virtsajärjestelmän tulehduksen ja infektion diagnosointi proteomics

Näytelähteet virtsan proteomitiedon arvioimiseksi virtsan diagnostisia tarkoituksia varten

tässä tutkimuksessa profiloidun 120 virtsanäytteen keruu ei rajoittunut tietyn sairauden diagnosointiin, etenemisen arviointiin tai hoitoon. Virtsa (UA) näytteiden tilasi hoitava lääkäri eri syistä, mukaan lukien akuutti vamma, verenvuoto emättimestä, huimaus/pahoinvointi, hyperlipidemia, tyypin II diabetes ja siihen liittyvät komplikaatiot, vatsakipu/pahoinvointi, määrittelemätön hypertensio, virtsarakon hypertensio, idiopaattinen polyuria, ja epäillään UTI. Koska UTI on erittäin yleinen tartuntatauti, joka liittyy joihinkin edellä mainittuihin kliinisiin oireisiin (esim.vatsakipu/pahoinvointi) ja riskitekijöihin (esim. diabetes), odotimme usein bakteriurian tai UTI: n diagnoosia näistä näytteistä. Proteomiset analyysit rajoittuivat näytteisiin, joissa virtsa-analyysiraportit antoivat alustavaa tukea bakteerien aiheuttamille virtsatietulehduksille (KS.menetelmät). Emme analysoineet virtsanäytteitä tapauksissa, joissa oli saatavilla oireettoman bakteriurian täsmädiagnoosi. Kaikista 120 näytteestä saatiin laajat UA-tiedot. Tähän sisältyi mittatikkutestejä, mikroskooppitutkimuksia virtsasedimenteistä eri solutyypeille ja limalle sekä – 46%: ssa tapauksista – virtsaviljelytietoja. Myös virtsan ulkonäköä koskevat tiedot, kuten sameus, väri ja virtsan pelletin väri ja tilavuus, tarkistettiin. Virtsa-analyysitulosten avulla voitiin vertailla kattavasti tavanomaisia menetelmiä virtsateiden sairauksien diagnosoimiseksi metaproteomisten tutkimusten tietoihin (Lisätiedosto 3: taulukko A3).

neutrofiilit, virtsateiden synnynnäisen immuunivasteen dominoivat efektorit, selittävät monissa näytteissä

Proteomiset tiedot tuottivat vahvaa näyttöä neutrofiilien tärkeästä roolista virtsateiden tulehduksen vaikuttajina ja viestijöinä. Neutrofiilit vapauttavat tuottamistaan sekretorisista rakeista antimikrobisia ja tulehdusmolekyylejä ja tappavat fagolysosomeissa hyökkääviä taudinaiheuttajia fagosytoosin jälkeen. Hierarkkisessa ryhmittelyanalyysissä, joka on optimoitu näytelehtien järjestykselle (hclso), tunnistettiin neljä näyteklusteria, joiden ihmisproteiinipitoisuusprofiilit olivat neutrofiilien hallitsemat (23 tapausta 111: stä; Nad1-klusterit kuvassa 1), ja kaksi ryppästä, joiden neutrofiilispesifiset proteiinimäärät olivat verrattavissa sytoskeletoniin liittyviin määriin (25 tapausta; NAD2-klusterit kuvassa 1). Sytoskeletaaliset proteiinit ilmentyvät voimakkaasti urogenitaalista solua vuoraavissa epiteelisoluissa ja muodostavat suurimman osan virtsan sedimenttiproteomista virtsateiden patofysiologisten olosuhteiden puuttuessa. 35 NAD: n 48: sta klusteriprofiilista osoitti uropatogeenin, mukaan lukien G. vaginalis, tunnistetiedot, mikä viittaa siihen, että pääasiallinen syy tulehdukseen kyseisillä potilailla oli bakteriuria ja immuunivaste tunkeutuvia mikrobeja kohtaan. Syy sidospuun NAD-klustereiden etäisyyksiin oli huomattava vaihtelu tunnistettujen ihmisproteiinien määrässä, joka vaihteli 200-1 500 ID: n välillä näytettä kohti.

