pentoosifosfaatista valittujen geenien konstitutiivinen ilmentyminen ja aromaattiset reitit lisäävät shikimihapon saantoa sellaisen Escherichia coli-kannan, jolta puuttuu PTS, korkean glukoosin eräviljelmissä ja pykf

pb12 aroK-arolia sisältävien kantojen rakenne plasmidi, joka on suunniteltu käytetyn synteettisen operonin konstitutiiviseen ilmaisuun shikimihapon tuotannossa

laboratoriomme julkaisemattomat todisteet osoittavat, että aromaattisten yhdisteiden tuotanto laboratoriossa kehittyneessä kannassa PB12 voi saavuttaa korkeampia tasoja, kun hiilivuon canalisoimiseen osallistuvien geenien transkriptioinduktio tapahtuu fermentaatioiden alussa. Tämä havainto huomioon ottaen kehitettiin uusi strategia SA: n tuotannon optimoimiseksi pb12: ssa, jossa on inaktiivisia aroK-ja aroL-geenejä (Kuva 1). Tähän strategiaan kuului plasmidin suunnittelu ja rakentaminen kuuden keskeisen geenin voimakkaaseen ja vakaaseen ilmentymiseen, jotka oli järjestetty synteettisen operonin muotoon ja joita valvoi yksinomaan yksi Trc-promoottori. Metabolisen taakan vähentämiseksi vektorina käytettiin yhtä pbr327: stä johdettua plasmidia, jossa on par-lokus, joka lisää plasmidin stabiilisuutta, sen jälkeen kun siihen oli sisällytetty fragmentti, joka sisältää ptrc99a: n promoottorin, polylinkkerin ja transkriptioterminaattorit (kuva 2).

operonin alkuosa rakennettiin 4 ensimmäisen koodaussekvenssin (aroB, tktA, aroGfbr ja aroE) sekventiaalisella vahvistuksella ja ligaatiolla plasmidin pbrint-Ts Cm polylinkkeriin, jota käytettiin kloonaustelineenä (KS. Myöhemmin 4-geenin rakenne siirrettiin hybridiplasmidiin pTrc327par yhdessä 2 muun geenin (aroD ja zwf) kanssa, mikä johti 8Kb operoniin, joka sisältyi 12kb plasmidiin (kuva 2). Tuloksena saatu plasmidi, jota kutsutaan pTrcAro6: ksi, muuntui pb12-Arok – aroL-kannaksi, jossa ei ollut lacIq-geeniä, mikä mahdollisti kiinnostavien geenien konstitutiivisen ilmentymisen (Taulukko 1). Yksinkertaisuuden vuoksi syntynyttä PB12 aroK-aroL – lacI-kantaa kutsuttiin nimellä AR2. Kun PYKF-geeni inaktivoitiin AR2: ssa, tuloksena oleva kanta nimettiin AR3: ksi. Ptrcaro6-plasmidia kantavista AR2-ja AR3-bakteereista johdetut kannat nimettiin ar26: ksi ja ar36: ksi (Taulukko 1).

Ptrcaro6: n synteettisen operonin muodostavien koodaussekvenssien, joita TRC-promoottori ja transkriptioterminaattorit tukevat, tilajärjestely esitetään kuvassa 2. aroB on operonin ensimmäinen geeni, sillä useiden todisteiden mukaan sen matala ilmentymä on yksi aromaattisten yhdisteiden tuotannon rajoittavista vaiheista . Plasmidi pTrcAro6 kantaa myös tkta-ja aroGfbr-geenejä, joiden tuotteet osallistuvat e4p-synteesiin ja sen kondensoituminen PEP: n kanssa muodostaen dahp: n, ensimmäisen aromaattisen yhdisteen (Kuva 1). myös AROD-ja aroE-geenit otettiin mukaan edistämään DHQ: n tehokasta muuntamista SA: ksi. Lisäksi tässä plasmidissa on zwf-geeni, joka koodaa PPP: n ensimmäistä entsyymiä (Kuva 1). Päätös sisällyttää tämä geeni perustui seuraaviin havaintoihin: 1) ZWF: n yliekspressio paransi merkittävästi kasvunopeuden menetystä, joka johtui plasmidin metabolisesta kuormituksesta kannassa JM101, joka kasvoi glukoosissa ainoana hiililähteenä ; 2) on raportoitu, että kannassa PB12 on erityisen alhainen hiilivuo-osio glukoosi-6-fosfaattisolmussa (G6P) kohti PPP: tä (5% kulutetusta G6P: stä verrattuna 22%: iin vanhempaisainekannassa JM101). Siksi tämän geenin yliekspression pitäisi lisätä NADPH: n saatavuutta, jota shikimaattidehydrogenaasientsyymi (AroE) tarvitsee katalyyttisinä määrinä, ja se voi lievittää mahdollisia kasvuvaikutuksia ohjaamalla enemmän G6P: tä nukleotidi-ja aminohappobiosynteesiin pb12: sta johdetuissa kannoissa . Tässä raportissa esitetyt kokeet eivät kuitenkaan pyrkineet analysoimaan minkään käytetyn geenin erityistä vaikutusta, vaan niiden kaikkien ilmaisemisen seurauksia operonina.

