Pesäke-PCR

pesäke-PCR on kätevä suurikapasiteettinen menetelmä insertin DNA: n esiintymisen tai puuttumisen määrittämiseksi plasmidirakenteissa. Yksittäiset transformantit voidaan joko lysätä veteen lyhyellä lämmitysvaiheella tai lisätä suoraan PCR-reaktioon ja lysätä ensimmäisen lämmitysvaiheen aikana. Tämä alkulämmitysvaihe aiheuttaa plasmidi-DNA: n vapautumisen solusta, joten se voi toimia mallina monistusreaktiolle. Alukkeilla, jotka on suunniteltu erityisesti kohdistamaan insertti-DNA: han, voidaan selvittää, sisältääkö konstruktio kiinnostavan DNA-fragmentin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää alukkeita, jotka kohdistavat vektori-DNA: ta inserttiin, jotta voidaan määrittää, onko insertti oikea molekyylikoko. Insert specific alukkeet voivat antaa tietoa insertin DNA: n spesifisyydestä ja koosta, kun taas vektorispesifisten alukkeiden käyttö mahdollistaa useiden konstruktioiden seulonnan samanaikaisesti. Pesäke PCR: ää voidaan käyttää myös insertin suunnan määrittämiseen. Plasmidin PCR-vahvistus käyttämällä vektorikohtaista pohjustinta, joka on yhdistetty vektorikohtaiseen pohjustimeen, voidaan suunnitella tuottamaan tietyn kokoinen amplikoni vain, jos insertti on oikeassa suunnassa. Kaikissa koemalleissa PCR-amplikonin esiintyminen tai puuttuminen ja tuotteen koko määritetään elektroforeesillä agaroosigeelissä olevan DNA-kokomerkin rinnalla.