hierarkkinen ryhmittely analyysi virtsan pelletti proteomic profiilit 110 näytettä. Hierarkkinen ryhmittely suoritettiin kvantitatiivisille ihmisproteiiniaineistoille käyttäen MAXQUANT-ohjelmiston TPA-menetelmää. Aineistoille tehtiin Pearsonin korrelaatioanalyysi näytelehtien järjestyksen optimoinnilla ja täydellisellä yhdistelyllä MeV-ohjelmistotyökalulla . Poistimme proteiinin runsaslämpökartan UP-näytteiden näkyvästä hierarkkisesta puusta. Vasemmalla puolella olevan paneelin pohja yhdistyy oikealla puolella olevan paneelin yläosaan, koska se liittyy puun linkityksiin. Grafiikan äärioikealla näkyvät näyteklusterin nimet lyhenteineen käsitellään tekstissä yksityiskohtaisesti. Värilliset palkit osoittavat kunkin näyterykelmän tyypin, koon ja sijainnin puussa.

proteomitiedoista saadut Neutrofiiliproteiinipitoisuudet korreloivat hyvin LE-aktiivisuuden ja leukosyyttien määrän

keskeisenä vaikuttimena tässä tutkimuksessa oli selvittää, miten virtsasedimenteistä saadut proteomitiedot verrattiin tavanomaisiin määrityksiin virtsanäytteiden tulehdustasojen määrittämiseksi. Määritimme 35 proteiinin määrät, joiden tiedetään olevan hyvin ilmaistuja aktivoituneissa neutrofiileissa (Lisätiedosto 2: taulukko A2) suhteessa kokonaisproteiinipitoisuuteen kunkin up-näytteen osalta, kuten kuvassa 2 esitetyn kaavion sinisissä palkeissa on esitetty. Ei ole yllättävää, että 85% edellä mainittuihin NAD1-klustereihin kuuluvista tapauksista oli kaavion kohdassa, jossa neutrofiiliproteiinipitoisuus oli yli 30% (vasemmalla puolella). 35 proteiiniin kuului viisi funktionaalista ryhmää: kalsiumia sitovat S100 – perheen proteiinit S100-A8, S100-A9 ja S100-A12, jotka osallistuvat 40-50% neutrofiilien sytosoliproteiinin kokonaispitoisuudesta; neutrofiilirakeista vapautuvat tulehduksen aikana proteiinit, mukaan lukien myeloperoksidaasi (MPO), katepsiini G (CTSG), defensiini-1 (DEFA1), elastaasi (ELAANI), lysosomi (LYZ), laktotransferriini (LTF) ja katelisidiini (CAMP) ; rakeiden muodostumiseen, kauppaan ja fuusioitumiseen fagolysosomien kanssa liittyvät proteiinit, mukaan lukien grankalsiini (GCA), plastin-2 (lcp1), liite A3 (ANXA3), ja tetraspaniini (cd63 antigeeni); proteiineja, jotka vaikuttavat neutrofiilien migraatioon UUDELLEENORGANISOIVAN solunulkoisen matriisin ympäristössä, kuten integriini am/β2, gelatinaasi (mmp9) ja neutrofiilien kollagenaasi (MMP8); ja NADPH-oksidaasi, entsyymi, jolla on useita alayksiköitä, mukaan lukien sytokromi b-245 (CYBA, kuva 3), joka sijaitsee fagosyyttisolujen fagolysosomien kalvossa ja joka on vastuussa oksidatiivisesta purkauksesta, joka tappaa suoraan taudinaiheuttajia. Monet näistä proteiineista, erityisesti defensiini-1, olivat erittäin runsaita näytteissä, joissa oli merkkejä UTI: ista (esim.SA_112 ja PM_20, kuva 3). Bakteeripatogeenit näissä kahdessa tapauksessa olivat S. aureus (SA) ja P. mirabilis (PM), eivätkä ne odottamatta sijainneet vasemmalla puolella kuvan 2 kuviossa ja vierekkäin NAD1-ryppäässä (Kuva 1). Myönnämme, että nämä tiedot kuvastavat neutrofiilien likimääräisiä määriä ottaen huomioon, että uroteelisolut vapauttavat myös proteiineja, kuten defensiini-1, LTF, S100-A8 ja S100-A9. Proteiinilehtien järjestykselle optimoitu hierarkkinen ryhmittelyanalyysi (hclpo) osoitti kuitenkin, että nämä proteiinit ryhmittyivät toisiinsa, mikä tukee käsitystä neutrofiilien hallitsevasta roolista niiden tuotannossa (Lisätiedosto 4: Kuva A1). Eosinofiiliperoksidaasi (EPX) ja eosinofiilinen kationiproteiini (ECP), jotka molemmat ovat myös taudinaiheuttajiin kohdistuvan vasteen vaikuttajia, olivat suuruusluokkaa vähemmän esiintyviä kuin neutrofiilipohjaiset proteiinit, joten eosinofiilien merkittävä rooli tulehdusvasteessa ei tukenut niitä. Makrofagispesifistä migraatiota estävää tekijää (MIF) esiintyi vielä pienempiä määriä, mikä viittaa siihen, että makrofagit puuttuivat lähes kokonaan akuutin immuunivasteen osallistujina patogeenien invaasion jälkeen virtsateissä.

