Klotianidiinin siementen käsittelyllä ei ole havaittavaa negatiivista vaikutusta mehiläisyhdyskuntiin ja niiden patogeeneihin

tutkimussuunnitelma

vuonna 2013 Etelä-Ruotsissa yhteensä 16 pellolla (8,9 ± 5,4 ha; keskiarvo ± s.d.), jotka on tarkoitettu keväällä kylvetyille rapseille (Brassica napus L.) yhdistettiin maantieteellisen läheisyyden (mutta erotuksena >4 km) ja maankäytön (Kuva. 1, ks. edellä). Ympäröivä maisema tarkastettiin kukkivien kasvien puuttumisen vuoksi. Vuonna 2013 tutkimuksessa oli kuitenkin edelleen kaksi peltoa, vaikka lähistöllä oli toinenkin rapsipelto, jotta viljelypareja olisi säilynyt mahdollisimman paljon 34. Kussakin viljelyparissa yhdelle pellolle kylvettiin sattumanvaraisesti klotianidiinilla käsiteltyjä rapsinsiemeniä, kun taas toiselle pellolle kylvettiin siemeniä, joita ei käsitelty klotianidiinilla (käsitelty: 8; kontrolli: 8). Vuonna 2014 käytettiin samoja paritiloja, mutta käsittelyjen kääntyessä toisin päin eli vuonna 2013 käsitellyillä paikoilla oli kontrollipeltoja vuonna 2014 ja päinvastoin (käsitelty: 6; kontrolli: 4). Viljelykierron vuoksi kunkin tilan eri pellot olivat käytössä vuosina 2013 ja 2014 (kuva. 1, ks. edellä). Jotta luoda Fig. 1, latasimme kartan World Borders-tietokannasta (ladattavissa täältä: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

tiedot eri tilojen ympäröivistä maisemamuuttujista vuonna 2014 on esitetty täydentävässä taulukossa 7. Vuonna 2014 puolessa polttopelloista oli 2 kilometrin säteellä lisää keväällä kylvettyjä rapseja (1-13 ha). Polttokenttien klotianidiinikäsitellyt siemenet päällystettiin eladolla, joka on kahden vaikuttavan aineen tavaramerkittyä sekoitusta.: klotianidiini (400 g l−1) Ja β-syflutriini (+80 g l−1) valittiin tähän tutkimukseen, koska se oli vallitseva siementen hyönteismyrkkykäsittely rapsissa Ruotsissa ja muualla Euroopassa63. Kasvi ottaa klotianidiinin ja jakaa sen kaikkiin osiin systeemisesti hyönteisiltä suojautumiseksi64. β-Syflutriinia ei pidetä systeemisenä, eikä jäämiä havaittu tässä tutkimuksessa kerätyissä näytteissä34. Sekä klotianidilla käsitellyt että verrokkisiemenet päällystettiin fungisidi tiraamilla vuonna 2013.

tutkimukseen osallistuneita viljelijöitä kehotettiin olemaan käyttämättä muita neonikotinoideja pelloilla tutkimuksen aikana, vaikka tuholaistorjuntaan käytettiin muita hyönteismyrkkyjä, pääasiassa plenumia (pymetrotsiini), Avaunt/stuertti (indoksakarbi) ja Mavrikia (tau-fluvalinaatti; käytetään myös varroasidina mehiläishoidossa). Biscaya, joka on kauppanimi neonikotinoiditiaklopridia sisältävälle suihkutusmuodolle, levitettiin kuitenkin yhteen kontrollikenttään vuonna 2013, jota seurasi mavrik−suihke 1 viikkoa myöhemmin, ja yhteen käsiteltyyn kenttään vuonna 2014, molemmilla kerroilla 0,3 L ha-1. Tiaklopridin Välitön myrkyllisyys mehiläisille on huomattavasti pienempi kuin klotianidin65, ja vuonna 2013 siitepöly -, mesi-ja mehiläisnäytteissä havaittiin vain vähäisiä määriä tiaklopridia ja vuonna 2014 Ei yhtään. Kun taas Rundlöf et al.34 tulokset eivät muuttuneet, kun analyysien ulkopuolelle jätettiin Biscajaa koskevat alat, havaitsimme joitakin laadullisia muutoksia (täydentävä Taulukko 9). Nämä muutokset voivat johtua vuonna 2014 havaituista korkeammista tiaklopridijäämistä, mutta ne eivät yhtä hyvin voi liittyä Biskajaan vaan pikemminkin Biskajan/Mavrikin ja käytettyjen vaihtoehtoisten hyönteismyrkkysumuteyhdistelmien34 väliseen eroon tai johtua vähentyneestä tilastollisesta tehosta.