jokaisen geenin tehokkaan translaation edistämiseksi jokainen koodaussekvenssi monistettiin nimetyillä alukkeilla, joilla otettiin käyttöön konsensus Shine-Dalgarno-sekvenssi, joka sijaitsi 8 bp käännöksen aloituspaikan yläjuoksulla. Konstruoidun operonin nukleotidisekvenssi esitetään lisätiedostossa 1.

Pykf-inaktivaation aiheuttamien vaikutusten arviointi aro6-operonia ilmaisevissa kannoissa

pykF-inaktivaation aiheuttamien vaikutusten arvioimiseksi SA: n tuotantoon verrattiin tuotantokantojen AR26 (pykF+) ja AR36 (PYKF -) suorituskykyä käyttämällä ravistuspulloja, joissa oli 15 g/L Glc: tä ja 5 g/L YE: tä. Kontrollina olivat myös samat kannat, jotka sisälsivät tyhjän ptrc327par-plasmidin (ilman Aro6-operonia), AR2e ja AR3e.

vaikka SA: ta kertyi kaikissa tapauksissa, kuten arokin ja arolin mutanteille odotettiin, ptrcaro6: ta sisältävät kannat saavuttivat suuremmat SA-pitoisuudet kuin ne, joissa oli tyhjä plasmidi (kuva 3b). Lisäksi SA-titteri oli ar36: ssa lähes kaksi kertaa suurempi kuin AR26: ssa (6,1 g/L vs. 3,3 g/L). Glc: n kulutuksen havaittiin vähenevän ar26-kannassa noin 18 tunnin viljelyn jälkeen, mikä korreloi korkeaan asetaattipitoisuuteen ja SA: n tuotannon pysähtymiseen. Ar36-kannan GLC-kulutus sen sijaan oli jatkuvaa ja asetaattia tuotettiin vain vähäisiä määriä (Kuva 3c, 3d). Tulokset osoittavat, että keinotekoisessa operonissa esiintyvät geenit ovat toiminnallisia ja edistävät SA: n tuottamista kulttuurin alusta lähtien. Niiden konstitutiivinen ilmentyminen vähensi spesifistä kasvunopeutta (μ) 25% pykf+ – taustassa ja lisäsi sitä hieman pykF-muunnoksessa, mutta ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia tuotettuun maksimibiomassaan (Xmax) verrattuna kantoihin, joilla oli tyhjä plasmidi (Kuva 3a). Huomattavaa on, että operonia ilmentävissä kannoissa näissä kasvuolosuhteissa pykF-geenin inaktivointi lisäsi SA: n tuotantoa, poisti asetaatin kertymisen ja mahdollisti tasaisen Glc: n kulutuksen.

kantojen AR26, AR36 ja niiden tyhjien plasmidijohdannaisten Ar2e ( pykF+) ja AR3e ( Pykf -) käyttäytyminen käyttäen ravistuspulloja, jotka sisältävät 15 g/L Glc: tä ja 5 g/L YE: tä (a, b, c,d), ja 1 L fermentoreita,jotka sisältävät 100 g/L Glc: tä ja 15 g/L YE (e): tä. a) kasvu; B) SA tuotanto; c) Glc-kulutus; d) asetaatin tuotanto; e) Ar26: n ja AR36: n GLC-kulutus ja SA-tuotanto fermentoreissa. Virhepalkit edustavat keskihajontaa.