Proteiiniprofiilit, jotka osoittavat neutrofiilien, komplementtijärjestelmän ja punasolujen kvantitatiivisen osuuden virtsan pellettinäytteiden kokonaisproteomiin. Kuvaaja näyttää kolmen biologisen proteiiniluokan yhteenlasketut proteiinipitoisuudet suhteessa kokonaisproteomiin. X-akseli listaa 110 ihmiseen liittyvien UP-näytteiden tunnisteet. Nämä kolme ryhmää edustavat aktivoituneiden neutrofiilien tuottamia proteiineja (sinisiä), punasoluissa voimakkaasti esiintyviä ja verisuonivaurion yhteydessä vapautuvia proteiineja (vihreitä) sekä komplementtijärjestelmän toimintaan ja hyytymiseen liittyviä proteiineja (punaisia). Kaikkien proteiinien kvantifiointiin käytetään iBAQ-menetelmää MaxQuant – ohjelmistotyökalussa. Näytteiden järjestys perustuu neutrofiiliproteiinin runsauteen, joka pienenee vasemmalta oikealle. Jotta tulehduksen arvioinnissa voitaisiin tehdä suoria vertailuja, Le-määrityksen pisteet sisällytettiin jokaisen näytettä edustavan baarin yläpuolelle. X-akselin alla on lisäpalkki, joka kuvaa, mitkä näytteet liittyivät UTI: tä aiheuttavan taudinaiheuttajan ID: hen (oranssit värisegmentit), vastaaviin bakteereihin (vihreät värisegmentit) tai bakteerien tunnisteiden puuttumiseen (ei väriä).

valikoitujen neutrofiiliproteiinien runsaus UP-näytteissä. Kolmetoista äärioikeistolaisessa legendassa lueteltua proteiinia ovat neutrofiilien rakeproteiineja. Kolme muuta proteiinia ovat fibrinogeeni-β (FGB; osallisena koagulaatiossa), hemoglobiini α-alayksikkö (hba1; verisuonivaurion indikatiivi) ja uromoduliini (UMOD; runsaasti terveiden luovuttajien virtsassa). Näytteet SA_112 ja PM_20 edustivat S. aureus (SA) – bakteerin ja P. mirabilis (PM) – bakteerin aiheuttamaa UTI: tä. Lg_23: n (Lactobacillus) profiili osoitti tulehduksen puuttumista ja edusti virtsaputken kolonisaatiota, mahdollisesti myös vähäistä virtsanäytteen emättimen saastumista. Kp_10 (K. pneumoniae) näytti edustavan emätintulehdusta, koska potilaalla diagnosoitiin kliinisesti emätinverenvuoto. Ec_13: n (UPEC) ja kp_55: n proteiiniprofiilit viittasivat tulehduksen lähes puuttumiseen ja siten todennäköisesti virtsaputken kolonisaatioon. Proteiinit kvantifioitiin iBAQ-menetelmällä ja jaettiin kussakin tapauksessa koko Up-proteomin yhteenlasketuilla iBAQ-arvoilla.

