineiden näennäisen resistenssin lisäksi käytimme GFP-ekspressiota ja glykogeenisynteesin restaurointia lisämerkkeinä onnistuneeseen transformaatioon . Kohdasta 5 kerättyjä EBs:iä käytettiin McCoyn solujen infektoimiseen laimennusnopeudella 1: 100 (solulukuekvivalenssi) kokeissa, joissa määritettiin GFP-ekspressiota ja glykogeenisynteesiä (kuva 2). Kuten odotettiin, villin tyypin plasmiditäytteinen C. trachomatis L2 (434/bu) (Kuva 2A) tai transformoimaton plasmiditon L2R (Kuva 2b) ei ilmaissut GFP: tä. Yhdenmukainen vahvistettujen havaintojen kanssa, että glykogeenisynteesi C: ssä. trachomatis vaatii plasmidinsa, joditahra osoitti glykogeenin kertyneen villin tyypin L2 (Kuva 2a) sulkeumiin, mutta ei L2R: n (kuva 2b). Kun läsnä oli 5 µg/ml ampisilliinia, joka estää RB-jakautumista, muuntumaton L2R (Kuva 2C) muodosti sulkeumia, jotka sisälsivät jättimäisiä RBs: iä tuottamatta glykogeenia; kun taas kloramfenikoli (lopullinen pitoisuus: 0,5 µg/ml) esti täysin näkyvien sulkeumien muodostumisen L2R-infektoituneissa soluissa (Kuva 2D). Yhdenmukainen Wang et al: n julkaisemien tietojen kanssa. , pGFP::SW2-muuntunut L2R valittu ampisilliinilla muodostettu GFP-positiivinen sulkeuma glykogeenin kanssa (kuva 2e). pGFP:: kloramfenikolilla valittu SW2-muunnettu L2R muodosti myös glykogeenia sisältäviä GFP-positiivisia sulkeumia (Kuva 2F). Kuten odotettiin, ampisilliinin valitut transformantit kykenivät muodostamaan normaalikokoisia, GFP-positiivisia glykogeenia sisältäviä sulkeumia kloramfenikolin läsnä ollessa (Kuva 2G); samoin kloramfenikolin valitut transformantit olivat täysin resistenttejä ampisilliinille, ilmaistuna GFP: nä ja tuotettuna glykogeeninä (Kuva 2h). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kissan geeni pGFP: ssä::SW2-plasmidi toimii klamydiassa, ja kloramfenikoliresistenssiä voidaan käyttää klamydian transformaation valintamarkkerina.

Inclusion, GFP expression ja glykogeenisynteesi pGFP:: SW2 transformantit C . trachomatis L2. Transformoimaton plasmiditäytteinen kanta 434/bu (a), muuntamaton plasmiditon kanta L2R (B-D) ja muuntunut L2R, jotka valittiin joko ampisilliinilla (E, G) tai kloramfenikolilla (F, H), viljeltiin joko tiettyä antibioottia sisältävällä väliaineella tai antibiootittomalla väliaineella. Kuvat sulkeumista varastoimattomiin ja jodilla värjättyihin viljelmiin hankittiin faasikontrastimikroskopialla tai 48 h: n fluoresenssimikroskopialla inokulaation jälkeen. Kaikissa paneeleissa vaihekontrastit ja GFP-kuvat ovat päällekkäisiä.

seuraavaksi poistimme pgfp: stä β-laktamaasigeenin::SW2 – plasmidi “menetelmät”-osiossa kuvatulla tavalla, ja käytti tuloksena saatua PGFP-CAT::SW2-plasmidia L2R: n muuntamiseen. Transformoituneet klamydiat altistettiin kloramfenikolille käyttäen edellä kuvattua menetelmää. Kloramfenikolille resistenttejä sulkeumia syntyi noin 20%: ssa tartunnan saaneista soluista läpikulkuviljelmässä 4. Fluoresenssimikroskopia ja joditahra paljastivat GFP-ja glykogeenipositiiviset sulkeumat soluissa, jotka olivat saaneet EBS-tartunnan kohdasta 5 ja joita viljeltiin kloramfenikolin läsnä ollessa (kuva 3, Ylempi paneeli). Pgfp-CAT::SW2-plasmidissa esiintyneen β-laktamaasin puutteen vuoksi transformantit eivät kuitenkaan pystyneet muodostamaan normaaleja sulkeumia ampisilliinin läsnä ollessa, vaan niiden sulkeumat täytettiin poikkeavalla RBs: llä. Vaikka epäsäännölliset sulkeumat olivat edelleen positiivisia GFP: lle, ne olivat suurelta osin vapaita glykogeenistä (kuva 3, alempi paneeli). Kohdan 5 jälkeen pgfp-CAT::SW2-transformantteja viljeltiin 0,5 µg / ml kloramfenikolilla neljän muun kohdan osalta jakosuhteella 1: 100 kunkin kohdan osalta. Kaikki sulkeumat kohdassa 9 olivat samannäköisiä kuin plasmidi-Replete klamydiae eikä plasmiditon L2R, ja kaikkien havaittiin ilmentävän GFP: tä (tietoja ei näytetä). Nämä tulokset todistavat, että PGFP-CAT::SW2-plasmidin CAT-geeni, joka on samanlainen kuin pGFP::SW2-plasmidi, toimii valintamarkkerina C. trachomatis-transformaatiolle.

Inclusion, GFP expression ja glykogeenin synteesin L2R muunnetaan pgfp-CAT:: SW2. Kloramfenikolin valikoiduilla muuntajilla infektoituneet solut altistettiin joko kloramfenikolille tai ampisilliinille. Kuvat sulkeumista varastoimattomiin ja jodilla värjättyihin viljelmiin hankittiin faasikontrastimikroskopialla tai 48 h: n fluoresenssimikroskopialla inokulaation jälkeen. Vaihekontrastit ja GFP-kuvat ovat päällekkäisiä.

on huomattava, että Tam et al. on aiemmin yrittänyt kehittää transformaatiojärjestelmää, jossa kissan geeni on selektiivinen markkeri . Kyseisessä tutkimuksessa SUKKULAVEKTORI, joka sisälsi kissan geenin, galvanoitiin C: n EBs: ksi. trachomatis E (kanta UW-5 / CX) ja L2 (kanta 434/Bu). Vaikka sekä kissan mRNA-että entsyymiaktiivisuus oli havaittavissa transformoituneen klamydian alkuperäisviljelmissä, tekijät eivät onnistuneet saamaan stabiileja transformantteja kloramfenikolin valinnan jälkeen 4 kohdan osalta. On tärkeää huomata, että molemmat galvanoidut kannat sisältävät natiivia plasmidia, jolla on sama replikaatioalkuperä kuin muuntamiseen käytetyllä rekombinantilla plasmidilla . Lähtien Wang et al. pystyivät saamaan pysyviä penisilliinille vastustuskykyisiä muuntajia vain L2R: stä, joka on plasmiditon C. trachomatis L2 variantti, mutta ei villi-tyyppi, plasmiditäydennys 434 / Bu, muuten identtisissä kokeellisissa asetuksissa , ei ole jälkikäteen yllättävää, että Tam et al. ei saatu stabiilia kloramfenikoliresistenttiä klamydiaa.