sen määrittämiseksi, johtuuko ar26: n suurempi asetaattituotanto ja pienempi SA-tuotanto ar36: een verrattuna luonnostaan alhaisesta hapensaannista ja väliaineen happamoitumisesta ravistuspulloviljelmissä, molempia kantoja viljeltiin 1 L: n eräfermenttoreissa valvotuissa pH-olosuhteissa ja liuenneen hapen jännitteellä (DOT). Sa-titterin nostamiseksi Glc: n alkupitoisuus näissä kokeissa nostettiin 100 g/L: aan ja YE-pitoisuus nostettiin samanaikaisesti 15 g/L: aan suuremman biomassan tuottamisen mahdollistamiseksi.

näissä olosuhteissa kanta AR36 tuotti 42 g/L SA: ta 60 tunnissa kuluttaen kaiken Glc: n ja keräten 12 g/L asetaattia. Sen sijaan 47 tunnin jälkeen kanta AR26 tuotti enintään 13 g/L SA: ta, ei tyhjentänyt Glc: tä ja keräsi 29 g/L asetaattia (Kuva 3e ja taulukko 2). Riippumatta fermentorien valvotuista olosuhteista, joissa pH pidettiin 7: ssä ja Piste oli koko ajan yli 20%, molempien kantojen tuotantoprofiilit muistuttivat ravistuspulloissa havaittua käyttäytymistä AR26: n tuottaessa enemmän asetaattia ja vähemmän SA: ta. Vaikka molempien kantojen maailmanlaajuinen volumetrinen GLC-kulutus (Qsglobal), μ ja Xmax olivat samanlaiset, tuottavuus, saanto ja titteri olivat yli kaksinkertaiset AR36: ssa kuin AR26: ssa (Kuva 3e ja taulukko 2).

on merkillistä, että näin suuria eroja asetaatin ja SA: n tuotannossa havaittiin hajottamalla vain yksi geeni, mikä osoittaa PTS: n ja pykF: n yhdistetyn inaktivaation edut käytettäessä konstitutiivista ilmaisujärjestelmää kehittyneessä E. coli-kannassa. SA: n tuotannossa Havaittujen parannusten huomioon ottamiseksi ehdotamme, että operoniin koodattujen entsyymien varhainen ja jatkuva ilmentyminen voisi ylläpitää glykolyyttisten välituotteiden tasaista kulutusta kaikissa viljelmissä estäen niiden solunsisäisten pitoisuuksien suuret vaihtelut. Oletamme, että tämän vakaan metabolisen tilan yhdistäminen pykf-geenin inaktivoinnin aiheuttamaan Pep: stä pyruvaattiin vähenevään virtaukseen voi lisätä PEP: n ja muiden glykolyyttisten lähtöaineiden saatavuutta SA: n tuotannossa ilman, että GLC: n kulutus vähenee. Myönnämme kuitenkin, että koska mitattuja solunsisäisiä metaboliittipitoisuuksia ei ole, nämä huomautukset ovat spekulatiivisia.

ar36: n Käymisprofiilit eräviljelmissä

aikaisemmat tulokset huomioon ottaen ar36 valittiin sen kineettisen ja stoikiometrisen suorituskyvyn tarkempaan karakterisointiin 1 litran fermentoreissa. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi SA: n tuotantoa testattiin kolmella eri korkeasubstraattiviljelyolosuhteella. Kasvua, Glc: tä ja sivutuotteita mitattiin kullekin tapaukselle, mikä puolestaan mahdollisti tuotteiden ja satojen vertailun.

