vähimmäistiedot Comet-määrityksen (MIRCA) raportointia varten: suositukset comet-määrityksen menetelmien ja tulosten kuvaamiseksi

HCOMET COST Actionin jäsenet ovat laatineet MIRCA-ohjeet comet-määrityksen tulosten analysoinnin ja raportoinnin parantamiseksi (http://www.hcomet.eu/). Kirjoittajat ovat comet-määrityksen asiantuntijoita, joilla on vähintään kahdeksan vuoden kokemus näistä määrityksistä (15: llä kirjoittajista on >20 vuoden relevantti kokemus). Olemme käyttäneet internetpohjaista kyselylomaketta, johon on koottu tekijöiden mielipiteitä yksityiskohtien raportoinnin tärkeydestä (Taulukko 1; lisätiedot). Kirjoittajat luokittelivat jokaisen tiedon “välttämättömäksi”, “toivottavaksi” tai “ei-tärkeäksi”, ja luokituksissa käytettiin ≥75%: n kongruenssikynnystä. Jos “olennaisten tietojen” vastausten määrä ei saavuttanut 75 prosentin kynnysarvoa, “olennaisten tietojen” ja “toivottavien tietojen” vastaukset yhdistettiin, ja tieto luokiteltiin “toivottavaksi tiedoksi”, jos ≥75 prosenttia vastaajista oli sitä mieltä, että se oli joko “olennaista” tai “toivottavaa”. Taulukossa 1 on selitykset jokaisesta suosituksesta.

erityiset MIRCA-suositukset jokaiselle comet-määrityksen vaiheelle

vaihe 1a: Solujen eristäminen ja yksisolususpensioiden valmistus

koska comet-määrityksessä käytetään yksisolususpensioita, näytteet, joita ei ole saatu yksittäissoluina, on käsiteltävä mekaanisesti tai entsymaattisesti, jotta solujen kiinnittyminen solunulkoiseen matriisiin tai toisiinsa häiriintyy. Kudosten homogenointi mekaanisilla häiriöillä voi itsessään aiheuttaa DNA-vaurioita, kun taas kudoksen entsymaattinen pilkkoutuminen voi johtaa DNA-vaurioiden poistamiseen endogeenisten DNA-korjausentsyymien toiminnan vuoksi tai lisätä DNA-vauriotasoja vapauttamalla nukleaaseja soluista. Homogenisaatiopuskurin koostumus on “toivottava” tieto erityisesti DNA: n eheyden säilyttämiseksi tarvittavien komponenttien (esim.etyleenidiamiinitetraetikkahappo)24,25 osalta. Yksittäissolususpensioiden eristämismenettelyn kuvaus, mukaan lukien kudoksen homogenointi, katsotaan “toivottavaksi” tiedoksi, joka on raportoitava artikkeleissa.

verinäytteitä käytetään usein ihmisen biomonitorointitutkimuksissa. Koska veri edustaa heterogeenistä solupopulaatiota, on julkaisuissa “oleellista” saada yksityiskohtaista tietoa solupopulaatiosta. Tekstissä on kuvattava tarkasti, ovatko näytteet kokoverta (mukaan lukien punasolut), leukosyyttejä, mononukleaarisia verisoluja vai solujen alaryhmää (esim.lymfosyytit). Voi myös olla hyödyllistä sisällyttää tietoa injektiokanyyli -, antikoagulanttityypistä ja myöhemmästä solujen eristämismenetelmästä (ts.sentrifugointi-ja pesuvaiheista) niille, jotka toistavat kokeen, joten tämä on luokiteltu “toivottavaksi” tiedoksi. Tietoja solujen tai kudosten säilytysolosuhteista, jos ne jäädytetään, sekä jäätymismenetelmästä (esim.jäätyminen kuivajäällä tai nestemäisessä typessä tai hidas jäätyminen) ja sulamismenetelmästä pidetään “olennaisina” ilmoitettavina tietoina, koska näiden prosessien on osoitettu vaikuttavan DNA: n migraation perusasteeseen26.

