Kymotrypsinogeeni a

C. A. S.: 9035-75-0

entsymaattinen reaktio (kuva avautuu uuteen ikkunaan)

kymotrypsiini on haiman akinaaristen solujen tuottama seriininen endopeptidaasi. Kymotrypsiini aktivoituu kymotrypsinogeenin proteolyysin jälkeen trypsiinin vaikutuksesta. Trypsiinin hydrolysoituessa lysiinillä ja arginiinilla kymotrypsiini pilkkoo selektiivisesti aromaattisten jäämien muodostamia peptidisidoksia (tyrosiini, fenyylialaniini ja tryptofaani) (Hedstrom et al. 1992). Kahta vallitsevaa kymotrypsiinin muotoa, A: ta ja B: tä, esiintyy yhtä paljon naudan haimassa. Ne ovat hyvin samankaltaisia proteiineja (80% identtisiä), mutta niillä on merkittävästi erilaiset proteolyyttiset ominaisuudet (Hartley 1964, Meloun ym. 1966, Smillie et al. 1968, ja Gráf et al. 2004). Alla olevat tiedot koskevat ensisijaisesti kymotrypsinogeenin ja kymotrypsiinin a-muotoa.

historia:

1900-luvun alussa Vernon ehdotti, että haimavalmisteet voisivat aiheuttaa sen omien entsyymien sisäisen aktivaattorin (Vernon 1901). Vernonin maidon hyytymiskokeissa todettiin, että entsyymeitä oli ainakin kaksi ja että toinen oli vakaampi kuin toinen (Vernon 1902). Ajatus hyväksyttiin kuitenkin laajalti vasta vuonna 1934, kun Kunitz ja Northrop vahvistivat trypsiinin lisäksi entsyymin olemassaolon ja antoivat sille nimen kymotrypsiini. He pystyivät kiteyttämään kymotrypsiinin sekä inaktiivisen esiasteen, kymotrypsinogeenin (Kunitz ja Northrop 1934). Vuonna 1938 Kunitz eristi kymotrypsiinin eri aktiiviset muodot ja nimesi ne alfaksi, beetaksi ja gammaksi (Kunitz 1938).

1940-luvun alussa Fruton ja Bergmann tutkivat edelleen kymotrypsiinin spesifisyyttä raportoiden useista uusista substraateista (Fruton ja Bergmann 1942). Jacobsen tunnisti pian kymotrypsiinin lisämuotoja ja nimesi ne deltaksi ja piiksi (Jacobsen 1947). Vuonna 1948 Schwert luonnehti edelleen kymotrypsiinin ja kymotrypsinogeenin molekyylipainoja.

vuonna 1954 Hartley ja Kilby raportoivat ensimmäisen todisteen kymotrypsiinin hydrolysoivien amidi-ja esterisubstraattien kolmivaiheisesta mekanismista. Vuonna 1955 Laskowski sai toisen kiteisen kymotrypsinogeenin ja antoi sille nimen kymotrypsinogeeni B. vuonna 1964 Hartley määritti kymotrypsiini A: n aminohappojärjestyksen, jota myöhemmin jalostivat Meloun et al. vuonna 1966. Vuonna 1968 Smillie et al. määritti kymotrypsiini B: n aminohappojärjestyksen, joka paljasti 80% sekvenssin identiteetin kymotrypsiini A: n kanssa.1970-ja 1980-luvuilla tehtiin tutkimusta, jotta voitiin paremmin ymmärtää vaikutusmekanismia ja tunnistaa trypsiinin ja kymotrypsiinin aminohapposekvenssien erot (Steitz et al. 1969, Cohen et al.1981, Asbóth ja Polgár 1983, ja Gráf et al. 1988).

kymotrypsiiniä puhdistettiin 1990-luvulla muista lähteistä, kuten Atlantin turskasta (Ásgeirsson ja Bjarnason 1991) ja kamelista (Al-Ajlan ja Bailey 1997). Myös inhibiittorien (Baek et al. 1990), ja Frigerio et al. selvitetty naudan kymotrypsiinin kiderakenne 2,0 Å: n tarkkuudella (Frigerio et al. 1992).

