prevalenssi ja jotkin Kolistiiniresistenssin mekanismit Monilääkeresistenttien ja laajasti lääkkeille resistenttien Pseudomonas aeruginosa

Johdanto

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) on opportunistinen taudinaiheuttaja, jota esiintyy yleisesti ympäristössä, kuten maaperässä, vedessä, kasveissa ja sairaalaympäristössä, ja jolla tiedetään luontainen resistenssi monille mikrobilääkkeille ja kyky aiheuttaa hengenvaarallisia infektioita. Sitä pidetään toisena yleisenä sepsiksen aiheuttajana tehohoitoyksiköissä (ICUs) ja se voi aiheuttaa hengityskoneeseen liittyvää keuhkokuumetta, haavainfektioita ja virtsatietulehduksia (UTI). Monet tutkimukset raportoivat P. aeruginosa-hoitoon liittyvien infektioiden kuolleisuuden ja sairastuvuuden lisääntymisestä, erityisesti niiden infektioiden, joilla ilmeni monilääkeresistenssiä.1-3

monilääkeresistentin (MDR) tai laajasti lääkkeille resistentin (XDR) tai pandrugille resistentin (PDR) P: n ilmaantuminen. aeruginosasta tulee merkittävä kansanterveydellinen ongelma, joka voi johtaa mikrobilääkehoidon viivästymiseen tai sen epäonnistumiseen ja kuolleisuuden kasvuun erityisesti karbapeneemille vastustuskykyisen P. aeruginosan ilmaantumisen myötä. Joten, huomiota tarvitaan, koska nämä resistentit kannat voivat osoittaa resistenssiä kaikille käytettävissä mikrobilääkkeiden tai osoitti alttiutta vain myrkyllisiä, kuten kolistiini tai polymyksiinit jätä mitään vaihtoehtoja terveydenhuollon joukkue hoidettaessa vakavia infektioita, jotka liittyvät MDR P. Aeruginosa.4

äskettäin on havaittu resistenssiä polymyksiineille tietyillä enterobakteerien lajeilla, kuten K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes ja Enterobacter cloacae, koska sitä käytetään laajalti infektioiden hillitsemiseen eläinlääketieteessä. Kolistiiniresistenssistä on tullut merkittävä haaste hengenvaarallisten infektioiden hoidossa erityisesti mcr-1-geenien ja muiden useiden lääkeresistenssigeenien, kuten ESBL -, MBL-ja NDM-geenien, samanaikaisen olemassaolon myötä, jolloin pan-lääkeresistenssin syntyminen on mahdollista.5,6

kolistiini eli polymyksiini E on yksi polymyksiineiksi kutsuttujen kationisten polypeptidien perheen jäsenistä. Tälle antibioottiperheelle on ominaista lipofiilinen rasvaasyylisivuketju. Nykyään kolistiini otetaan uudelleen käyttöön lääketieteellisessä hoidossa ja sitä pidetään viimeisenä keinona MDR-ja XDR-tahrojen aiheuttamien vakavien infektioiden hoidossa. Yleensä polymyksiinien vaikutus bakteereihin riippuu pääasiassa positiivisesti varautuneen antibiootin ja lipidi A: n negatiivisesti varautuneen fosfaattiryhmän sähköstaattisesta vuorovaikutuksesta ulkokalvolla sen sitoutumisen jälkeen, se diffundoituu ulkokalvolla, periplasmisessa tilassa ja vuorovaikutuksessa sisäkalvon kanssa. Polymyksiinit aiheuttavat epävakautta ulkokalvolle, huokosmuodostusta, lisäävät läpäisevyyttä, vuotoa sytoplasmaan, jota seuraa solulyysi.7