Mehiläisyhdyskunnat

ammattimainen mehiläishoitaja valmisti toukokuun 2013 lopussa satakuusitoista mehiläisyhdyskuntaa yksittäisissä täysikokoisissa Langstrot-pesissä, joissa oli kaksi kammaa, joissa oli pääasiassa suljettuja poikueita (mehiläisten kanssa), kaksi täyttä hunajakennoa (mehiläisten kanssa), yksi vedetty tyhjä kampa, viisi vahaperustettua kammaa, kahdesta kammasta ravistettuja mehiläisiä ja joko 1-vuotias (84 koeyhdyskuntaa) tai 2-vuotias (12 koeyhdyskuntaa) lisäksi 20 varasiirtokuntaa) kuningatar, jonka tiedetään tuottavan suhteellisen pieniä, samankokoisia (3418 ± 123 aikuista mehiläistä; keskiarvo ± S.E.M.; n = 96 pesäkettä) pesäkkeitä, joissa on runsaasti kasvutilaa ja jotka voivat tulla tarpeeksi vahvoiksi selviytyäkseen tulevasta talvesta, mutta eivät kasva ulos tilastaan kesän aikana. Kullakin 16 rapsipellolla (yhteensä 96 pesäkettä) pellonreunalle sijoitettiin kuusi koeyhdyskuntaa 14.-28. kesäkuuta 2013 rapsin kukinnan alkaessa (täydentävä Kuva. 1). Kuningatarperinne ja-ikä täsmäsivät tarhaparien kesken, mutta yhdyskunnat jakautuivat muuten sattumanvaraisesti. Pesäkkeitä pidettiin 60 hehtaarin luonnonmukaisesti hoidetulla talvirapsipellolla täydessä kukassa ennen sijoittamista 16 koepellolle (täydentävä Kuva. 1) sen varmistamiseksi, että ennen koetta yhdyskunnan kasvu perustui mahdollisimman paljon torjunta-aineettomaan ravinnon keräämiseen.

kun rapsin kukinta koepellolla oli lakannut, siirtomaat siirrettiin 2.-31. heinäkuuta (Täydennysviikuna. 1) yhteiseen mehiläispesään talvehtimaan. Pesäkkeille tehtiin 10. elokuuta muurahaishappohöyrykäsittely Varroa-punkkia vastaan, jossa 20 ml 60-prosenttista muurahaishappoa liotettiin litteään kotitaloussieneen, joka asetettiin sisäkannen alle kehysten päälle. Pesäkkeille syötettiin yhteensä 20 kg sokeria pesäkettä kohti 55-60–prosenttisena v/v sakkaroosiliuoksena, joka toimitettiin ruokintalaatikkoon kolmeen otteeseen elo-syyskuussa 2013. Kevyt Varroa-lisäkäsittely tehtiin 4. joulukuuta ripottelemalla kehysten väliin 30 ml 2,6-prosenttista oksaalihappoa 60-prosenttisessa sakkaroosissa suoraan mehiläisten ryppääseen. Keväällä 2014 siirtomaat siirrettiin luonnonmukaisesti hoidetulle rapsipellolle ennen sijoittamista 10 keväällä kylvetylle rapsipellolle (Täydennyskuva. 1). Pesäkkeitä harkittiin sisällytettäviksi tutkimuksen 2014-osaan, jos niillä oli 2-vuotias, muniva kuningatar huhtikuussa 2014 (lukuun ottamatta pesäkkeitä, jotka kuolivat, queenasivat uudelleen tai joilla oli 3-vuotiaat kuningattaret huhtikuussa 2014) ja jotka eivät olleet parveilleet kesäkuun 2014 alkuun mennessä. Näiden rajoitusten lisäksi edellytettiin, että pesäkkeet altistetaan/altistetaan klotianidiinille molempina kokeiluvuosina, minkä vuoksi vuonna 2014 kullekin pellolle voitiin myöntää vain neljä pesäkettä. Käsiteltyjen kenttien vuonna 2013 sijoittamat pesäkkeet sijoitettiin jälleen käsiteltyihin kenttiin vuonna 2014, jotta voitiin arvioida monivuotisen klotianidiinialtistuksen kumulatiivisia vaikutuksia, mutta ne satunnaistettiin muuten uudelleen ennen sijoittamista tahattomien harhojen minimoimiseksi. Tästä huolimatta kaksi kontrolliyhdyskuntaa vuodelta 2013 jouduttiin sijoittamaan klotianidilla käsitellylle pellolle vuonna 2014, koska vaatimukset täyttäviä altistuneita pesäkkeitä ei ollut riittävästi kuudelle klotianidilla käsitellylle pellolle. Pesäkkeitä riitti neljälle kontrollikentälle. Pesäkkeiden vahvuus tasattiin vuoden 2013 osalta kuvatulla tavalla, mutta vain kunkin hoitoryhmän sisällä. Siirtokunnat pienenivät ja tasaantuivat toisen kerran (8. kesäkuuta 2014), kun osa niistä kasvoi liian suuriksi ja yritti parveilla (täydentävä Kuva. 1). Jokainen pienennetty pesäke sisälsi 1 täyden hunajakampauksen (mehiläisten kanssa), 3 kammaa, joissa oli pääasiassa suljettu poikue (mehiläisten kanssa), sekä alkuperäisen kuningattaren vuodelta 2013 ja 6 kammaa vahaperustuksella. Pesäkkeitä siirrettiin kevätrapsipelloille 16. -25. kesäkuuta 2014 ja tuotiin takaisin yhteiselle talvehtimispaikalle 14. -22. heinäkuuta 2014 (täydentävä Kuva. 1).