vaihe 1B: Substraattisolujen valmistus in vitro-DNA-korjausmääritystä

varten mitä tahansa eukaryoottista solutyyppiä voidaan käyttää substraattisoluna in vitro-DNA-korjausmääritystä varten, ja solutyyppi ja tiheys ovat “toivottavia” raportoitavia tietoja. On “olennaista” raportoida menetelmä ja genotoksisen yhdisteen tyyppi, jota käytetään aiheuttamaan DNA-vaurioita substraattisoluissa ja myöhemmissä solujen varastointiolosuhteissa, kun taas substraattisoluissa havaittavien DNA-vaurioiden kokonaistaso (esim., formamidopyrimidiinin DNA-glykosylaasille herkkien kohtien määrää soluissa, jotka on käsitelty ro19-8022: lla ja valolla) pidetään vain toivottavana tietona.

vaihe 1c: Määrityskontrollit

tässä artikkelissa määrityskontrolleilla tarkoitetaan näytteitä, jotka sisältyvät jokaiseen comet-määrityskokeeseen; näitä kutsutaan joskus vertailustandardeiksi,sisäisiksi kontrolleiksi tai teknisiksi tarkastuksiksi16, 27. Määrityskontrollit ovat tyypillisesti kryosäilyviä aliquoteja yhdestä soluerästä, joka on altistettu DNA-juostetta rikkovalle aineelle (esim., ionisoiva säteily, vetyperoksidi tai metyylimetaanisulfonaatti) tai hoito, joka aiheuttaa tietyntyyppisen DNA-vaurion (esim.valoherkistäjä Ro19-8022 plus valo, tai kaliumbromaattikäsittely, indusoimaan DNA: n hapettumista). Standardia emäksistä comet-määritystä ja entsyymimuunneltua comet-määritystä varten on olemassa erilaisia määrityskontrolleja. Entsyymimuunnetussa määrityksessä käytettävä yhdiste ei saa aiheuttaa DNA-juosteen katkoksia, koska ne pienentävät entsyymille herkkien kohtien dynaamista aluetta. Biomonitorointitutkimuksissa sekä poikkileikkaus -, interventio-ja kliinisissä tutkimuksissa voidaan käyttää valottamattomia soluja kontrolleina. On “olennaista” ilmoittaa vauriotasot määrityskontrolleissa ja määritysvaihtelut (keskihajonta) sekä standardissa että entsyymimuunnellussa comet-määrityksessä.

in vitro-DNA-korjausmäärityksessä käytetään sisäisiä kokeellisia kontrolleja, joita käytetään myös korjausaktiivisuuden laskennassa, eikä määrityskontrolleja sinänsä. On “olennaista” ilmoittaa nukleoideissa olevien DNA: n korjausleikkausten määrä I) altistumattomissa substraattisoluissa, jotka on inkuboitu reaktiopuskurilla, DNA: n perusvaurion määrittämiseksi substraatin DNA: ssa (eli “taustakontrolli”); ii) altistuneissa soluissa, jotka on inkuboitu reaktiopuskurilla, paljastaakseen vahingoittavalla aineella tehdystä käsittelystä johtuvien epäspesifisten DNA-juosteen katkeamisten tai abasic-kohtien tason (eli “käsittelykontrolli”); iii) altistumattomat substraattisolut, joita inkuboidaan näytteestä saadulla proteiiniuutteella epäspesifisen viilto-tai pilkkoutumisaktiivisuuden tarkastamiseksi (ts. “spesifisyyskontrolli”), ja iv) altistuneet substraattisolut, jotka inkuboidaan leesiospesifisellä entsyymillä, samalla tavalla kuin entsyymimuunnellun comet-testin kontrollit (ts. “inkubaatioreaktiokontrolli”).

vaihe 1D: negatiiviset ja positiiviset kontrollit

tässä artikkelissa negatiiviset ja positiiviset kontrollit viittaavat koeryhmiin, jotka on kuvattu OECD: n ohjeessa (TG 489) eläinkudosten in vivo comet-määrityksestä 18. Näin ollen negatiiviset ja positiiviset kontrollit koskevat koko koetta. Positiivisella kontrollilla tarkoitetaan suoraan tai epäsuoraan vaikuttavaa genotoksista yhdistettä, joka aiheuttaa Comet-määrityksessä havaittuja DNA-juosteen katkoksia tai entsyymisensitiivisiä kohtia. Entsyymimuunnellun comet-määrityksen osalta ei ole saatavilla positiivisten kontrollien luetteloa, joka vastaisi OECD: n luettelemia yhdisteitä positiivisina kontrolleina emäs comet-määrityksessä (DNA-juosteen katkeamisen indusoimiseksi) tietyissä eläinkudoksissa. Positiivista kontrollia ei myöskään ole olemassa ihmisen biomonitorointitutkimuksissa, koska terveitä ihmisiä ei voi tietoisesti altistaa genotoksiselle aineelle. Positiivisia kontrolleja pidetään jo pakollisina geenitoksikologian soluviljelmäkokeissa, ja ne ovat itse asiassa “olennaista” tietoa artikkeleissa comet-määrityksen avulla. Eläinkokeissa käytännön tarkoituksiin comet-tiedot määrityskontrolleista (ts. edellä kohdassa “Vaihe 1C, Määrityskontrollit” mainitut näytteet ovat riittäviä, kun taas todellisista negatiivisista ja positiivisista kontrolleista saatuja tuloksia pidetään vain “toivottavina” tietoina.