Kolistiiniresistenssi johtuu pääasiassa kemiallisesta muunnoksesta, joka johtuu fosfoetanoliamiinin entsymaattisesta lisäämisestä lipopolysakkaridin lipidiosan 4ʹ – fosfaattiryhmään vähentämällä ulkokalvon nettonegatiivista varausta, mikä johtaa polymyksiinin affiniteetin vähenemiseen. Resistenssi kolistiinille voi johtua K. pneumoniae-bakteerin raportoimasta kromosomaalisesti koodatusta mutaatiosta tai resistenssin horisontaalisesta siirtymisestä kolistiiniresistenttiä geeniä kantavan plasmidin (mcr-1) avulla.8-11

kolistiiniresistenssin ilmaantuminen useissa Aasian, Euroopan ja joidenkin Afrikan maiden maissa on noussut yhdeksi maailmanlaajuisista huolenaiheista. As: n mukaan kolistiiniresistenssin leviäminen osoittaa sen kyvyn siirtyä horisontaalisesti konjugatiivisten plasmidien tai vertikaalisesti kromosomimutaation avulla.12,13, koska kolistiini on yksi viimeisistä vakavien infektioiden hoitolinjoista, kolistiiniresistenssisolaattien syntyminen uhkaa maailmaa parantamattomien tartuntatautien ilmaantumisen vuoksi.14 Kolistiiniresistenssin toteaminen Egyptissä, joka tunnetaan suuresta tartuntatautitaakastaan ja siitä, että mikrobilääkkeiden käyttöä sekä eläinlääketieteessä että lääketieteessä rajoitetaan vähän tai ei lainkaan, mikä osoittaa, että alueellamme on ilmaantunut hoitamattomia sairauksia, koska kolistiiniresistenssi voidaan siirtää erittäin resistenteille bakteereille.15

tässä tutkimuksessa selvitettiin KOLISTIINIRESISTENSSIN yleisyyttä MDR: n ja XDR P: n välillä. aeruginosa eristettiin potilaista, jotka kärsivät erilaisista infektioista Minian yliopistollisen sairaalan tehohoitoyksikössä (ICU) Egyptissä.

materiaalit ja menetelmät

Isolaattikokoelma

Sataseitsemänkymmentäviisi kliinistä näytettä eri infektiolähteistä kerättiin potilailta, jotka otettiin teho-osastolle Minian yliopistolliseen sairaalaan, Miniaan, Egyptiin osana sairaalan rutiinilaboratoriotoimenpiteitä. Kaikki kliiniset näytteet viljeltiin tryptikaasiagarilla (Lab M, UK) 37°C: n ja 42°C: n lämpötilassa 24 tunnin ajan. Yksi siirtokunta oli aliviljelty MacConkey-agar-levyillä ja cetrimide-agarilla. Eristettyjä pesäkkeitä tunnistettiin edelleen pesäkemorfologian, laktoosikäymisen, biokemiallisten reaktioiden (mukaan lukien sulfidi–indolin motiliteetti, katalaasi, kolmoissokerirauta, ureaasi ja oksidaasitestit), kyvyn kasvaa setrimidiagarilla ja kasvaa 42°C: ssa. 16 P. aeruginosa-pesäkkeet puhdistettiin viiruttamalla ja puhtaat pesäkkeet varastoitiin 4°C: ssa.

Antibioottiherkkyystestit

Antibioottiherkkyys Kirby-Bauer-Levydiffuusiomenetelmällä

antibioottiherkkyys eri antibioottiryhmiä vastaan testattiin Kirby-Bauer-levydiffuusiomenetelmällä.17 käytettyä Antibioottilevyä olivat amoksisilliini/klavulaani (AMC) (20/10 µg), ampisilliini / sulbaktaami (SAM) (20 µg), meropeneemi (mem) (10 µg), imipeneemi (IPM) (10 µg), kefepiimi (FEB) (30 µg), kefoperatsoni (CEP) (75 µg), polymyksiini B (PB) (300 µg), siprofloksasiini (CIP) (5 µg), levofloksasiini (Lev) (5 µg), gentamisiini (CN) (10µg), keftatsidiimi (caz) (30 µg), tigesykliini (TGC) (15 µg), amikasiini (ak) (30 µg), tobramysiini (CF) (10 µg), atstreonaami (ATM) (30 µg), piperasilliini (PRL) (30 µg), karbenisilliini (car) (100 µg) (OKSOIDI; Basingstoke, UK). Isolaatit luokiteltiin herkiksi, keskitasoisiksi ja resistenteiksi inhibitio zones-tulkintastandardin (interpretation standards of Clinical Laboratory standards Institute, CLSI) 2018 mukaan.18