ensin käytettiin 50 g/L Glc: tä ja 15 g/L YE: tä (Kuva 4a). Kasvu tapahtui ensimmäisen 10 tunnin aikana, jolloin syntyi 6,3 g/L kuivasolun painosta 0,53 h-1 μ: n arvolla. Tällöin SA: ta tuotettiin 24 g / L 32 tunnissa. Glc: n kulutus ja SA: n tuotanto tapahtuivat käymisen alusta ja kestivät Glc: n loppumiseen asti, vaikka GLC: n ominaiskulutusnopeus (qs) ja spesifinen SA: n tuottavuus (QP) olivat eksponentiaalivaiheessa korkeammat (Taulukko 3). Tuloksena saatu SA: n tuotto Glc: llä (YSA/Glc) oli 0,47 mol/mol ja globaali volumetrinen SA: n tuottavuus (Qpglobal) oli 0.74 gSA/L*h (Taulukko 3). Sivutuotteiden kertymisen osalta SA-reitillä supernatantissa oli käymisen päättyessä 2, 4 g/L dahp: N, 2, 1 g/L DHS: n, 1, 4 g/L QA: n, 0, 4 g/L GA: n ja 0, 3 g/L DHQ: n pitoisuuksia (Kuva 5a). Näissä olosuhteissa ei käytännössä tuotettu asetaattia käymisen aikana, jolloin enimmäispitoisuus oli 1,5 g / L 32 tunnin kuluttua (kuva 4a).

ar36-kannan Käymisprofiili, jota viljellään 1 litrassa bioreaktoreita, joilla on kolme erilaista substraattipitoisuutta. a) 50 g/L Glc: tä ja 15 g/L YE: tä; b) 100 g/L Glc: tä ja 15 g/L Yee: tä; c) 100 g/L GLC: tä ja 30 g/L Yee: tä. Glc: ympyrät; SA: neliöt; asetaatti: avoimet kolmiot; biomassapitoisuus: käänteiset kolmiot. Virhepalkit edustavat keskihajontaa.

Sa-reitin aromaattiset sivutuotteet, jotka on havaittu 1 L: n ar36-kannan fermentoriviljelmissä käyttäen kolmea eri substraattipitoisuutta. a) 50 g/L Glc: tä ja 15 g/L YE: tä; b) 100 g/L Glc: tä ja 15 g/L Yee: tä; c) 100 g/L GLC: tä ja 30 g/L Yee: tä. Timantti: Dahp (3-deoksi-d-arabinoheptulosonaatti-7-fosfaatti); neliöt: DHQ (3-dehydrošikiinihappo); ympyrät: DHS (3-dehydroshikimiinihappo); kolmiot: QA (kviinihappo); käänteiset kolmiot: GA (gallushappo). Virhepalkit edustavat keskihajontaa.

ottaen huomioon, että 50 g/L Glc: tä kulutettiin kokonaan, aloitettiin toinen eräkoe 100 g/L Glc: tä ja 15 g/L YE: tä. Kuten edellisessä jaksossa esitetyssä vertailussa ar26: een todettiin, näissä olosuhteissa kasvatettu AR36 tuotti noin 42 g/L SA: ta 60 tunnissa (Kuva 4b). Tässä tapauksessa noin 100 g/L glukoosia ja SA: n enimmäispitoisuuden saavuttamisen jälkeen kanta tuotti 12 g/L asetaattia. Ysa/Glc: n, Qpglobalin, Qsglobalin, Xmax: n ja μ: n arvot olivat samanlaiset kuin Glc: n 50 g/L ja YE: n 15 g/L: n arvot (Taulukko 3). Nämä kokeet osoittavat, että kun käytetään samaa YE-pitoisuutta, GLC: tä kulutetaan kaksinkertainen määrä lähes kaksinkertaisessa ajassa, mikä osoittaa, että keskimääräinen glukoosinkulutus säilyy molempien viljelyolosuhteiden välillä. Dahp: n 4,8 g/L, DHS: n 2,8 g/L, QA: n 3,4 g/L, 0.Supernatantissa oli 7 g/L GA: ta ja 0, 9 g/L DHQ: ta 60 tunnin kuluttua (kuva 5b). Mielenkiintoista on, että GLC-pitoisuuden kaksinkertaistuessa AAA-reitin välituotteet kasvoivat melko suhteellisesti SA: n kanssa, mikä osoittaa, että GLC: n 100 g/L kulutus ei ilmeisesti synnyttänyt uusia hiilivuon pullonkauloja. Tämän seurauksena SA: n määrä suhteessa tuotettujen aromaattisten yhdisteiden kokonaismäärään oli molemmissa kokeissa lähes 80% (kuva 6).

kunkin ar36-kannassa tuotetun aromaattisen yhdisteen Mooliprosentti suhteessa eräviljelmien kokonaismäärään alkaen: a) 50 g/L Glc: tä ja 15 g/L Yee: tä; b) 100 g/L Glc: tä ja 15 g/L Yee: tä; c) 100 g/L Glc: tä ja 30 g/L Yee: tä. Tuotettujen aromaattisten yhdisteiden lasketut tuotokset ja moolisuhteet esitetään kunkin baarin alla. Vertailut tehtiin fermentaatioiden lopussa supernatantista mitattuihin pitoisuuksiin. YSA/Glc = SA: n tuotto Glc: stä; YTAC/Glc = GLC: n aromaattisten yhdisteiden kokonaissaanto; Ymax = aromaattisten yhdisteiden teoreettinen enimmäissaanto.