Vaihe 2: solujen upottaminen agaroosiin

comet-määritys kehitettiin alun perin käyttämällä kolmea agaroosikerrosta lasilevyillä, joista keskimmäinen kerros sisälsi solut. Agaroosin pintakerros ei kuitenkaan ole välttämätön, ja tietyissä menetelmissä ei käytetä pohjakerrosta (esim.Gelbond-kalvomääritykset). On “toivottavaa” ilmoittaa diatyyppi ja koko (ts., pinta-ala) geelien suhteen, kun geelin reunan lähellä olevien solujen osuus kasvaa geelin koon pienentyessä ja geelin reunassa olevien nukleoidien DNA voi siirtyä eri tavalla kuin nukleoideissa kohti gel22: n keskustaa. Agaroosin lopullinen pitoisuus (johon on upotettu soluja) on “välttämätöntä” ilmoittaa, koska DNA: n siirtyminen riippuu geelin tiheydestä.

Vaihe 3: solujen hajoaminen

comet-määrityksessä on useita menetelmiä solujen lyseyttämiseksi. Lyysiliuoksen koostumusta koskevat tiedot ovat “olennaisia”. Tietyntyyppisille soluille voidaan vaatia ylimääräinen entsyymin inkubaatiovaihe (esim.proteinaasi K: lla), ja inkubaation yksityiskohdat olisi myös ilmoitettava “olennaisina” tietoina. Joidenkin raporttien mukaan lyysin kesto voi vaikuttaa tietyntyyppisten DNA-lesions28,29,30: n stabiiliuteen, joten lyysin kesto ja lyysiliuoksen lämpötila ovat “toivottavia” tietoja raportoitavaksi.

vaihe 4A: Korjausentsyymihoito entsyymimuunnellussa comet-määrityksessä

koska lyysiliuos saattaa estää korjausentsyymin toimintaa, on “suotavaa” määrittää, suoritettiinko lyysivaiheen ja entsyymikäsittelyn välillä pesuvaihe (eli pesupuskurin koostumus, pesujen lukumäärä ja kesto). On “olennaista” välittää tietoa korjausentsyymien lähteestä, koska eri valmistajien entsyymien on osoitettu eroavan toisistaan sekä aktiivisuudeltaan että spesifisyydeltään nukleobaasilesioneja kohtaan 16. Useimmissa komeettatutkimuksissa titrauskäyräkokeita tehdään optimaalisten olosuhteiden tunnistamiseksi entsyymihoidolle31; entsyymititrauskäyrien tuloksia raportoidaan kuitenkin harvoin, ja ne luokitellaan tässä “toivottaviksi” tiedoiksi (viittaus aiempaan tutkimukseen voitaisiin tehdä sen sijaan), vaikka pidämmekin “olennaisena” käsittelyn keston ja lämpötilan raportointia. Geeliin levitetyn entsyymin pitoisuus on “oleellinen” tieto; pitoisuus on parempi ilmoittaa entsyymiyksikköinä (U / ml), vaikka myös proteiinipitoisuus (mg/ml) on hyödyllinen. Inkubointiyksikön tyyppi (esim.inkubaattori, vallihauta tai 12-geelijärjestelmä) ja inkubointitapa ovat “toivottavia” tietoja, jotka on ilmoitettava. On ilmoitettava, onko inkubaatio suoritettu i) entsyymikylvyssä vai pisaralla ja peitinliuskalla, ii) 2-geeliversiossa, 12-geeliversiossa tai monikaivojärjestelmässä vai iii) kostutetussa laatikossa inkubaattorissa, kuumennuslevyllä tai lämmitetyssä liukuhaudassa.