Mic-määritystä Kolistiiniantibiootille

Agar-laimennusmenetelmää Muller-Hinton agarilla käytettiin kolistiinin pienimmän inhibitorisen pitoisuuden määrittämiseen.19 Resistenssiä kolistiinille arvioitiin, jos MIC on ≥4µg/mL CLSI: n standardisuositusten mukaisesti.18

antibioottiherkkyydestä saatujen tulosten mukaan isolaatit luokiteltiin MDR: ään, XDR: ään ja PDR: ään aiemmin raportoitujen kriteerien mukaisesti.20

yhdistetty Levydiffuusiotesti (CDT)

kaikki kolistiinille resistentit isolaatit (MIC ≥4) testattiin käyttäen 100 mM EDTA: ta (Sigma-Aldrich; St. 268 Louis, MO, USA) mcr-1-aktiivisuuden estämiseen, koska tällä pitoisuudella ei todettu antimikrobista vaikutusta. Bakteerikantoja viljeltiin Muller-Hinton agarilla (Lab M, UK), jossa käytettiin kolmea levyä. Yksi levy kyllästettiin 10 µL: lla 100 mM EDTA: ta, jotta käytetty EDTA-pitoisuus ei estäisi bakteerien kasvua. Kaksi muuta levyä olivat 10µg kolistiinilevyä ja 10 µg kolistiinia sekä 10 µL 100 mM EDTA-levyä. Isolaattien havaittiin suurentavan ≥3 mm kolistiini/EDTA-levyn inhibitioalueen halkaisijaa verrattuna kolistiinilevyyn.21

Zeta-potentiaalin muutos

mcr-geenit koodaavat fosfoetanoliamiinitransferaasientsyymejä, jotka liittävät entsymaattisesti fosforietanoliamiiniosion (PEtN) gramnegatiivisten bakteerien ulomman kalvon lipidiin A, mikä johtaa kolistiiniresistenssin aiheuttavan negatiivisen nettovarauksen vähenemiseen.22

bakteerisolujen on annettu kasvaa 80 µg/mL EDTA: n läsnä ollessa ja ilman sitä. Sitten bakteerisuspensiota sentrifugoitiin nopeudella 5000 rpm 5 min 5°C: ssa, minkä jälkeen pelletit pestiin kahdesti, minkä jälkeen pelletit suspendoitiin 2 mL: aan steriiliä 1 mM NaCl-liuosta säädettynä 0,5 McFarland-standardiliuoksen sameuteen. Näytteet laimennettiin arvoon 1: 4 käyttäen 1 mm NaCl: ää. Zeta-potentiaali määritettiin 2 mL: sta laimennettua näytettä. EDTA: n aiheuttamat muutokset Zeta-potentiaalissa laskettiin Zeta-potentiaalisuhteesta (RZP=ZP+EDTA/ZP-EDTA), jossa ZP+EDTA ja ZP-EDTA vastaavat Zeta-potentiaaliarvoja, jotka saadaan bakteerisuspensioille, jotka on kasvatettu 80µg/mL EDTA: n läsnä ollessa tai ilman sitä. Rzp ≥ 2, 5-arvo, jota pidetään kriteerinä mcr-1-positiivisten kantojen tunnistamisessa.21

DNA-uutto

DNA-templaatti uutettiin aiemmin kuvatulla tavalla P. aeruginosa-bakteeriviljelmästä yön yli.23 bakteeripelletin suspensiota keitettiin 10 min, sitten sentrifugoitiin. Supernatanttia käytettiin suoraan PCR-määrityksessä.

testattujen geenien PCR-analyysi

eksotoksiini A on P. aeruginosan tärkeä virulenssitekijä (sytotoksinen aine) kliinisissä infektioissa. Tämä tekijä estää proteiinien biosynteesiä, mikä johtaa suuriin kudos-ja elinvaurioihin. P. aeruginosa-kromosomissa sijaitsevaa synnynnäistä Toxa-geeniä käytetään P. aeruginosa-vahvistukseen PCR: llä.

