kollageenisynteesi
luun kollageenisynteesin säätely
kollageenisynteesi jyrsijöiden calvariae-ja soluviljelmissä on arvioitu useilla eri määrityksillä . Yleisimmin käytetyssä määrityksessä vasaroita ja soluja inkuboidaan radioleimatulla proliinilla useita tunteja ennen viljelyn päättymistä. Radioaktiivisesti merkityn proliinin sisällyttäminen kollagenaasi-sulavaan proteiiniin (CDP-merkintä) ja noncollagen-proteiiniin (NCP-merkintä) mitataan viljelmien uutteissa käyttäen erittäin puhdistettua bakteerikollagenaasia . Prosentuaalinen kollageenisynteesi lasketaan CDP-ja NCP-arvoista sen jälkeen, kun on korjattu proliinin suurempi määrä kollageenissa suhteessa ei-kollageeniproteiineihin . Kollageenin tuotantoa voidaan määrittää myös mittaamalla solu-tai elinviljelmien hydroksiproliinipitoisuutta, sillä hydroksiproliini on käytännössä vain kollageeneille ominainen. Näissä menetelmissä ei erotella erilaisia fibrillaarisia kollageenityyppejä. Luuelinviljelmien ja useimpien osteoblastisten soluviljelmien syntetisoima kollageeni on kuitenkin suurelta osin tyypin I (>95%), joten CDP-merkintäarvo heijastaa yleensä tyypin I kollageenisynteesiä. Haluttaessa eri kollageenityyppien tuotanto voidaan erottaa ioninvaihtokromatografialla ja polyakryyliamidigeelielektroforeesilla soluviljelmien tai elinviljelmien radioaktiivisesti merkityistä uutteista . Tyypin I kollageenin ilmentymistä ihmisen soluviljelmissä on arvioitu myös mittaamalla prokollagen I C-terminaalisen propeptidin eritystä . Lisäksi on käytetty erityisiä cDNA-koettimia pohjoisissa blottauksissa ja alleelispesifisiä alukkeita käänteiskopioijaentsyymi-polymeraasiketjureaktiomäärityksissä kollageenin mRNA-ilmentymisen arvioimiseksi luustomalleissa. Mittaamalla 1,25(OH)2D3: n vaikutusta kollageenisynteesiin ja mRNA-pitoisuuksiin on saatu vertailukelpoisia tuloksia käyttämällä näitä eri määrityksiä.
1,25(OH)2D3 estää kollageenisynteesiä rotan 21 päivää kestävän calvariae-sikiön ja vastasyntyneen hiiren calvariae-sikiöviljelmissä vaikuttaen vain vähän tai ei lainkaan nonkollagen-proteiinisynteesiin. Kollageenisynteesin suurin esto 1,25 (OH) 2D3 rotan calvariassa (noin 50%) tapahtuu 10 nM: ssä . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 estää myös kollageenisynteesiä, mutta on vähemmän voimakas kuin 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 ja 24R,25 (OH)2D3 eivät muuta kollageenisynteesiä alle 100 nM . D-vitamiinimetaboliitit estävät kollageenisynteesiä ja stimuloivat rotan pitkien luiden resorptiota, joilla on samanlaiset suhteelliset potenssit, jotka korreloivat metaboliittien affiniteetin kanssa luuston VDR: ään . Kollageenisynteesin 1,25(OH)2D3-eston soluselektiivisyyden määrittämiseksi rotan calvariae-sikiöiden elinviljelmiä käsiteltiin 1,25(OH)2D3: lla 22 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä inkuboitiin tritioidulla proliinilla viimeisen 2 tunnin viljelyn ajan. Keskusluu (kypsät osteoblastit) leikattiin luukalvosta vapaaksi (vähemmän kypsät osteoprogenitorit ja fibroblastit) ja molemmat lokerot analysoitiin erikseen tritioidun proliinin liittämiseksi. 1,25(OH)2D3 vähentää kollageenisynteesiä keskusluussa mutta ei periosteumissa, mikä osoittaa 1,25 (OH)2D3-vaikutuksen selektiivisyyttä kypsillä osteoblasteilla . Käyttäen in vivo-protokollaa, jossa vastasyntyneille rotille annettiin useita injektioita tritioitua proliinia radioaktiivisesti merkittyyn uuteen syntetisoituun luumatriisiin, 25 ng 1,25(OH)2D3: sta päivinä 1, 3 ja 5 estetyn luumatriisin synteesin perusteella arvioituna sääriluiden ja calvariaen autoradiografioiden histomorfometrialla .