YE: n lisäämisen vaikutusta SA: n tuottavuuteen tutkittiin kolmannella koesarjalla, jossa käytettiin Glc: tä 100 g/L ja YE: tä 30 g/L. Vaikka biomassa kaksinkertaistui käytettäessä kaksinkertaista YE-pitoisuutta, SA-titteri, μ ja YSA/Glc olivat hyvin samanlaisia kuin viljelmässä, jossa Glc: tä oli 100 g/L ja YE: tä 15 g / L (kuva 4b ja kuva 4c). Yhdessä kahdesta muusta ehdosta saatujen tietojen kanssa nämä havainnot viittaavat siihen, että YE: n määrä määrittää ensisijaisesti maksimibiomassan, joka voidaan saavuttaa. Lisäksi alkuperäisen YE-pitoisuuden lisäys ei muuttanut SA-titteriä, ja se tukee havaintoa siitä, että SA tuotetaan pääasiassa glukoosista. YE: n alkuperäisen pitoisuuden ja tuotetun biomassan enimmäismäärän välinen suora yhteys riippumatta näissä kasvuolosuhteissa testatusta GLC: n alkuperäisestä pitoisuudesta viittaa siihen, että YE toimittaa yhtä tai useampaa rajoittavaa ravintoainetta. Näyttää myös siltä, että tällaisia ravintoaineita ei voida syntetisoida Glc: stä, joten niiden ehtyminen YE: stä rajoittaa kasvua jo kauan ennen Glc: n loppumista. On odotettavissa, että AR36-auksotrofian vastapainoksi tarvittavat aromaattiset aminohapot ja vitamiinit tulevat rajoittamaan kasvua.tämän monimutkaisen väliaineen muilla yhdisteillä voi kuitenkin olla merkitystä kasvun rajoittamisessa ajan mittaan.

kun alkava YE-pitoisuus oli 30 g / L, Glc: tä kulutettiin ja tuotettiin yhteensä 106 g/L ja SA: ta 43 g/L, noin puolet ajasta kuin käymistä 15 g/L YE: tä. Kun YE: n pitoisuus oli 30 g/L, Qsglobal ja Qpglobal lisääntyivät kaksinkertaisiksi verrattuna YE: n fermentaatioihin 15 g/L, vaikka SA-titteri pysyi muuttumattomana (Taulukko 3). Koska myös biomassa kasvoi kaksinkertaiseksi, lasketut qp ja qs olivat samanlaisia kolmen kokeen välillä sekä eksponentiaalisessa että stationaarisessa faasissa, mikä osoitti suunnitellun kannan metabolisen kestävyyden testiolosuhteissa.

tulokset osoittivat lisäksi, että YE-pitoisuuden nousu ei lisännyt merkittävästi SA-reitin välituotteiden pitoisuutta (Kuva 5c). Tässä yhteydessä on tunnustettu, että suuret määrät reitin välituotteita voivat vaikuttaa kielteisesti SA: n talteenottoon käymisliemestä . Tämä huoli on suunnattu joitakin ponnisteluja aiheesta, mikä johtaa testaus kulttuurin olosuhteet, geneettiset taustat, ja käyttö ei-metaboloituvia glukoosi analogeja, kuten yrittää minimoida sivutuotteiden sukupolven .