viimeaikaisissa tutkimuksissa on tutkittu kymotrypsiinin taittumista ja denaturoitumista eri pitoisuuksilla (Ghaouar et al. 2010), kymotrypsiinin vuorovaikutus nanohiukkassubstraattien kanssa (You et al. 2006, ja Jordania ym. 2009), ja kymotrypsiinin stabiilisuuden lisääminen konjugoimalla PEG-molekyyleihin (Castellanos et al. 2005, ja Rodríguez-Martínez et al. 2009).

spesifisyys:

kymotrypsiini aktivoituu trypsiinin hajottaessa arginiinin ja isoleusiinin välisen sidoksen (R15 ja I16) aiheuttaen rakenteellisia muutoksia ja substraatin sitoutumiskohdan muodostumisen (Sears 2010). Kymotrypsiini eroaa trypsiinistä siinä, että trypsiini pilkkoo peptidejä arginiini-ja lysiinijäämissä, kun taas kymotrypsiini suosii suuria hydrofobisia jäämiä (Hedstrom ym. 1992). Kymotrypsiini katalysoi ensisijaisesti peptidisidosten hydrolyysiä, johon kuuluu tyrosiinin, fenyylialaniinin ja tryptofaanin L-isomeerejä. Se vaikuttaa helposti myös herkkien aminohappojen amideihin ja estereihin. Kymotrypsiinin spesifisyys suurille hydrofobisille jäämille voidaan selittää hydrofobisella S1-sitovalla pocktingilla, joka muodostuu jäämistä 189-195, 214-220 ja 225-228 (Cohen et al. 1981).

vaikka trypsiinin ja kymotrypsiinin S1-alueen rakenteessa on vain yksi ero (kohdassa 189), trypsiinin ja kymotrypsiinin mutageneesi ei ole pystynyt vaihtamaan ominaispiirteitä, mikä viittaa siihen, että mekanismia, jolla trypsiini ja kymotrypsiini saavuttavat substraattispesifisen katalyysin, ei täysin tunneta (Steitz et al. 1969, ja Gráf et al. 1988).

koostumus:

katalyyttisen Triadin kolme aminohappojäännöstä (H57, D102 ja S195) ovat välttämättömiä peptidisidoksen pilkkoutumiselle ja stabiloituvat vetysidoksilla (Sears 2010, and Gráf et al. 2004). G193 ja s195 muodostavat oksianionin reiän ja vuorovaikuttavat saksipeptidisidoksen karbonyyliryhmän kanssa orientoiden sen muodostaen tetraedrisen välivaiheen (Rühlmann et al. 1973, Huber ja Bode 1978, ja Gráf et al. 2004).

Molecular Characteristics:

kymotrypsiini A ja B jakavat 80% sekvenssidentiteetin (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, ja Gráf et al. 2004). Katalyyttisen Triadin aminohapot (H57, D102 ja S195) säilyvät hyvin S1-perheen peptidaasien jaksoissa (Gráf et al. 2004). Asemassa 214 oleva seriini on myös erittäin säilynyt suvussa, ja sitä on ehdotettu katalyyttisen kolmikon neljänneksi jäseneksi (Ohara ym. 1989, ja McGrath et al. 1992).

Proteiiniliittymänumero: P00766

KATH-luokitus (v. 3.3.0):

• Luokka: pääasiassa beeta
• Arkkitehtuuri: Beetatynnyri
• topologia: trypsiinin kaltainen Seriiniproteaasi

molekyylipaino:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

optimaalinen pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

isoelektrinen Piste:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• 8.33 (Chymotrypsin, Theoretical)

Extinction Coefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (Theoretical)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Active Site Residues:

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Serine (S195)

Activators:

• Cetyltributylammonium bromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammonium bromide (Spreti et al. 2001)

Inhibitors:

• Hydroxymethylpyrroles (Abell and Nabbs 2001)
• Boronic acids (Smoum et al. 2003)
• Courmarin derivatives (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides from natural sources (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, and Chopin et al. 2000)
• Peptides containing an unnatural amino acid (Legowska et al. 2009, and Wysocka et al. 2008)

Sovellukset:

• Sekvenssianalyysi
• Peptidisynteesi
• Peptidikartoitus
• Peptidiferprinting