Jäämäanalyysi

klotianidiinialtistuksen vahvistamiseksi, 24 täysikasvuista tarhamehiläistä pesän suulta pyydettyä peltoa kohti, 5: ltä rapsipelloilta ravinnoksi pyydetyltä tarhamehiläiseltä kerätyt siitepölypelletit ja 5: ltä rapsipelloilta ravintoa etsivältä mesimehiläiseltä mahasta poistettu nektari analysoitiin jokaiselta kasvupaikalta klotianidiinijäämien varalta. Siitepöly (>25 ml) kerättiin siitepölyansoilla, joita asennettiin yhden päivän ajan kolmeen pesäkkeeseen kasvipaikkaa kohti ja analysoitiin kasvilajien alkuperää. Näytteitä käsiteltiin ja analysoitiin kuten asiassa Rundlöf et al.34 ja jotka on kerätty kumpanakin vuonna kukkaviljelmän huippuarvioinnin aikana(täydentävä Kuva. 1), jossa klotianidiinin ja neljän muun Ruotsissa käytetyn neonikotinoidin pitoisuudet (täydentävä Taulukko 2) kvantifioidaan nestekromatografialla yhdistettynä tandem-massaspektrometriaan (LC-MS/MS) ja siitepöly tunnistetaan rapsin tyypiksi valomikroskopialla ja siitepölyn referenssikirjastolla (toteamis-ja kvantifiointirajat esitetään Lisätaulukossa 2). Jotta mehiläisten neonikotinoidialtistuksen vaihtelua eri kasvupaikoilla voitaisiin analysoida tarkemmin, keräsimme pesän suulta 12 mehiläistä yhtä kasvupaikkaa kohti. Tämä näytteenotto tehtiin vuonna 2013 kolmella klotianidilla käsitellyllä paikalla. Mettä saatiin kerättyjen mehiläisten hunajamahasta. Klotianidiinin pitoisuudet määritettiin tämän jälkeen sekä mesi-että mehiläiskudoksessa kunkin mehiläisyksilön osalta. Lisätietoja eri matriisien näytteen käsittelystä, LC-MS / MS-menetelmästä ja laadunvalvonnasta annetaan täydentävinä menetelminä.

mehiläisyhdyskunnan kehittymistä, uudelleenviljelyä ja hunajan tuotantoa

mehiläisyhdyskunnan kehittymistä arvioi sama koulutettu tarkkailija ja yksi avustaja. Munivan kuningattaren läsnäolo vakiintui, samoin kuningatarsolujen läsnäolo. Jos uudelleen jonottamiseen liittyi suuri aikuisten mehiläisten menetys, sen katsottiin parveilevan. Jos aikuisten mehiläisten katoamista ei havaittu, yhdyskunnan katsottiin jälleen queenanneen superseduren avulla. Yhdyskuntahunajan tuotanto ja kehitys määritettiin punnitsemalla pesäkkeet ja arvioimalla yhdyskunnan vahvuus Liebefeldin menetelmällä66 aikuisten mehiläisten kokonaismääränä ja kaikkien runkojen peitettyjen poikueiden pinta-Alana. Aikuisten mehiläisten määrää arvioitiin laskemalla mehiläisiä 10 rungon molemmin puolin. Suljettujen poikueiden lukumäärä (poikueiden määrä) määritettiin kertomalla suljettujen poikueiden peittävyyden osuus 2700: lla, joka on käytettyjen runkojen toisella puolella olevien solujen lukumäärä. Pesäkkeet punnittiin ennen altistusta ja altistumisen jälkeen (Mettler Toledo bench-asteikolla, jonka paino oli enintään 32 kg 1 g: n tarkkuudella) hunajantuotannon arvioimiseksi. Täydet hunajakehykset korvattiin tyhjillä kehyksillä rapsin kukinnan aikana, jotta yhdyskunta pystyi kasvamaan ja vähentämään parveilua. Sekä täydet että tyhjät kehykset punnittiin, jotta ne otettaisiin huomioon hunajantuotannon laskennassa. Altistumisen jälkeisessä arvioinnissa poistettiin mahdollisimman monta hunajakehystä (enintään 10 prosenttia peitetyn pesueen peittämästä pinta-alasta) mehiläishoitajien hunajasadon simuloimiseksi. Altistumista edeltävät arvioinnit tehtiin luonnonmukaisesti hoidetulla talvenkylvetyllä rapsipellolla 6-17 päivänä kesäkuuta 2013 ja 9-11 päivänä kesäkuuta 2014, ja altistumisen jälkeiset arvioinnit yhteisessä talvehtivassa mehiläistarhassa 29 päivänä heinäkuuta-9 päivänä elokuuta 2013 ja 28-31 päivänä heinäkuuta 2014 (täydentävä Kuva. 1). Lisäksi huhtikuussa 2014 tehtiin kevätyhdyskunnan vahvuusarviointi, jossa arvioitiin aikuisten mehiläisten kokonaismäärää ja peitettyjen poikueiden määrää (täydentävä Kuva. 1). Yhdyskunnan arvioija ja avustajat sokaistuivat tiedonkeruun aikana koskien kenttien hoito-ohjelmaa.