näissä kokeissa havaittiin suuri osuus SA: sta sivutuotteisiin verrattuna ilman, että kantaa tai prosessia olisi muutettu enempää. Kunkin reitin välituotteen konsentraatiota verrattiin kaikkien aromaattisten välituotteiden summaan, ja niiden prosenttiosuuksia käytettiin laskettaessa SA: n moolisuhde kuhunkin sivutuotteeseen fermentaatioiden lopussa (kuva 6). SA: n suhde osoittautui korkeammaksi kuin 10 DHS: llä, QA: lla tai DAHP: llä ja korkeammaksi kuin 40 GA: lla tai DHQ: lla kaikilla testatuilla substraattipitoisuuksilla. Merkittävää on, että kaikissa olosuhteissa SA-saanto oli lähes 50 prosenttia teoreettisesta enimmäismäärästä ja aromaattisten yhdisteiden kokonaissaanto yli 60 prosenttia teoreettisesta enimmäismäärästä, joka on arvioitu arvoksi 0.86 molTAC/molGlc (KS.menetelmät ja kuva 6). Tämä kuvastaa glukoosin tehokasta suuntautumista kohti AAA-reittiä kannassa AR36, jopa käytettäessä korkean glukoosin eräviljelmiä. SA: n suhde sivutuotteisiin sekä saadut SA-ja TAC-tuotokset ovat melko vakio kaikissa arvioiduissa olosuhteissa ja edustavat tietojemme mukaan korkeimpia raportoituja arvoja SA-tuotannon käymisprosessille. Nämä parannukset voidaan perustella ottamalla huomioon, että suunnitellussa kannassa oleva alusta mahdollistaa tarvittavien entsyymien homogeenisemman ilmentymisen tehokkaalla geneettisellä taustalla. Tämä, toisin kuin muut ilmentymäjärjestelmät, joissa vaaditut geenit ilmaistaan erillisistä plasmideista, eri promoottoreista tai kannoista, joita ei ole optimoitu suuren Glc-pitoisuuden tehokkaaseen käyttöön. Geenin ilmentymisen dynamiikkaan liittyvien etujen lisäksi se, että IPTG: tä ei tarvita aro6-operonin indusoimiseen, on tärkeä taloudellinen hyöty tuotantoprosessille, sillä IPTG: n korkea hinta rajoittaa sen käyttöä suurissa fermentaatioissa.

Insights on the glycolytic and acetate metabolisms of stain AR36 by RT-qPCR

jotta saataisiin syvempää tietoa metabolisista muutoksista, joita aro6-synteettisen operonin konstitutiivinen ilmentyminen kannassa AR36 aiheuttaa, useiden geenien transkriptiotasot mitattiin kolmessa eri kasvuvaiheessa viljelmissä, joissa Glc: tä oli 50 g/L ja YE: tä 15 g/l. Kuten menetelmissä yksityiskohtaisesti esitetään, varhaisen eksponentiaalisen vaiheen (ee), myöhäisen eksponentiaalisen vaiheen (le) ja stationäärisen vaiheen (ST) tulokset normalisoitiin samoissa viljelyolosuhteissa kasvatetusta kannasta AR3e at ee mitattuihin arvoihin.

tulokset osoittavat, että operonin esiintyminen ja ilmentyminen kannassa AR36 lisää useiden glykolyyttisiä entsyymejä koodaavien geenien transkriptiotasoja EE-ja LE-faasien aikana (Kuvat 1 ja 7a). Geenien Galp ja glk ekspression lisääntyminen on erityisen mielenkiintoista, koska on raportoitu, että niiden tuotteet ohjaavat glukoosin tuontia ja fosforylaatiota pb12: ssa, ar36: n vanhemmassa kannassa . Lisäksi SMM: n ja Enon, mutta ei pykan, transkriptiotasot ovat lisääntyneet merkittävästi. Nämä muutokset voivat johtaa PEP: n ja fruktoosi 6-P: n suurempaan saatavuuteen (jonka plasmidikoodattu transketolaasi voi suoraan muuntaa e4p: ksi), mikä lisää aromaattisten yhdisteiden saantoa. Teoriamme mukaan ar36-kannan glykolyyttisten geenien havaittu säätely voi olla yksi seurauksista joidenkin glykolyyttisten välituotteiden (glukoosi-6-fosfaatti, fruktoosi-6-fosfaatti ja PEP) alhaisille tasoille, jotka johtuvat näitä metaboliitteja kuluttavien operonikoodattujen entsyymien voimakkaasta ja konstitutiivisesta ilmentymisestä.