PCR tehtiin kokonaistilavuudeltaan 25 µL sisältäen 1X PCR-puskuria, 1 µmol/L kutakin primeria, 1 µL genomista DNA: ta (likimäärin 150 ng), 200 µmol/L dntps-seosta, 2 mmol/L MgCl2: ta ja 0, 05 U/µL Taq DNA-polymeraasia. PCR-vahvistimet tehtiin toxA FW:CTGCGGGTGCC, RV:GATGCTGGACGGGTCGAG automaattisessa lämpösyklissä (Eppendorf, Hampuri, Saksa) seuraavissa olosuhteissa: 30 sykliä 1 min 94°C: ssa, 1, 5 min 63°C: ssa ja 1 min 72°C: ssa. 24

geenit mcr-1 ja mcr-2 määritettiin perinteisellä PCR: llä tekniikka, jossa käytetään seuraavia alukkeita: mcr-1 FW (5′-AGTCCGTTGTGC-3′), RV (5′-AGATCCTTGGTGG-3′) ja mcr-2 Fw (5ʹ-ATGACATCACCTGG-3ʹ), Rv (5ʹ-TTACTGGATAATGCCGC-3ʹ).25,26 tekniikkaolosuhteet olivat 34 jaksoa 95°C: ssa 1 min, 58°C mcr-1: ssä ja 52°C 30s: ssa, 72°C: ssa 1 min: ssa ja sen jälkeen 72°C: ssa 5 minuutin ajan.

Effluksipumppujen Inhibition määrittäminen MIC-pelkistyksellä käyttäen Effluksipumpun estäjää (CCCP)

agar-laimennusmenetelmää käytettiin Mic-yhdisteiden määrittämiseen kationilla mukautetulla Mueller-Hinton-liemellä (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). CCCP: n (EPI) ja kolistiinin MIC-arvot määritettiin testatuille isolaateille. CCCP: n alimikrofonia käytettiin määritettäessä sen vaikutusta kolistiinin MIC: hen; CCCP: n pitoisuus (0, 5× MIC) pidettiin jatkuvasti yllä mainituilla MIC-pitoisuuksilla, kun taas antibiootin pitoisuus suureni sarjamuotoisesti. Isolaattien ja kolistiinin MIC-arvot CCCP: n puuttuessa ja läsnä ollessa määritettiin käyttämällä CCCP: n alimikrofonia (lopullinen pitoisuus 10 mg/L), kuten on jo kuvattu.27 CCCP: n lisäämisen jälkeen syntyneet MIC-kertymämuutokset laskettiin CCCP: stä vapaan antibiootin MIC-tason ja CCCP: hen lisätyn antibiootin MIC-tason suhteena. Kuten Osei Sekyere on aiemmin kuvannut, amoako28, joka ilmoitti, että positiivinen kriteeri efflux-pumppujen esiintymiselle isolaateissa oli kolistiinin MIC: n ≥8-kertainen pieneneminen CCCP: n lisäämisen jälkeen.

Ulkokalvoproteiinikuvio

yhtä testattujen P. aeruginosa-isolaattien pesäkettä viljeltiin 5 mL: ssa LB-lientä 37°C: ssa 2 päivän ajan ravistamalla 200 kierrosta minuutissa. Kennoja sentrifugoitiin 8000 rpm: n nopeudella 5 minuutin ajan. Bakteeripelletit suspendoitiin 1 mL: aan lysis-puskuria (0,05 M Tris HCL, 2% SDS, 10% glyseroli), jota kuumennettiin 95°C: ssa 10 minuutin ajan. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 10.000 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan. Noin 50 µL uutettua proteiinia sekoitettiin näytepuskuriin (4 mL deionisoitua vettä, 1 mL 0, 5 M Tris HCL:ää, 1, 6 mL 10% SDS: ää, 0, 4 mL 2-merkaptoetanolia, 0, 2 mL 1% (w/v) Bromifenolisinistä) (1: 1) ja erotettiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelillä (SDS-PAGE).29