1, 25 (OH)2D3 estää kollageenin tuotantoa myös rotan osteoblastisissa osteosarkooma ROS 17 / 2 , 8-soluissa , rotan ja hiiren primaarisissa osteoblastisoluissa sekä hiiren ikuistetussa osteoblastisolulinjassa (MMB-1). 1,25 (OH)2D3: lla on suurempi tyypin I kollageenisynteesiä estävä vaikutus primaaristen hiiren osteoblastisolujen log-faasikasvun aikana kuin yhtymäkohdassa, ehkä siksi, että jakautuvissa soluissa oli enemmän VDR: iä . Samoin 1,25 (OH)2D3 kollageenisynteesin esto on suurempi harvoissa MMB-1-soluviljelmissä, joissa VDR-tasot ovat korkeammat kuin yhdistetyissä MMB-1-soluissa . 1,25 (OH)2D3 kollageenisynteesin esto on vastaava harvoissa ja konfluenteissa rotan primaarisissa osteoblastisoluissa , mutta VDR-määrä ei muuttunut solujen kasvun aikana . Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että kollageenisynteesin eston laajuus 1,25(OH)2D3: lla määräytyy pitkälti VDRs: n solumäärän perusteella. 1,25 (OH)2D3 estää kollageenin mRNA-tasoja rotan primaaristen osteoblastisolujen pitkäaikaisten viljelmien proliferatiivisessa vaiheessa ja estää mineralisoituneiden luun kyhmyjen muodostumisen näiden viljelmien avulla . Nämä tutkimukset osoittavat, että 1,25 (OH)2D3 estää mineralisoituneita kyhmyjä muodostavien osteoprogeniittien erilaistumista rotan primaarisissa osteoblastisoluviljelmissä . Kyhmyjen muodostumisen estyminen 1,25 (OH)2D3: lla voi kuitenkin olla toissijaista tyypin I kollageenisynteesin estymiseen viljelmissä.
edellä kuvatuista inhibitorisista vaikutuksista poiketen 1,25(OH)2D3 stimuloi ohimenevästi kollageeni-ja nonkollageeniproteiinisynteesiä (noin kaksi tuntia), joiden huiput ovat 12-24 tuntia, hiiren ikuistetussa osteoblastisolulinjassa MC3T3-E1 . Tässä tutkimuksessa viljelmien syntetisoimaa kollageeniprosenttia (kollageeni suhteessa kokonaisproteiinisynteesiin) ei raportoitu; tämän vuoksi ei ollut mahdollista määrittää kollageenisynteesin 1,25(OH)2D3-vaikutuksen selektiivisyyttä. 1,25 (OH)2D3 lisää myös kollageenin ilmentymistä ihmisen osteoblastisessa osteosarkooman solulinjassa MG-63 ja ihmisen osteoblastisten solujen primaariviljelmissä . Mielenkiintoista on, että kollageenisynteesin lisääntyminen 1,25(OH)2D3: lla MG63-soluissa estää insuliinin kaltaisen kasvutekijän sitoutumisproteiini 5: n, joka vuorovaikuttaa suoraan VDR: ään ja estää heterodimerisaation retinoidi X-reseptorin RXR: n kanssa . Muissa tutkimuksissa 1,25 (OH)2D3: n on kuitenkin osoitettu vähentävän kollageenisynteesiä mc3t3-E1-soluissa . MC3T3-E1 ja MG-63 edustavat preosteoblastisoluja, jotka In vitro erilaistuvat osteogeenisesti askorbiinihapon kanssa; 1, 25(OH)2D3 estää solujen kasvua ja lisää osteokalsiinin ekspressiota ja alkalisen fosfataasin aktiivisuutta molemmissa solulinjoissa. MC3T3E1-soluissa, kuten useimmissa ikuistetuissa osteoblastisissa solulinjoissa, on merkittävää fenotyyppistä vaihtelua . Siksi jotkut näistä poikkeavista tuloksista voivat johtua kokeissa käytettyjen solujen vaihteluista. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että 1,25 (OH)2D3 voi toimia differentiaatiohormonina osteoblastilinjan varhaisissa soluissa, mikä johtaa lisääntyneeseen tyypin I kollageenin ilmentymiseen. Sen sijaan 1,25 (OH)2D3 estää tyypin I kollageenin ilmentymistä kypsissä osteoblasteissa.