nad-pisteet

neutrofiiliproteiinimäärien esitys kuviossa 2 on johdettu nad-pisteistä (neutrofiilien aktivointi ja degranulaatio), jotka on esitetty myös taulukossa (Lisätiedosto 3: taulukko A3). Kuvioon 2 sisältyvät LE-pisteet, jotka vaihtelevat negatiivisesta (N) jäämään (T), 1, 2 ja 3 kunkin näytteen osalta. Kaiken kaikkiaan neutrofiiliproteiinin pitoisuudet ja LE-arvot korreloivat voimakkaasti. LE score mittaa leukosyyttien esteraasiaktiivisuutta, joka todennäköisesti edustaa pääasiassa elastaasia (ELANE) ja myeloblastiinia (PRTN3), kahta neutrofiiliproteaasia, jotka on mitattu kahdeksasta kuvasta 3. Kaikilla kaavion vasemmalla puolella olevilla profiileilla (kuva 2) ja viidelläkymmenelläkolmella niistä 60 näytteestä, joiden neutrofiiliproteiinipitoisuus oli yli 30% (iBAQ), LE-pisteet olivat 2 tai 3. Kahdessakymmenessäyhdeksässä niistä 40 näytteestä, joiden neutrofiiliproteiinipitoisuus oli alle 23% (iBAQ), LE-arvot vaihtelivat negatiivisesta 1: een. Vain neljässä yhdestätoista tapauksesta, joissa LE-pistemäärä oli ≥ 2, mutta neutrofiiliproteiinipitoisuus oli suhteellisen alhainen, mikroskooppinen leukosyyttien määrä oli suurempi kuin 11 solua suuritehoista kenttää (HPF) kohti, kynnys, jota käytetään pyurian määrittämiseen. Kaiken kaikkiaan valkosolujen määrien vertailussa oli hieman vähemmän yksimielisyyttä, kun raja-arvoksi asetettiin 11 solua / HPF ja neutrofiiliproteiinipitoisuus oli yli 30% (iBAQ): 14 tapauksessa 60 tapauksesta määrä oli ≤ 10 (Lisätiedosto 3: Taulukko A3). Yhteenvetona voidaan todeta, että virtsan sedimenttien neutrofiilipitoisuuksien arviointi proteomiikan avulla näyttää olevan vähintään yhtä tarkkaa kuin virtsateiden tulehduksen diagnosoinnissa käytettävä LE-määritys. Se mittaa neutrofiileihin rikastuneiden 35 proteiinin pitoisuuksien summaa ja saattaa olla vähemmän altis väärille positiivisille tuloksille kuin LE-määrityksessä.

erytrosyyttiproteiinipitoisuuden runsaus on diagnostinen indikaattori verisuonivauriolle

virtsateiden Verisuonivaurio, johon tyypillisesti liittyy tulehdus, arvioidaan mittatikkutesteillä hemoglobiinin ja punasolujen mikroskooppisen määrän määrittämiseksi tavanomaisessa virtsa-analyysissä. Kun otetaan huomioon erilaisten proteiinien suuri rikastuminen erytrosyyteissä, pystyimme kehittämään proteomisen lähestymistavan, joka vastaa verivirtsaisuuden tavanomaisia testejä. 32 punasoluproteiinin, mukaan lukien hemoglobiinialayksiköt, band 3 anionikuljetusproteiini, band 7 integraali kalvoproteiini ja hiilihappoanhydraasi-1, yhteenlasketut pitoisuudet suhteessa kokonaisproteiinipitoisuuteen kussakin näytteessä määritettiin kuviossa 2 esitetyn havaintoalan vihreillä palkeilla. Nämä proteiinimäärät on lueteltu ERY-pisteinä (Lisätiedosto 3: taulukko A3) kunkin näytteen osalta. NAD-tai LE-määritystulosten ja ERY-pisteiden välisestä hyvästä korrelaatiosta ei ollut näyttöä, mikä viittaa siihen, että jopa patogeenin toteamistapauksissa (kuvassa 2 olevan havaintoalan alareunassa olevan vaakasuoran palkin värjäytyminen) neutrofiilien tunkeutuminen virtsateihin ei aina aiheuta merkittävää hematuria-ja kudosvauriota. Kun verivirtsaisuuden raja-arvoksi asetettiin mittatikutestissä 2+ ja ERY-pisteissä 4,5%, oli yksimielisyys 81%: ssa kaikista tapauksista. Mikroskooppiset punasolumäärät arvioitiin 21 tapauksessa, joissa tulokset olivat eri mieltä. Käyttämällä yli 10 solua suuritehoista kenttää (HPF) kohden verivirtsaisuuden todisteena havaitsimme, että kahdessa kolmasosassa tapauksista mikroskooppinen analyysi oli sopusoinnussa proteomisten tietojen kanssa. Päätämme, että PROTEOMISET ERY-pisteet antavat hyvän kvantitatiivisen arvion virtsan hematuriasta.