Lipopolysakkaridi SDS-Polyakryyliamidigeeliprofiili Kolistiiniherkille ja Kolistiiniresistenteille Isolaateille

LPS testatuista isolaateista uutettiin ja puhdistettiin kuumalla vesi-fenolimenetelmällä Westphal, Jann30, ja puhdistettu materiaali analysoitiin SDS-PAGE-menetelmällä, minkä jälkeen tehtiin hiilihydraattispesifinen hopeavärjäys.31

tulokset

Pseudomonas aeruginosan eristäminen ja Antibioottiherkkyys

175 näytteestä, jotka kerättiin eri infektioita sairastavilta potilailta, 75 näytettä (42, 8%) oli fenotyypillisesti P-positiivisia. aeruginosa ja positiivinen toksageeni.

Mikrobilääkeherkkyyskokeet osoittivat, että eristetty P. aeruginosa oli täysin resistentti amoksisilliinille/klavulaanihapolle ja että resistenssi ampisilliinia/sulbaktaamia (68%), keftatsidiimia (63%) ja atsetreonaamia (60%) vastaan oli suuri. Kohtalaista resistenssiä havaittiin sekä tobramysiiniä että tigesykliiniä vastaan (50% kumpaakin). Lisäksi imipeneemiä (6%) ja meropeneemiä (5, 3%) vastaan osoitettiin vähäistä resistenssiä (Kuva 1). Antibioottiherkkyystulosten mukaan resistentit isolaatit luokiteltiin MDR: ään (96%), XDR: ään (87%) eikä yhtään isolaattia luokiteltu PDR: ään. Lisäksi todettiin, että 75 isolaatista 16 isolaattia (21, 3%) oli resistenttejä kolistiiniantibiootille, kun MIC oli ≥ 4µg/mL (vaihteli 8-256 µg/mL).

Kuva 1 Kaikkien eristettyjen P. aeruginosa-isolaattien antibioottiresistenssi.

Mcr-1-ja Mcr-2-geenien

Mcr-1-geeni havaittiin fenotyypillisesti KOLISTIINIRESISTENTEISSÄ isolaateissa CDT: llä, jossa colistiini/EDTA-levyjen ja kolistiinilevyjen inhibitioalueiden erot mitattiin ≥ 3mm: ksi. tulokset osoittivat, että 6 isolaatin (37, 5%) kohdalla kolistiini/EDTA-levyn läpimitta kasvoi 3-10 mm verrattuna pelkkään kolistiinilevyyn (kuva 2).

kuva 2 mcr-positiivisten isolaattien fenotyyppinen toteaminen yhdistetyllä levydiffuusiotestillä (CDT). (A): mcr-1 positiivinen kanta osoitti, että kolistiinin ja EDTA: n välilevyjen vyöhykeläpimitta kasvoi ≥ 3mm verrattuna pelkkään kolistiiniin. (B): mcr-1-negatiivisessa isolaatissa havaittiin pieni muutos (1 mm) kolistiinin ja EDTA-levyn inhibitioalueen halkaisijassa verrattuna pelkkään kolistiiniin.

Zeta-potentiaalin muutos

sen sijaan Zeta-potentiaalin muutosta pidettiin FENOTYYPPISENÄ osoituksena MCR-geeneille, mutta tulokset eivät osoittaneet merkittävää muutosta Zeta-potentiaalissa kahta isolaattia lukuun ottamatta.

Resistenssigeenien osoittaminen

mcr-geenien geneettinen osoittaminen perinteisellä PCR-tekniikalla osoitti, että 8 (50%) isolaattia oli positiivisia mcr-1: lle, 6 niistä oli positiivisia CDT: lle ja 100% (16 isolaattia) oli negatiivisia mcr-2: lle.