taudinaiheuttaja – ja loisnäytteiden keruu ja käsittely

näytteet noin 100 täysikasvuisesta mehiläisestä otettiin kustakin yhdyskunnasta klotianidiinikäsitellyillä ja kontrolloiduilla rapsipelloilla suoritetuissa altistusta edeltävissä ja sen jälkeisissä arvioinneissa sekä vuonna 2013 että 2014 (täydentävä Kuva. 1). Mehiläiset otettiin kunkin yhdyskunnan ulkokammasta, ja ne koostuivat siten kotimehiläisten ja forager bees67: n sekoituksesta. Kaikki mehiläisnäytteet säilytettiin -20 °C: ssa laboratoriotyöhön asti. V. tuhotartuntojen määrä kullekin yhdyskunnalle määritettiin pesemällä aikuisten mehiläisnäytteet saippuavedellä mites68: n irrottamiseksi ja laskemiseksi. 60 aikuisen mehiläisen vatsat pesäkettä kohti (yksittäisissä pesäke-analyyseissä) tai mehiläispesäkettä kohti (vuoden 2013 yhdistetyissä pesäke-analyyseissä 10 mehiläistä pesäkettä kohti) poistettiin ja pantiin polyeteenipussiin, jossa on sisäverkko (BioReba). Vatsalihakset jauhettiin pussissa survimella ja 30 ml nukleaasitonta (Milli-Q) vettä (0, 5 ml / mehiläinen) sekoitettiin huolellisesti näytteeseen homogeenisen suspension aikaansaamiseksi. Tästä suspensiosta poistettiin useita 1 ml: n alikiintiöitä ja pakastettiin välittömästi -80 °C: n lämpötilassa DNA: n ja RNA: n erottamista varten ja tulevana vertailumateriaalina.

loiset, patogeenit, symbioottiset mikrobit ja immuunigeenit

kerätyistä mehiläisnäytteistä arvioitiin erilaisia patogeenisiä ja ei-patogeenisiä loisia ja mikrobeja, jotta voitiin tutkia pesäkkeiden sijoittumista klotianidiinikäsitellyille pelloille niiden esiintyvyyteen ja runsauteen. Eliöihin lukeutui ubikvitaalinen ulkoloislasiitti Varroa destructor, 13 virusta: akuutin mehiläisen halvausviruksen (abpv), kirvan letaalin halvausviruksen (ALPV), Ison Siouxjoen viruksen (Bsrv), mustan kuningatarsolun viruksen (bqcv), kroonisen mehiläisen halvausviruksen (CBPV), epämuodostuneen siipiviruksen tyypin A (DWV-a), epämuodostuneen siipiviruksen tyypin B (DWV-B), Israelin akuutin halvausviruksen (iapv), Kashmirin mehiläisen viruksen (KBV), Siinainjärven viruskannan 1 (LSV-1) ja kannan 2 (LSV-2), Sacbrood-viruksen (SBV), hitaan mehiläisen paralysaatiovirus (SBPV); kaksi tavallista mehiläisen Mikroporidiaani-SUOLISTOBAKTEERIA (nosema APIs ja NOSEMA CERANAE) ja kaksi symbioottista suolistobakteeria (GAMMAPROTEOBACTERIUM: gilliamella Apicola ja betaproteobacterium): Snodgrassella alvi). Vuoden 2013 näytteistä analysoimme myös mehiläishoitotasolla kahdeksan mehiläisen geenin (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1a, Eater-like, NimC2, PGRP-S2 ja SPH51) mRNA-tasot, joiden ilmentyminen oli aiemmin yhdistetty torjunta-aineiden,patogeenien ja/tai loisten exposure19, 44 ja (sosiaalinen) immuniteetti mehiläisissä 45.