virtsanäytteet, jotka on rikastettu komplementin toimintaan ja hyytymiseen liittyvillä proteiineilla

havaitsimme, että HCLPO-analyysi, jota sovellettiin kaikkiin virtsan proteomiprofiileihin, ryhmitti 21 proteiinia, joilla oli funktionaalinen rooli hyytymisreiteissä ja / tai komplementtijärjestelmässä (Lisätiedosto 4: Kuva A1). Perustelut näihin tulehdusreitteihin liittyvien proteiinipitoisuuksien mittaamiselle yhdessä perustuivat myös raportteihin laajoista toiminnallisista yhteisvaikutuksista . Tunnistimme 42 valkuaisainetta, jotka liittyvät komplementtijärjestelmän toimintaan ja hyytymiseen (CAC), joiden yhteenlasketut pitoisuudet on sisällytetty kunkin UP-näytteen CAC-pisteytykseen (Lisätiedosto 3: taulukko A3). Komplementtijärjestelmä edistää akuutin vaiheen vastetta ja synnynnäistä immuniteettia, ja erilliset komponentit ovat pro – tai anti-inflammatorisia. Keskeinen komponentti on komplementtikomponentti C3. C3 kypsyy opsoniini C3b: ksi ja anafylaktoksiini C3a: ksi ja erittyy veriplasmaan ja virtsateihin munuaistiehyeiden solujen tuotannon jälkeen . C3: lla on merkitystä ylempien virtsateiden infektiossa sekä UPEC: n sisäänotossa ja rauhoittumisessa uroepiteelisoluissa, mikä saattaa liittyä toistuvien virtsatietulehdusten kliiniseen ongelmaan . Vaikka komplementtitoimintaan ja hyytymiseen liittyvät proteiinimäärät eivät olleet yhtä suuria neutrofiiliproteiineja, HCLSO-analyysissä syntyi kaksi näyterykelmää, jotka olivat vierekkäin puussa ja joissa oli yhteensä 12 näytettä, joille oli ominaista suhteellisen suuri määrä tällaisia proteiineja (CAC-klusterit kuvassa 1). CAC-klustereissa havaittiin pieni määrä tapauksia, joissa tunnistettiin taudinaiheuttaja (3 12: sta). CAC-pisteet piirrettiin kuvioon 2, jota kuvaavat kunkin näytteen (sarakkeen) punaiset pylvässegmentit. CAC-proteiinien suuret kokonaismäärät eivät korreloineet hyvin neutrofiiliproteiinien suurten määrien kanssa, mikä viittaa siihen, että komplementtijärjestelmän (esim.C3 ja C4) ja hyytymisen (esim. fibrinogeeni) välittämiä tulehdustoimintoja voidaan säädellä erikseen patogeenin invaasion tai muiden potilaiden virtsateille altistuneiden rasitusten yhteydessä. Suuria CAC – ja ERY-proteiinimääriä havaittiin useammin esiintyvän samanaikaisesti. Monia hyytymis-ja komplementtiproteiineja on todella runsaasti veriplasmassa. Tämä kehon neste vuotaa virtsateiden lumeniin verisuonivaurion yhteydessä. CAC-pistemäärää vastaavia virtsakokeita käytetään harvoin kliinisissä laboratorioissa.

virtsahapon suolojen ja niihin liittyvien virtsan sedimentin proteomiprofiilien saostuminen