Kolistiinille resistenttien isolaattien Antibioottiherkkyys

kolistiinille resistentin isolaatin herkkyys muita antibiootteja vastaan määritettiin Kirby-Bauer disc-diffuusiomenetelmällä, tulokset osoittivat, että 100% isolaateista oli resistenttejä amoksisilliinille/klavulaanille, kun taas ampisilliini/sulbaktaamiresistenssi oli 78, 12%, Kefepiimiresistenssi 71, 87% ja tobramysiiniresistenssi 68, 75%. Tehokkaimmat lääkkeet olivat meropeneemi, imipeneemi ja siprofloksasiini (kuva 3)

kuva 3 Kolistiinille resistenttien isolaattien antibioottiresistenssi.

.

Effluksipumppujen eston määrittäminen MIC-pelkistyksellä käyttäen CCCP: tä

tutkittaessa CCCP: N 0, 5 MIC: n vaikutusta MIC-kolistiiniin havaittiin, että vain 3 / 16 isolaatilla (P6, P8 & P16) (18, 75%) todettiin kolistiinin Mic-arvojen pienenevän ≥ 8-kertaiseksi (Taulukko 1) CCCP: n yhteydessä. Aiemmista tuloksista isolaatti ei. 16: lla havaittiin olevan efflux-mekanismi ja mcr-1-geeni.

Taulukko 1 Kolistiinille resistentit isolaatit, jotkin mahdolliset Resistenssimekanismit Kolistiinille ja niiden herkkyys muille antibiooteille

ulkokalvon SDS – sivuprofiili

taulukon 2 ja kuvan 4 mukaan viisi kaistaa, joiden molekyylipainot ovat 66.7, 56.06, 47.8, 40.18 ja 23.6 KDa oli stabiili herkissä ja resistenteissä isolaateissa, kun taas yksi vyöhyke, jonka molekyylipaino oli 21 KDa, löytyi vain kolistiiniresistenteistä kannoista, jotka olivat P1 (mcr-1 positiivinen) ja P12 (mcr-1 negatiivinen).

Taulukko 2 Kolistiiniresistentin ja Kolistiiniherkän P. aeruginosan uutettujen uloimpien kalvoproteiinien molekyylipainot ja määrä %

Kuva 4 ulkokalvo SDS-sivu kolistiiniresistenttejä ja herkkiä kantoja. Kaista 1: Proteiinimarkkeri, kaista 2 ja kaista 3: kolistiinille resistentit kannat (P1 & P12), kaistat 4-6: kolistiinille herkät kannat.

Lipopolysakkaridi (LPS) SDS-sivu

lipopolysakkaridi hopealla värjätty SDS-sivu osoitti, että kolistiiniresistenteissä mcr-1-negatiivisissa isolaateissa (P3, P6 ja P10) ei ollut LPS-nauhamallia (O-antigeeni toistaa tai LPS-ydin), joka olisi paljastanut niiden häviämisen mahdollisuuden ja näiden isolaattien resistenssin kolistiinille. Toisaalta Kolistiiniresistentti mcr-1-positiivinen kanta osoitti O-antigeenin toistuvan (kuva 5, kaista 5), joka eroaa O-antigeenistä toistaen kolistiiniherkän kannan toistoa (kuva 5, kaista 4), kun taas molemmissa todettiin LPS-ydin. Nämä tulokset voivat osoittaa, että mcr-1-positiivisessa kannassa on muuntunutta LPS: ää.

kuva 5 LPS bändejä kuvio. Kaistat 1, 2 & 3: kolistiinille resistentit mcr-1-negatiiviset kannat (P3, P6 & P10), kaista 4: kolistiinille herkät kannat ja kaista 5: Kolistiinille resistentit mcr-1-positiiviset kannat (P1). O-antigeenin toistot boksataan ja nuoli viittaa LPS-ytimeen.