nukleiinihapon uutto

DNA uutettiin mehiläisten homogenaateista käyttäen protokollaa DNA: n erottamiseksi Nosema spores69: stä, joka on riittävän vahva myös DNA: n erottamiseksi bakteereista ja muista mikro-organismeista. Yhteensä 500 µl: n primääristä mehiläishomogenaattia sentrifugoitiin 5 minuutin ajan mikrofugissa nopeudella 13 000 rpm. Pelletti jäädytettiin toistuvasti-sulatettiin nestemäisellä typellä ja jauhettiin steriilillä Teflon-mikropestillä, kunnes se jauhettiin. Jauhettu sakka suspendoitiin uudelleen 400 µl: aan QIAGENin kasvikudoksia DNeasy AP1 lysis-puskuria, joka sisälsi 4 µl RNaasi-A: ta (10 mg ml−1), inkuboitiin ja ravistettiin 10 minuutin ajan 65 oC: ssa, minkä jälkeen 130 µl P3-neutralisaatiopuskuria (3,0 M kaliumasetaatti pH 5.5) lisättiin, jonka jälkeen 5 min inkubointi jäällä ja sentrifugointi 5 min nopeudella 14,000 rpm poistaa lysis roskat. QIAGEN-automatisoitu qiacube-uuttorobotti puhdisti DNA: n supernatantista 500 µl: n arvosta, kun kasvi oli dneasy-protokollan mukaisesti eluoinut DNA: n 100 µl: n nukleaasittomaksi vedeksi. Qiacube-robotti eritti RNA: n suoraan 100 µl: n primaarihomogenaatista käyttäen Qiagen Plant RNeasy-protokollaa (mukaan lukien Qia-silppuri lisähomogenisointia varten 70) ja RNA eluoitiin 50 µl: n nukleaasittomaksi vedeksi. Likimääräinen nukleiinihappopitoisuus määritettiin Nanodropilla, minkä jälkeen näytteet laimennettiin nukleaasittomalla vedellä tasaiseksi 10 ng µl-1: ksi (DNA ja LSV−1(RNA)) tai 20 ng µl-1: ksi (kaikkien muiden RNA−näytteiden osalta) ja varastoitiin -80 °C: ssa.

RT-qPCR ja qPCR

eri mikro-organismeja ja isäntämaan mRNA-kohteita havaittiin ja kvantifioitiin joko yksivaiheisen käänteiskopioinnin avulla.-kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) patogeeneille, joilla on RNA-genomi ja mRNA: n kohde-immuuni-ja sisäinen viitegeeni, tai kvantitatiivinen PCR (qPCR) organismeille, joilla on DNA-genomi. Määrityksiä koskevat yksityiskohtaiset tiedot esitetään täydentävässä taulukossa 10, täydentävässä taulukossa 11 ja täydentävässä taulukossa 12. Amel/LRR: n käänteinen pohjamaali suunniteltiin hieman uudelleen di Priscosta et al.19 koska erittäin suuri täydentävyys välillä alkuperäisen eteenpäin ja taaksepäin alukkeet johti korkea PCR artefacts dominoi kvantitatiivinen signaali. Reaktiot suoritettiin kahtena, 20 µl (DNA) tai 10 µl (RNA) reaktiotilavuutena, joka sisälsi 2 µl (DNA) tai 1,5 µl (RNA) – mallin, 0,4 µM (DNA) tai 0.2 µM (RNA) forward and reverse primeria ja joko Bio-Rad Eva Green qPCR mix (DNA) tai Bio-Rad One-Step iTaq RT-qPCR mix with SYBR Green detection chemistry (RNA). Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppaisissa optisissa qPCR-levyissä Bio-Rad CFX connect-termosyklerissä käyttäen seuraavia vahvistussykliprofiileja: 10 min 50 °C: ssa komplementaarisen DNA: n (cDNA) synteesiin (vain RT-qPCR): 5 min 95 °C: ssa (käänteiskopioijaentsyymin inaktivoimiseksi ja Taq-polymeraasin aktivoimiseksi), jota seuraa 40 sekunnin jakso 95 °C: n denaturoinnissa ja 30 sekunnin jakso 58 °C: n primer-hehkutuksessa, laajentamisessa ja tiedonkeruussa. DNA-määrityksissä käytettiin seuraavia amplifikaatiosykliprofiileja: 2 min 98 °C: ssa ensimmäiseen denaturaatioon, jonka jälkeen 40 jaksoa 5 s 98 °C: ssa denaturointiin ja 10 s 60 °C: ssa primer-hehkutukseen, laajennukseen ja tiedonkeruuseen. Vahvistussyklejä seurasi sulamiskäyräanalyysi vahvistuksen spesifisyyden määrittämiseksi lukemalla fluoresenssi 0, 5 °C: n lisäyksissä 65 °C: sta 95 °C: seen. Kullekin määritystyypille (täydentävä taulukko 10, täydentävä taulukko 11 ja täydentävä taulukko 12) laadittiin kalibrointikäyrä 10-kertaisella laimennussarjalla, jossa tunnettu pitoisuus oli positiivinen kontrolli, joka kattoi 6 suuruusluokkaa, kvantitatiivisten tietojen muuntamista varten, amplikonin viitesulatuskäyrän Profiilin määrittämiseksi ja reaktion suorituskykyä koskevien tilastojen arvioimiseksi.

