Tyypin III kollageeni on ratkaiseva kollageenin I fibrillogeneesin ja normaalin sydän-ja verisuonikehityksen kannalta

tulokset ja keskustelu

ES (J-1) – solut (22) transfektoitiin kohdistusvektorilla, joka sisälsi Col3a1-geenin genomifragmentin, jossa geenin promoottorialue ja ensimmäinen signaalipeptidiä koodaava eksoni poistettiin (Kuva. 1 A). Kohdennetut ES-solukloonit tunnistettiin Southern blot-analyysillä ja niitä käytettiin blastokystin injektioon (Fig. 1b Ylempi). Mutanttihiiret johdettiin kahdesta itsenäisesti kohdennetusta ES-solukloonista ja tunnistettiin Southern blot-analyysillä (Fig. 1b Alempi). Hännän ja ihon kollageenin proteiinianalyysi osoitti, että heterotsygoottisilla mutanttihiirillä tyypin III kollageeni vähenee noin 50%, kun taas tyypin III kollageenia ei havaittu homotsygoottisilla mutanttieläimillä (Kuva. 1C).

Mutanttieläimet olivat hedelmällisiä, mutta vain heterotsygoottiset hiiret olivat fenotyypillisesti normaaleja. Homotsygoottisten mutanttihiirien keskimääräinen elossaololuku oli 5% vieroitusiässä, ja useimmat kuolemat tapahtuivat ensimmäisten 48 tunnin aikana syntymän jälkeen (Taulukko 1). Vastasyntyneiden kuolleisuuden tarkka syy ei ole selvillä, koska kuolleet pennut kannibalisoitiin ennen kuin niitä ehdittiin tutkia, eikä elävistä vastasyntyneistä homotsygooteista mutanteista tehty kevyt mikroskooppinen histologinen analyysi havainnut mitään vakavaa poikkeavuutta. Aikuiset homotsygoottiset mutanttihiiret vaikuttivat normaaleilta, paitsi että ne olivat noin 15% pienempiä kuin villityyppiset pentuetoverinsa samaa sukupuolta (tietoja ei näy). Homotsygoottisten mutanttihiirien keskimääräinen elinikä oli kuitenkin noin 6 kuukautta eli viidesosa normaalista eliniästä. Ruumiinavaus osoitti, että verisuonten repeämä oli suurin syy näiden hiirten eliniän lyhenemiseen (Taulukko 2). Repeämispaikat olivat satunnaisia ja liittyivät useimmiten suuriin verisuoniin. Histokemiallisessa analyysissä etsittiin vikaa, joka aiheutti verisuonen seinämän haurastumisen. Kuva. 2 A ja B näyttävät normaalin vatsa-aortan poikkileikkauksen. Aortan seinämä koostuu intimasta ja mediasta (Kuva. 2A, nuoli)ja adventitia (Kuva. 2 A ja B, nuolenkärjet). Väliaine koostuu elastisista kuiduista (Kuva. 2B, suuret nuolet)ja sileät lihassolut (Kuva. 2B, pienet nuolet) ja tarjoaa elastisuutta aortan kun adventitia koostuu enimmäkseen tyypin I kollageeni fibrillit ja rajoittaa laajentuma aortan. Kuva. 2C näyttää homotsygoottisen mutanttihiiren vatsa-aortan leikkaavan aneurysman poikkileikkauksen. Repeämä ylitti väliaineen (nuoli), mikä johti veren täyttämään kanavaan (tähti) median ja adventitian (nuolenkärjet) välillä ja romahdutti osittain aortan lumenin. Adventitia lopulta repesi muualla, ja verta vuoti vatsakalvon onteloon, kuten ihmisillä, joilla on tappava aortan aneurysma (20). Elastisten kuitujen ja sileiden lihassolujen yleinen järjestely (Kuva. 2D) oli samanlainen kuin kontrolleissa (Kuva. 2b). Solunulkoisen matriisimateriaalin voimakkuus ja jakautuminen sekä tummempi värjäytyminen adventitiassa sekä mutanttihiirten intimassa olevien elastisten kuitujen ja sileiden lihassolujen välillä (Kuva. 2D) olivat verrattavissa villityyppisten kontrollien (Kuva. 2b). Mutanttieläimillä ei havaittu valomikroskoopilla selviä sydänvikoja eikä keskikokoisia eikä pieniä valtimoita (tietoja ei näy).

