miten Grna suunnitellaan CRISPR-genomin muokkausta varten?
gRNA ohjaa cripr Cas9-järjestelmän oikeaan genomipaikkaan kaksoisjuosteen katkeamista varten.CRISPR Cas9-järjestelmän kohdespesifisyys määritetään gRNA: N 5′ päässä olevien 20 nukleotidin avulla. Grna-emäsparit kohdesarjan komplementaariseen juosteeseen ja Cas9-nukleaasi suorittaa kaksoisjuosteen katkeamisen.
gRNA: ta suunniteltaessa on otettava huomioon seuraavat asiat.
1) GC-pitoisuus: Tyypillinen vaihteluväli on 40-80 prosenttia . Suurempi GC-pitoisuus stabiloi RNA-DNA-dupleksin ja samalla epävakauttaa kohteen ulkopuolisia hybridisaatioita
2) Pituus: pituutta voidaan säätää ja se vaihtelee 17-24 emäsparin välillä. Lyhyempi jakso johtaa minimoitu pois tavoite vaikutuksia. ( 17 bp on alin raja pituus ohjaavan sekvenssin, kaikki pituus ohjaavan sekvenssin tahansa pituus lyhyempi kuin 17 on tilastollinen mahdollisuus kohdistaa useita genomisia lokus.)
3) potentiaaliset off-target effects: epäsuhta toleranssi ja kohdealue on se, mikä johtaa off-target-vaikutuksiin. Tätä voidaan vähentää perimän laajuisilla kohdevaikutushauilla.
on olemassa monia sivustoja, jotka auttavat suunnittelussa gRNAs. Jotkut niistä ovat Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgrna designer, ja Biotools.
selitän Chop Chopin verkkosivujen käyttöä täällä,
1)https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Valitse laji
3) Valitse lajikohtainen geeni id tai leikkaa ja liitä kiinnostava nukleotidi ja aloita analyysi.
kun analyysi on tehty, näytetään Grna-alueen Graafinen esitys. Jokainen mahdollinen gRNA näyttää myös mahdolliset off tavoite vaikutukset. Valitse vähemmän off kohde vaikutuksia.