Transkriptiomuutokset, jotka johtuvat aro6-synteettisen operonin ilmentymisestä kannassa AR36. Vertailun vuoksi kunkin geenin transkriptiotaso määritettiin ar36-kannan kasvukäyrän kolmesta eri pisteestä, joissa oli 50 g / L Glc: tä ja 15 g/L YE: tä (KS.Kuva 4a). Kaikki tiedot normalisoitiin eksponentiaalisen kasvun alkuvaiheen ar3e-kannasta saatuihin arvoihin. a) glykolyyttisiä entsyymejä koodaavat geenit; b) asetaatin assimilaatioon ja biosynteesiin osallistuvat geenit; c) synteettiseen Aro6-operoniin kuuluvat geenit (KS.Kuva 1 ja kuva 2). Mustat palkit: varhainen eksponentiaalinen vaihe; harmaat palkit: myöhäinen eksponentiaalinen vaihe; valkoiset palkit: stationäärinen vaihe. Virhepalkit edustavat keskihajontaa.

toisaalta asetaatin biosynteesiin osallistuvien entsyymien (poxB, ackA ja pta) geenien transkriptiotasoja ei muutettu synteettisen operonin läsnäololla, kun taas ACS, jotka koodaavat asetaatin assimilaatioon osallistuvia entsyymejä, olivat voimakkaasti EE-ja LE-faaseissa (Kuva 7b). ActP-ja acs-geenien upregulaatiota on havaittu myös eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa parental-kannassa PB12, joka kykenee hyödyntämään GLC: tä ja asetaattia yhdessä minimaalisessa väliaineessa . Nämä löydökset korreloivat alhaisiin asetaattipitoisuuksiin määritetyssä kasvutilanteessa (Kuva 4a). Tärkeää on, että näiden asetaatti-assimilaatioon osallistuvien geenien transkriptioarvot olivat alhaiset ST-vaiheessa (kuva 7b). Jos tämä vaste edustaa muita käytettyjä kasvuolosuhteita, se voi osittain selittää asetaatin kertymisen fermentaatioissa, joissa Glc: tä on 100 g/L ja jotka kuluttavat suurempia määriä Glc: tä stationäärifaasin aikana (kuvat 4b ja 4c). Nämä tulokset korostavat actP: tä ja acs: ää mahdollisina geenikohteina, jotka keinotekoisesti lisäävät niiden ilmentymistä myöhäisviljelyvaiheissa hyödyntäen kannan AR36 odotettuja valmiuksia käyttää samanaikaisesti GLC: tä ja asetaattia, joka on läsnä sen vanhemmassa kannassa PB12 .

synteettisessä operonissa esiintyvillä geeneillä oli hyvin vahva ilmentymistaso (jopa stationäärifaasissa), mikä kuvastaa promoottorin konstitutiivista luonnetta ja plasmidin suurta kopiolukua (Kuva 7c). Nämä tulokset korreloivat GLC: n keskeytymättömän kulutuksen ja SA: n tuotannon kanssa koko käymisen aikana (Kuva 4a), mikä viittaa siihen, että operonin geenien koodaamat entsyymit ovat läsnä koko viljelyajan. Kuvasta 7c voidaan nähdä, että arodin ja zwf: n transkriptiotasot ovat suhteellisesti korkeammat ja vastaavasti matalammat kuin operonin neljä muuta geeniä. Tähän havaintoon on suhtauduttava varauksella, koska operonin kuutta geeniä verrataan viitekannan ar3e kromosomissa oleviin geeneihin. Koska kuudelle geenille saadut arvot eivät normalisoidu niiden välillä, niiden kromosomiekspression vaihtelut kannassa AR3e voivat muuttaa suhteellisia vertailuja kantaan AR36. Transkriptomiset tiedot ovat kuitenkin yhdenmukaisia testiolosuhteissa saadun SA: n ja aromaattisten välituotteiden suuren suhteen kanssa, mikä on odotettavissa, jos kaikki operonin geenit ilmaistaan riittävästi. Yhdessä kineettisten ja stoikiometristen tietojen kanssa nämä tulokset korostavat etuja, jotka saadaan käyttämällä konstitutiivisesti ilmaistua synteettistä operonia vaihtoehtoisena strategiana lisätä SA: n saantoa Glc: stä kehittyneessä kannassa, josta puuttuu PTS ja pykF.