aneurysman lisäksi mutanttihiirillä todettiin usein suoliston laajenemista ja satunnaista suolen repeämää, joka johti kuolemaan (Taulukko 2). Noin 60%: lla homotsygoottisista mutanttihiiristä esiintyi ihovaurioita, joista vakavin esiintyi avohaavana, jonka pituus oli ≈1 cm olkapään alueella, joka tunkeutui kokonaan ihon läpi ja paljasti ihonalaisen kudoksen (Kuva. 3). Haavat eivät johtuneet eläinten välisestä tappelusta, sillä niitä havaittiin erikseen häkkiin laitetuissa eläimissä. Ihon, suoliston ja muiden sisäelinten, kuten maksan ja keuhkojen, kevyt mikroskooppinen analyysi ei havainnut mutanttieläimillä mitään selvää poikkeavuutta (tietoja ei näy).

mutanttieläinten rakenteellisten vikojen määrittelemiseksi aortan ja sydämen elektronimikroskooppiset analyysit tehtiin. Kuva. 4 osoittaa, että kollageeni fibrillit sijaitsevat sileiden lihassolujen tai sileän lihassolun ja elastisten kuitujen välillä (Kuva. 4A, nuolet) olivat poissa tai vakavasti pienentynyt media mutantti aortta (Kuva. 4B, nuolet). Silmiinpistävintä adventiassa, jossa valtaosa kollageenista on tyyppiä I, mutantti-aortan kollageenifibrillien halkaisija oli hyvin vaihteleva(vertaa Kuva. 4 D-C). Kun fibrillit laskettiin ja näiden fibrillien läpimitta mitattiin adventitian tietyllä alueella, havaitsimme, että mutanttien fibrillien määrä väheni noin kolmannekseen villin tyypin fibrillien määrästä, kun taas mutanttien fibrillien keskimääräinen halkaisija oli noin kaksinkertainen villin tyypin hiiriin verrattuna (Kuva. 5). Samoin kuin aortassa, epikardiumin ja sydänlihaksen väliset kollageenifibrillit vähenivät tai puuttuivat ja epikardiumin mikrovillit olivat alikehittyneitä mutanttihiirten sydämessä (tietoja ei näy).

sydän-ja verisuonijärjestelmän lisäksi mutanttihiirten ihoa, suolistoa, maksaa ja keuhkoja tutkittiin elektronimikroskopialla. Kuten aortan adventitia, mutanttihon kollageeni I fibrillit (Kuva. 4F, nuolet ja nuolenkärjet)olivat epäjärjestelmällisiä ja halkaisijaltaan hyvin vaihtelevia verrattuna villityyppisten hiirten (Kuva. 4 E, nuolet). Tämä muutos havaittiin myös mutanttihiirten maksassa ja keuhkoissa (tietoja ei näy). Lisäksi kollageenifibrillit puuttuivat mutanttisuolten submukosasta ja serosasta tai vähenivät voimakkaasti (tietoja ei näy), mikä viittaa siihen, että kollageenifibrillit näillä alueilla ovat enimmäkseen tyypin III kollageenifibrillejä.

aiemmat tutkimukset, joissa tehtiin kohdennettuja mutaatioita Col1a1 -, Col2a1 -, Col5a2-ja Col9a1-geeneihin, ovat tuoneet tärkeitä tietoja näiden kollageenien (24-27) toiminnasta. Tässä osoitamme, että tyypin III kollageenilla on kriittinen rooli fibrillogeneesissä, joka on tärkeä osa sellaisten elinten kuin sydän-ja verisuonijärjestelmän, suoliston ja ihon kehitystä. Tyypin III kollageenin puute häiritsi fibrillogeneesiä ja johti näiden elinten vialliseen kehitykseen ja toimintahäiriöön. Fysiologisissa olosuhteissa tyypin III kollageeni ei ole vain olennainen osa fibrillejä kudoksissa, kuten aortan väliaineessa, vaan myös tärkeä säätelyelementti tyypin I kollageenin fibrillogeneesissä. Tuloksemme viittaavat siihen, että tyypin III kollageeni säätelee tyypin I kollageenin fibrillien halkaisijaa, joka toimii mekanismina eri kudosten tai kudoksen fysiologisten vaatimusten täyttämiseksi eri kehitysvaiheissa. Tyypin III kollageenipuutoksesta kärsivien hiirten fenotyyppi muistuttaa läheisesti Ehlers–Danlosin oireyhtymän tyypin IV potilaiden kliinisiä oireita, kun potilaat kuolevat verisuonen tai suolen repeämän seurauksena (20). Näiden mutanttihiirien pitäisi siksi osoittautua hyviksi eläinmalleiksi tämän sairauden ymmärtämisessä ja mahdollisesti terapeuttisten lähestymistapojen testaamisessa.