vaihe 4B: Uutteen valmistus ja inkubointi in vitro-DNA-korjausmääritystä

varten on “toivottavaa” ilmoittaa proteiiniuutteiden valmistukseen käytettyjen solujen määrä tai kudoksen massa, kun taas on “olennaista” ilmoittaa substraattiin DNA: han lisättyjen solu-tai kudosuutteiden lopullinen proteiinipitoisuus. Uuttopuskurin koostumus (“toivottavat” tiedot) on vähemmän ratkaiseva kuin inkubaatiopuskurin koostumus (“olennaiset” tiedot), koska viimeksi mainitut voivat vaikuttaa DNA: n siirtymisen taustatasoon. Entsyymimuunnellusta comet-määrityksestä saatujen tietojen mukaisesti on “suotavaa” ilmoittaa tulokset titrauskokeista tai vertailututkimuksista, jotka on saatu samasta laboratoriosta, jossa ne on tehty. Geeliin upotettuihin substraattisoluihin lisätyn uutteen määrä on “toivottavaa” tietoa. On “olennaista” ilmoittaa itämisajan kesto ja lämpötila, koska ne vaikuttavat korjausviiltojen määrään. Entsyymimuunnellun comet-määrityksen osalta inkubointitapa on “toivottava” tieto, joka on raportoitava in vitro-korjausmääritystä varten. Inkubaatioreaktion säätelyssä käytetyn entsyymin tunnistetiedot (ilmoitetaan DNA-vaurioiden määrä substraattisoluissa) ja puskurin koostumus, jota käytetään DNA: n korjausleikkausten taustatasolla valottamattomissa substraattisoluissa, ovat “olennaisia”, koska ne ovat avainasemassa DNA: n korjausleikkausaktiivisuuden luotettavuuden osoittamisessa.

Vaihe 5: emäksinen käsittely

korkean emäksisen pH: n liuos häiritsee vetysidosta, joka pitää DNA-juosteet koossa, ja muuttaa myös tietyt nukleobaasileesiot DNA-juosteen katkoksiksi. Siten emäksisen käsittelyn kesto voi vaikuttaa DNA: n migraation tasoon seuraavissa elektroforeissa32,33,34. Erityiset tiedot emäksisen liuoksen koostumuksesta, pH: sta, lämpötilasta ja käsittelyn kestosta ovat näin ollen “olennaisia” raportoitavia tietoja.

Vaihe 6: elektroforeesi

tärkeimmät DNA: n migraation ajurit ovat elektroforeesi-testin kesto ja sähköinen potentiaali (jännitehäviö elektroforeesi-säiliön alustalla)35. On “olennaista”, että ilmoitetaan elektroforeesipuskurin koostumus, elektroforeesin voimakkuus (jännitegradientti (V/cm) elektroforeesisäiliön alustalla) ja elektroforeesin kesto. Korkea lämpötila elektroforeesin aikana voi vaikuttaa DNA: n migraatioon36; siten tiedot elektroforeesiliuoksen lämpötilasta ovat “olennaisia”, ja tähän voidaan liittää kuvaukset toimenpiteistä, jotka on toteutettu lämpötilan pitämiseksi vakiona (esim.Alustan jäähdyttäminen tai puskurin kiertäminen).

Vaihe 7: Neutralointi

tässä vaiheessa poistetaan ylimääräinen emäksinen liuos levyistä tehokkaan värjäyksen varmistamiseksi. On “toivottavaa” kuvata neutralisaatioliuoksen koostumus.

Vaihe 8: värjäytyminen ja visualisointi

DNA: ta sitovilla väriaineilla on erilaisia sitoutumisvaikutuksia DNA: han,joten ne voivat vaikuttaa kuva-analyysiohjelmiston primaaristen comet-määrityksen kuvaajien laskentaan eri tavoin 36,37, 38. Väriaineen tyyppi on “olennaista” tietoa, kun taas pitoisuus on “toivottavaa” tietoa, kuten on aika värjäyksen ja visualisoinnin välillä. Eri mikroskooppilamppujen valon voimakkuus vaihtelee. Lisäksi se vaihtelee lampun iän ja sen ajan mukaan, jolloin se on ollut päällä komeettojen pisteytyksen aikana. Valon voimakkuuden mittaamiseen ja DNA: n migraation tason korjaamiseen sen mukaisesti ei kuitenkaan ole standardimenetelmää. Lisäksi samalla komeetalla voi näyttää olevan eritasoisia DNA: n siirtymiä eri mikroskoopeissa. Siksi on “suotavaa” ilmoittaa pisteytyksessä käytetty mikroskoopin suurennus. On “suotavaa” näyttää komeettojen edustavia kuvia (esim., kontrolli, jossa migraatiota on vähän tai ei lainkaan, kohtalainen ja laaja DNA-migraatio) raportoitujen DNA-migraatiotasojen rinnalla.