tiedon muuntaminen ja normalisointi

yksittäisten reaktioiden sulamiskäyrät arvioitiin silmämääräisesti, jotta voitiin erottaa epäspesifiset vahvistimet, jotka sulamislämpötilaprofiililtaan eroavat todellisista kohdeamplikoneista cDNA/DNA-amplikoneista. Ei-spesifiset vahvistimet poistettiin aineistosta. Kaikki määritykset suoritettiin kahtena kappaleena, ja näiden kahden kaksoisarvon keskiarvoa käytettiin myöhemmissä laskelmissa. Molempien kaksoiskappaleiden oli annettava positiivinen kvantitatiivinen arvo ja läpäistävä sulamiskäyräanalyysi, jotta aineisto voitiin sisällyttää aineistoon. Kaikkien vahvistettujen vahvistimien raaka RT-qPCR-tiedot muunnettiin myöhemmin kunkin kohde-RNA: n arvioiduiksi kopioluvuiksi määrityksen vastaavan kalibrointikäyrän avulla. Nämä tiedot kerrottiin eri laimennuskertoimilla koko menettelyn ajan, jotta voitiin laskea kunkin tavoitteen arvioidut kopiot bee69: ää kohti. Koska RNA hajoaa helposti, on olemassa riski, että yksittäisten näytteiden väliset erot RNA: n laadussa (eli hajoamisessa) voivat vaikuttaa tuloksiin70. Tämän korjaamiseksi kaikille näytteille tehtiin RT-qPCR-määritykset yhteisen mehiläisen sisäisen referenssigeenin (rp49) mRNA: lle. Tämän jälkeen tiedot RNA: n keskeisistä tavoitteista normalisoitiin rp49 mRNA: n keskiarvoon, mikä korjasi RNA: n laadun näytekohtaisia eroja suhteessa RT-qPCR: n suorituskykyyn70.

tilastolliset analyysit

rapsityyppisistä kasveista peräisin olevan mehiläisen keräämän siitepölyn osuuksia verrattiin käsittelyjen välillä (klotianidiinisiemenien käsittely/käsittelemätön) käyttäen yleistettyä lineaarista mallia, jossa oletetaan binominaalinen jakautuminen ja korjataan yliannostus. Mehiläisten keräämän meden ja siitepölyn sekä mehiläisten kudoksen klotianidiinipitoisuuksia verrattiin käsittelyjen välillä Wilcoxon-Mann-Whitney-testeillä. Verrataksemme klotianidiinin pitoisuuksia mehiläisten kudoksessa ja meden pitoisuuksia yksittäisissä mehiläisissä peltojen välillä käytimme varianssianalyysiä (ANOVA), jossa kentän identiteetti on ennustaja. Lisäksi klotianidiinin pitoisuudet yksittäisten mehiläisten kudoksessa ja mesimahassa suhteutettiin käyttämällä moninkertaista lineaarista regressiota, jossa kentän identiteetti ja klotianidiinin pitoisuus medessä olivat selittäviä muuttujia ja klotianidiinin pitoisuus mehiläisen kudoksessa vastemuuttujana.