12 UP-näytteen silmämääräinen tarkastus CAC-klustereissa osoitti, että yhdeksän virtsanäytettä oli erittäin sameaa ja kymmenen virtsanäytettä suhteellisen suuria ja väriltään vaaleanpunaisesta vaaleanruskeaan. Nämä ominaisuudet ovat liittyneet virtsahapon korkeaan saturaatiotasoon ja virtsahapon suolojen saostumiseen erityisesti alle 6-pH: ssa virtsaan. Virtsahapon saostuminen voi olla virtsakivenmuodostuksen esiaste. On kohtuullista olettaa, että näytteiden samea ulkonäkö vaikutti siihen, että saostumat tunnistettiin mikroskopian aikana virheellisesti bakteereiksi. Munuaiskivien esiintymisestä oli saatavilla vain yksi kliininen tieto (GV_64). Vaikka tämän potilaan proteomiprofiili ei kuulunut CAC-klusteriin, näytteestä löytyi myös sameutta ja vaaleanpunaisesta vaaleanruskeaan vaihteleva virtsan pellettiväri. Oletamme, että valkuaisaineet, joita on suhteellisen runsaasti virtsan liukoisessa fraktiossa, sitoutuvat suolasaostumiin ja siten edistävät eri proteiinien runsautta vastaavissa näytteissä. Itse asiassa valkuaisaineet, jotka yleensä liukenevat virtsaan ja tavallisesti vähäisessä määrin virtsapelletteihin, lisääntyivät runsaasti joissakin CAC-klusterinäytteissä verrattuna kontrolliin, jossa ei ollut merkkejä UTI-ja suolasaostumista (LG_21). Esimerkkejä tällaisista proteiineista ovat IgG-γ-ketju, AMPP (bikunin) ja fibrinogeeni-γ-ketju, kuten kuvassa 4 esitetään. Voimakkaimmin proteiinin defensiini-1 ja hemoglobiinin alayksiköiden HBA1 ja HBD runsaus lisääntyi LG_21: n tietoihin verrattuna. Vaikka useimpien Kuvassa 4 esitettyjen proteiinien tiedetään lisääntyvän virtsassa ja plasmassa paikallisen vamman seurauksena ja vaikuttavan akuutin vaiheen vasteeseen, nämä tiedot osoittivat suurta määrällistä vaihtelua. Patologista merkitystä, erityisesti virtsateiden vammaa, ei voida päätellä näistä tiedoista. Proteomisia profiileja raportoitiin äskettäin virtsakivimatriisille . Kivimatriisissa yleisimmin havaittuja proteiineja olivat IgG: n raskasketjut, fibrinogeenialayksiköt, S100-A8, lysotsyymi C ja LTF, proteiineja myös kuvan 4 kuviossa. Lisätutkimuksia tarvitaan proteomianalyysin arvon arvioimiseksi, jotta voidaan tunnistaa biomarkkerit virtsanäytteistä, jotka sisältävät virtsan suolasaostumia, esim. munuaiskivien muodostumisen riskin arvioimiseksi.

valikoitujen proteiinien runsaus näytteissä, joissa on merkkejä suolan saostumisesta virtsaan. UP-näytteet, jotka alkoivat nm_ (ei mikrobeja), eivät osoittaneet merkkejä bakteerien kolonisaatiosta, mutta virtsasedimenteissä oli visuaalinen ilme, joka viittasi virtsahapon suolasaostumiin ja niitä oli kahdessa CAC-klusterissa. Lg_21 (Lactobacillus) edusti tulehduksen puuttumista. Näytteeseen GV_64 (G. vaginalis) liittyvällä potilaalla todettiin munuaiskiviä. Kuvan 3 legendassa kuvattujen proteiinien lisäksi muita ovat komplementtikomponentti C3 (C3), keruloplasmiini (CP), plasminogeeniaktivaattorin inhibiittori-3 (PAI-3), AMPP (bikunin), hemoglobiini δ-alayksikkö (HBD) ja immunoglobuliini γ-ketju (IG gamma). Kaikki nämä proteiinit osallistuvat akuutin vaiheen vasteeseen, joka tyypillisesti käynnistyy kudosvauriolla ja taudinaiheuttajien invaasiolla. Näyteprofiilit osoittavat proteiinimäärien suurta vaihtelua, joskin erilliset akuutin faasin proteiinit lisääntyivät verrattuna kontrolliin LG_21 joissakin näytteissä.