Keskustelu

äskettäin on ilmennyt monilääkeresistenttejä patogeenisiä bakteerikantoja, joihin suurin osa käytettävissä olevista antibiooteista ei tehoa.6,32-36 polymyksiinit pidettiin viimeisenä keinona monilääkeresistenttien bakteeri-infektioiden hoidossa, joten kolistiiniresistenttien ilmaantumisen tutkiminen oli välttämätöntä. Polymyksiinit osoittivat aktiivisuutensa niiden välisellä sähköstaattisella vuorovaikutuksellaan ja gramnegatiivisten bakteerien lipidi A: n negatiivisesti varautuneilla osuuksilla, jotka johtivat ulomman kalvon epävakauttumiseen ja sytoplasmapitoisuuden vuotamiseen ja lyysiin.37,38

havaittiin, että yleisin polymyksiiniresistenssin aiheuttaja on LPS-modifikaatio lisäämällä 4 – amino-4-deoksi-l-arabinoosia (Lara4N) ja fosfoetanoliamiinia (mcr-tyypin geenien koodaamaa) tai galaktosamiinia LPS-ytimen lipidi A: han. Tämän seurauksena fosfaattijäämien nettonegatiivisen varauksen väheneminen vaikuttaa polymyksiinin affiniteettiin kalvoon tai johtuen kaksikomponenttisten säätelyjärjestelmien (TCSs) pmra/pmrB ja phoP/phoQ vaikutuksesta.39

tutkimuksessamme havaitsimme kolistiiniresistenssin MIC: n tulosten perusteella, joita seurasi mcr-1-fosforietanoliamiinitransferaasin esiintyminen fenotyyppisillä menetelmillä ja mcr-1geenin osoittaminen. Fenotyyppiset menetelmät riippuvat siitä, että mcr-1-fosforietanoliamiini on sinkkimetalloproteiini. Joten sinkin väheneminen vähentää kolistiinin mikromagneettisia pitoisuuksia isolaateissa, jotka ovat positiivisia mcr-1: lle. Koska sinkkimetalloproteiini on mcr-1-koodaava entsyymi, se sallii EDTA: n käytön metallikelaattorina vähentämään sinkkiä väliaineissa ja vaikuttamaan kolistiinin mikrofoneihin ja mcr-1-positiivisten isolaattien zeta-potentiaaleihin.40

tutkimuksemme osoitti P. aeruginosan suuren esiintyvyyden (42, 8%). MDR P. aeruginosa vastasi 96%: a kaikista isolaateista ja 87% oli XDR: ää. Kolistiiniresistentti P. aeruginosa (21.3%) todettiin, mikä voi johtua puutteellisista infektiontorjuntatoimenpiteistä ja bakterisidisten antibioottien väärinkäytöstä maamme sairaaloiden tehohoitoyksiköissä. Lisäksi kolistiinia käytetään laajalti maissamme elintarviketuotantoeläinten kasvun edistämisessä, erityisesti siipikarjateollisuudessa, kun taas karbapeneemejä käytetään hätätapauksissa.15 karbapeneemit osoittivat siis havaittavaa aktiivisuutta testattuihin organismeihin verrattuna kolistiiniin. Toisaalta tuloksemme olivat korkeampia kuin Liassine et al25: n raportoimat, jotka raportoivat, että yksi 300 eri bakteerilajien isolaatista on tunnistettu P aeruginosaksi, joka on vastustuskykyinen kolistiinille ja jossa on mcr-1-geeni.

yhdistettyä levydiffuusiotestiä (CDT) ja EDTA: n indusoimaa zeta-potentiaalin muutosta käytettiin fenotyyppisinä menetelminä41,42 mcr-1-geenin toteamiseen. Tulokset osoittivat, että yksikään kolistiinille resistenttien isolaattien mcr-2 ja 8 (50%) isolaatit olivat mcr-1 positiivisia, kun taas 2 isolaatin RZP oli > 2, 5. 8 mcr-1-positiivisesta isolaatista 6 oli CDT-positiivisia ja kaksi mcr-1-positiivisia (kanta No. P15 ja P16) olivat negatiivisia CDT: n suhteen, mikä saattaa johtua kolistiiniresistenssin lisämekanismin yhteistuotannosta, joka häiritsee EDTA: n vaikutusta.21 As, todettiin, että eristää ei. P16 (mcr-1 positiivinen ja CDT negatiivinen) oli positiivinen effluxille.21,43-45 lisäksi kolistiiniresistenteissä isolaateissa, jotka olivat negatiivisia mcr-1: lle, voi olla mutaatioita, jotka johtuvat mikrobilääkkeiden pitkäaikaisesta käytöstä.