vaihe 9A: pisteytys ja data-analyysi

tämä vaihe edellyttää “olennaisten” tietojen raportointia primaarisessa comet-määrityksen kuvaajassa (esim.. DNA: n prosenttiosuus pyrstössä, pyrstön pituudessa, pyrstön momentissa tai näköpisteessä), niiden komeettojen lukumäärä, jotka analysoidaan näytettä kohti ja miten DNA: n kokonaissiirtymä ilmaistaan (esim.komeetan pisteiden mediaani tai keskiarvo). On “ei tärkeää” ilmoittaa kunkin komeetan yksilöllinen tulos jokaisessa geelissä; ne yhdistetään kokonaisvahinkotason laskemiseksi. Koska ei voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että eri kuvaanalyysiohjelmistopaketeilla voi olla erilaisia tapoja laskea ensisijainen comet-määritys predictor, on “olennaista” ilmoittaa käytetty ohjelmisto (ohjelmiston nimi, valmistaja, versio). Kaikilla ensisijaisilla kuvaajilla on sama rajoitus, jonka mukaan comet-määrityksessä tarvitaan asiantuntemusta, jotta voidaan ymmärtää, mitä ne tarkoittavat, kun taas jos luodaan kalibrointikäyrä (käyttäen ionisoivaa säteilyä, joka aiheuttaa katkoksia tunnetulla taajuudella), tulokset voidaan muuntaa suhteelliseksi vauriotiheydeksi verrattuna muuttumattomiin nukleotideihin tai nukleobaasipareihin.tällaiset tiedot ovat yksiselitteisiä ja välittävät tietoa, jonka kaikki tutkijat voivat ymmärtää 39. Menettely kalibrointikäyrän saamiseksi ionisoivaa säteilyä käyttäen ja DNA: n siirtymätasojen muuntamiseksi muuttumattomiin nukleotideihin tai nukleobaasipareihin nähden on raportoitu aikaisempina40. Näin ollen tulosten ilmoittaminen leesiotasoina 109 muuttumatonta nukleotidia tai 106 nukleobaasiparia kohti on “toivottavaa”.

vaihe 9B: Entsyymiherkkien kohtien tai substraatin DNA: n viiltojen nettoluvun laskeminen in vitro-DNA-korjausmääritystä varten

DNA-korjausentsyymien inkubaatio lisää DNA: n siirtymätasoa, koska sekä DNA-juosteen perusarvot että entsyymispesifiset vauriot vaikuttavat DNA-juosteen katkosten kokonaismäärään. Koska DNA: n siirtymä, jonka katsotaan johtuvan DNA-vaurion perusasteesta ja entsyymispesifisistä vaurioista, voi olla peräisin erilaisista genotoksisuuden mekanismeista, on riittämätöntä ilmoittaa vain DNA-vaurion kokonaistaso entsyymikäsittelyn jälkeen. Sen sijaan on “olennaista” ilmoittaa Genotoksisuus entsyymiherkkinä kohtina, joissa DNA: n siirtymisen perusarvo on vähennetty DNA: n siirtymästä entsyymikäsitellyissä dioissa.

koska in vitro-DNA-korjausmäärityksessä käytetään samoja substraattisoluja kaikkien solu-tai kudosuutenäytteiden kanssa, ei ole tarpeen käyttää samanaikaisia tausta-ja käsittelyvertailuja kullekin näytteelle samassa kokeessa (ts.määrityksessä). Substraatteja voi olla useampia (esim., analysoitaessa sekä emäs-että nukleotidi-poiston korjausaktiivisuutta), ja siksi tarvitaan erilliset kontrollit kullekin DNA-korjausmääritystyypille. On “olennaista” ilmoittaa korjausuutteen aiheuttamat verkkoviillot substraatin DNA: ssa.

vaihe 9C: tulosten tilastollinen analyysi

tilastolliset analyysit ovat “välttämättömiä”. Tilastollisen analyysin tyyppi riippuu tutkimuksen suunnittelusta ja noudattaa geneettisen toksikologian ja biomonitoring41,42 tilastollisen testauksen yleisiä oletuksia.