tutkimuksessa noudatettiin yleensä BACI-mallia (Before-After-Control-Impact, BACI), jossa kenttärakenne oli paritettu ja jota toistettiin kahtena peräkkäisenä vuonna pesäketasolla yhdyskunnan kehitystä sekä loisten, patogeenien ja suolistobakteerien esiintyvyyttä ja runsautta koskevien tietojen osalta. Vuodet 2013 ja 2014 analysoitiin yhdessä täydellisessä mallissa, jossa kiinteinä tekijöinä olivat siementen käsittely, kukinta, vuosi ja niiden yhteisvaikutukset. Klotianidiinikäsittelyn vaikutusta arvioitiin kukinnon ja siementen käsittelyn yhteisvaikutuksella, koska tämä termi kuvastaa käsittelyjen välistä muutosta suhteessa rapsin kukintoon. Jos kolmivaiheinen vuorovaikutus (kukinta × siementen käsittely × vuosi) oli merkittävä (eli jos muuttuja reagoi eri tavalla klotianidiinikäsittelyyn vuodesta toiseen), tietojoukko jaettiin vuoden mukaan ja vuosiluku pudotettiin kiinteänä tekijänä. Lisäksi aineistoa analysoitiin vain yhden vuoden ajalta, jos otoskoko oli ≤10 yhden vuoden aikana sekä mikrobiston esiintyvyyden että runsauden osalta (täydentävä Taulukko 1). Analyysin ulkopuolelle jätettiin yhdyskunnat, jotka parveilivat (8 kontrollikentillä ja 10 klotianidilla käsitellyillä kentillä vuonna 2013; yksi kontrollikentällä ja kaksi klotianidilla käsitellyillä kentillä vuonna 2014), koska parveilulla on suuri vaikutus yhdyskuntien kehitykseen. Ulkopuolelle jää myös yksittäinen yhdyskunta, joka menetti kuningattarensa kuljetuksen aikana ennen kenttäsijoitusta vuonna 2013 (käsitelty kenttä). Lukuun ottamatta pesäkkeitä, jotka parveilivat analyysistä, muutti laadullisesti joitakin tuloksia (KS.täydentävä taulukko 13). Merkitsevyystason muutokset voivat johtua vähentyneestä tilastollisesta tehosta, satunnaisesta sattumasta tai biologisista vaikutuksista.

lineaarisia sekavaikutusmalleja (LMM) käytettiin testattaessa klotianidiinikäsittelyn vaikutusta yhdyskunnan kehitykseen mitattuna rajattujen poikuesolujen lukumääränä (poikueiden määrä) ja aikuisten mehiläisten lukumääränä. Siementen käsittely (klotianidiini tai kontrolli), kukinta (ennen rapsin kukintaa tai sen jälkeen), vuosi (2013 tai 2014) ja niiden yhteisvaikutukset olivat kiinteitä tekijöitä. Satunnaistekijöinä otettiin mukaan maatilapari-identiteetti, maatila-identiteetti ja yhdyskunta-identiteetti. Hunajantuotantoa verrattiin LMM: ää käyttävien hoitojen välillä, ja satunnaistekijöinä olivat tilapari-identiteetti ja maatilan identiteetti. Yleistettyjä lineaarisia sekamalleja (glmms) käytettiin testattaessa klotianidiinihoidon vaikutusta yhdyskuntien uudelleen queenaukseen ja kuolleisuuteen, kun maatilan identiteetti oli satunnaistekijä.

klotianidiinikäsittelyn vaikutusta kevätyhdyskunnan kehitykseen mitattuna aikuisten mehiläisten lukumääränä ja poikasten määränä testattiin LMM: llä ja glmm: llä siten, että siementen käsittely oli kiinteä tekijä ja viljelyparin ja maatilan identiteetti satunnaistekijä. Rajattujen poikasten määrälle käytimme negatiivista binomivirhejakaumaa ja logaritmista linkkifunktiota.

mikrobiomia ja Varroa-punkkia koskevat tiedot analysoitiin sekä niiden binomisen (läsnäolo/poissaolo) että kvantitatiivisen (runsaus) luonteen perusteella käyttämällä Glmm: ää (binomivirhejakaumat ja logit-linkkifunktio) ja lmms: ää (normaalit virhejakaumat) siten, että siementen käsittely, kukinta, vuosi ja niiden yhteisvaikutukset olivat kiinteitä tekijöitä. Mikro-organismin tai Varroa-punkin esiintyvyyden GLMMs sisälsi vain yhdyskunnan identiteetin satunnaistekijänä, koska tehokas otoskoko (eli esiintyminen/puuttuminen-tietojen harvinaisempi tulos) ei mahdollistanut satunnaisempien tekijöiden sisällyttämistä. Sekä esiintyvyyttä että runsautta koskevat tiedot analysoitiin ainoastaan organismeista ja vuosista, joiden (efektiivinen) otoskoko oli >10. Lisäksi pesäkkeet, jotka eivät olleet vähintään kerran positiivisia tietyn mikro-organismin osalta, jätettiin runsausanalyysin ulkopuolelle. Mehiläispatogeeni ja bakteerien runsaus muuntuivat logaritmisesti (log10), koska ne jakautuvat yleensä eksponentiaalisesti. Kohdeorganismien runsaus sisälsi satunnaistekijöinä tilaparin, maatilan ja yhdyskunnan identiteetin. Varroa-punkkien määrä 100: aa mehiläistä kohti ja yhdyskunnan paino muunnettiin neliöjuureksi, jotta vältettäisiin tavanomaisesti jakautuneet jäämät. Luottamusvälit laskettiin profiilitodennäköisyyden perusteella. Neliöjuuren muunnettua dataa varten arviot muutettiin takaisin alkuperäiseen mittakaavaan graafista kuvitusta varten.