lisäksi testasimme kolistiinille resistenttejä isolaatteja effluksimekanismien varalta käyttämällä CCCP: tä (efflux pump inhibitor) ja ulomman kalvoproteiinin ja LPS: n SDS-sivuprofiilin eroa herkkien ja resistenttien isolaattien välillä. Tuloksemme osoittivat efflux-mekanismin esiintyvän 3 isolaatin joukossa, kun yksi niistä oli mcr-1 positiivinen. Ulompi kalvoproteiiniprofiili osoitti yhden kaistan, jonka molekyylipaino oli 21 KDa resistenteissä isolaateissa P1 (mcr-1 positiivinen) ja P12 (kolistiiniresistentti mcr-1 negatiivinen). Lisäksi havaittiin, että kolistiiniresistenteissä mcr-1-negatiivisissa kannoissa ei ollut LPS-vyöhykemallia (O-antigeeni toistuu tai LPS-ydin), mutta mcr-1-positiivisissa (P1) ja kolistiiniherkissä isolaateissa LPS-ydin, mutta eri O-antigeeni toistuu. Machado et al20 tutkivat efflux-pumpun roolia kolistiiniresistenssissä Acinetobacter baumannissa ja havaitsivat, että efflux-aktiivisuus edistää A: n heteroresistenssiä. baumanni ilman mutaatiota. Marjani ja al43 osoittivat, että 22, 5% eristetystä P. aeruginosa-bakteerista oli resistentti kolistiinille, mikä on lähellä tuloksiamme, ja yli 50% kolistiiniresistenteistä isolaateista oli positiivisia efflux-pumpuissa.

vaikka kolistiinin tai polymyksiinien bakteerien tappamisen tarkkaa mekanismia ei selvästi tunneta, tiedetään, että niiden sitoutuminen positiivisesti varautuneisiin peptideihin ja negatiivisesti varautuneisiin lipidi A: han on kriittinen vaihe. Joten, testasimme niiden LPS SDS-sivuprofiilia ja merkittävä ero testattujen kantojen välillä havaittiin. Moffatt et al: n tutkimuksessa 46 raportoitiin,että LP: n häviäminen johti A. baumanii-kolistiiniresistentin syntymiseen, joka johtuu lipidi A: n biosynteesigeenien (lpxa, lpxC tai lpxD) inaktivoitumisesta. Ulkokalvoproteiinikuviot osoittivat, että kolistiiniresistenteissä isolaateissa esiintyy molekyylipainoltaan 21 KDa: n vyöhyke, joka saattaa vastata OprH: ta Nicas: n ja Hancock47: n raportoiman raportin mukaan Oprh: n ilmentymisellä on merkitystä Pseudomonas polymyksiineille ja EDTA: lle, koska OprH korvaa kahdenarvoisia kationeja ulkokalvolla, mikä estää polykationisten antibioottien soluunoton. Aiempi havainto voi selittää, miksi kanta ei ole. P1 (mcr-1 positiivinen) oli negatiivinen CDT: lle.

päätelmät

tämä tutkimus osoitti, että MDR: n ja XDR P. aeruginosan esiintyvyys oli suuri niillä potilailla, jotka otettiin teho-osastolle ja joilla oli erilaisia infektioita. Lisäksi se osoitti erilaisten mekanismien läsnäolon, joka voi johtaa kolistiiniresistenssiin. Tämä osoittaa, että sekä ihmisten että eläinten antibioottihoitostrategioita on kiireellisesti muutettava.