immuunigeenin transkriptit olivat saatavilla vain vuodelta 2013 ja mehiläishoitotasolla, mutta noudattivat myös BACI-mallia. Geeniekspression LMMs sisälsi siementen käsittelyn ja kukinnan kiinteinä tekijöinä ja maatilan identiteetin satunnaistekijöinä.

tilastotiedot analysoitiin käyttäen R: ää lukuun ottamatta klotianidiinialtistuksen ja maankäytön todentamista koskevia analyysejä, joista SAS 9.4 for Windows (SAS Institute Inc.) käytettiin. LMMs sovitettiin lme4-paketin lmer-funktiolla ja GLMMs sovitettiin glmmtmb-paketin glmmTMB-funktiolla Rp-arvoilla.glmms: n arvot laskettiin todennäköisyyssuhdetesteillä. LMMs: n P-arvot laskettiin autopaketin Anova-funktiolla, jossa käytettiin tyypin III F-testejä vuorovaikutuksia sisältäville malleille ja tyypin II F-testejä malleille, joilla ei ollut vuorovaikutusta (esim.kevätarviointi ja hunajan tuotanto). Kiinteiden tekijöiden vaikutuksia arvioitiin käyttämällä summasta nollaan-kontrasteja kaikissa malleissa lukuun ottamatta neonikotinoidijäämiä. Summasta nollaan-kontrasteilla voidaan määrittää tärkeimmät vaikutukset / vuorovaikutukset (toisin sanoen estimointi muista riippumattomista muuttujista riippumatta) ja osoittaa tekijöiden vaikutukset poikkeamina suuresta keskiarvosta (intercepti). Tekijöillä, joilla on kaksi tasoa, kunkin tason poikkeaman suurkeskiarvo on sama, mutta suunta vaihtelee. Edustamme tekijöiden vaikutuksia (siementen käsittely, kukinta, vuosi), koska toisen tason (clotianidin, jälkeen, 2014) poikkeama suuresta keskiarvosta. Tämä koski myös interaktioita, joten esimerkiksi siementen käsittely × kukinta-vuorovaikutus osoittaa, missä määrin klotianidiinille altistuneet pesäkkeet erosivat rapsin kukinnon muutoksessa molempien käsittelyjen keskimääräisestä muutoksesta.

Tehoanalyysi

teimme tehoanalyysit täysikasvuisten mehiläisten ja kuorittujen poikuesolujen ja hunajantuotannon määrästä selvittääksemme, minkä kokoisen vaikutuksen voisimme mahdollisesti havaita, kun otetaan huomioon suunnittelumme, replikointimme ja mallivalintamme. Teho määritettiin efektikokojen vaihteluvälille nimellisellä luottamustasolla α = 0,05 1000 Monte Carlo-simulaatiolla efektikokoa kohti käyttäen simr-paketin powerSim-toimintoa. Teho laskettiin useille eri tehokooille, jotka ilmaistiin aikuisten mehiläisten lukumäärän, kuorittujen poikuesolujen määrän tai hunajantuotannon muutoksena. Jakamalla vaikutuskoon mehiläisten keskimääräisellä lukumäärällä, kaikkien verrokkiyhdyskuntien poikastuotantojen keskimääräisellä lukumäärällä tai hunajantuotannolla saatiin aikaan vaikutuskoko, joka ilmaistiin näiden matriisien prosenttimuutoksena (täydentävä Kuva. 3). Tämä tehoanalyysi teki mahdolliseksi verrata meidän vaikutus koko esitetään Rundlöf et al.34. Käyttämällä täydellistä mallia voisimme havaita alle 5%: n aikuisten mehiläisten määrän vaikutuksen 80%: n teholla verrattuna rundlöf et al: n esittämään alle 20%: n vaikutuskokoon.34. Tämä on jopa pienempi kuin EFSA32: n asettamat vaatimukset, joiden mukaan efsa32: n vaikutus on <7%. Siemenkäsittelyn, kukinnon ja vuoden merkittävän vuorovaikutuksen tuloksena kuorittujen siemensolujen määrää koskevat tiedot analysoitiin erikseen kunkin vuoden osalta. Siksi esitämme tässä kunkin vuoden tehoanalyysin. Vaikutus, jolla 80% saavutettiin, kasvoi alle 10%: sta vuonna 2013 hieman alle 11%: iin vuonna 2014 (täydentävä kuvio. 3), todennäköisesti johtuen vähentyneestä replikaatiosta vuonna 2014. Teimme myös hunajantuotannon tehoanalyysin (hunajamäärä pesäkettä kohti kiloina) käyttäen molempien vuosien aineistoa, mikä osoitti, että alle 20%: n vaikutus voitiin havaita 80%: n teholla (täydentävä Kuva. 3).

raportointikokonaisuus

lisätietoja koesuunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.