virtsaputken kolonisaatio, jossa vastaavat bakteerit eivät synnytä isäntäimmuniteettivastetta

hyvin rinnakkaiset DNA-sekvensointitekniikat ovat paljastaneet, että virtsa ei ole täysin steriiliä, ja virtsamikrobiomin käsite on kehittynyt kiinnostavana tutkimusaiheena . On todennäköistä, että varsinkin naisilla virtsaputken ulkoiset osat kolonisoituvat perineaalisista ja vaginaalisista lähteistä peräisin olevilla bakteereilla. On myös selvää, että naispotilaiden puhtaan virtsan suboptimaalinen kerääminen voi johtaa virtsan saastumiseen emätinontelosta peräisin olevilla proteiineilla ja vastaavilla bakteereilla. Tässä esitetyt tiedot voidaan selittää, mutta eivät erota kahta edellä mainittua skenaariota. Noin 25% tässä tutkimuksessa saaduista virtsan proteomiprofiileista on rikastettu proteiineille, joita erittyy virtsaan fysiologisesti normaalissa ympäristössä (esim.uromoduliini ja sytokeratiinit) tai joita tuottavat runsaasti virtsa-ja emätinversoja peittävien limakalvopintojen tuottamat epiteelisolut. HCLSO-analyysissä tunnistettiin neljä klusteria (Kuva 1), yksi suuri klusteri, jossa oli 15 UP-näytettä, jotka oli saatu naispotilailta vain kahta poikkeusta lukuun ottamatta. Profiilit paljastivat runsaasti sytoskeletaaliset proteiinit (esim., α-aktiinit ja annexiinit), desmosomaaliset proteiinit (esim., desmoplakin ja periplakin), ja cornified cell kirjekuoren proteiinit (esim., sytokeratiinit, cornuliini, ja pieni proliinipitoinen proteiini 3). Kahteen ensimmäiseen luokkaan kuuluvia proteiineja esiintyy useimmissa solutyypeissä , mukaan lukien uroteelisolut, kun taas virtsaputken meatuksessa ja emättimen limakalvossa sijaitseva kerrostunut levyepiteeli tuottaa runsaasti kaikista näistä luokista peräisin olevia proteiineja . Mikroskooppinen tutkimus virtsan sedimentit vahvisti lisääntynyt levyepiteelisolujen sisällön pistemäärä ≥ 2 + useimpien näytteiden läsnä neljä klustereita (Lisätiedosto 3: taulukko A3), kutsutaan uromoduliini ja levyepiteelisolujen klustereita emättimen bakteerit (USEV) tästä eteenpäin. Uromoduliini, proteiini, joka vaikuttaa vesi / elektrolyyttitasapainoon virtsateissä, oli myös runsaasti USEV-klusterin näytteissä. Vaginabakteereita (Lactobacillus ja G. vaginalis) tunnistettiin 22 näytteestä 30: stä, ja bakteereita puuttui viidestä näytteestä. Proteomitiedot vahvistivat erittäin alhaisen tulehdustason USEV-klustereissa 74%: ssa tapauksista nad-pisteiden mukaan, mikä ilmenee näytteiden asennoista Kuvan 2 graafissa. USEV-klusterin edustava profiili on LG-23, jossa nad-arvo on 20% ja tulehdukseen liittyviä proteiineja on vähän defensiini-1: tä ja S100A8: aa lukuun ottamatta (kuva 3). SA_112: n ja PM_20: n profiileihin verrattuna kaikki tulehdusta aiheuttavat proteiinit olivat lg_23: ssa vähemmän runsaita. G. vaginalis voi olla opportunistinen patogeeni virtsan ja emättimen tracteissa. Isäntäproteiiniprofiilien ryhmittely USEV-klustereissa, jotka on valittu Lactobacillus -, G. vaginalis-tai molempien lajien tunnisteisiin, osoitti vahvan immuunivasteen puuttumisen näitä bakteerilajeja kohtaan. Toteamme, että proteomisella analyysillä on diagnostinen arvo tarjoamalla todisteita infektion puuttumisesta naisten urogenitaalisessa solussa.

opportunististen patogeenien aiheuttama virtsaputken kolonisaatio

USEV-klustereihin kuului kolme tapausta, joissa todettiin yleisiä virtsateiden patogeenejä, UPEC ja K. pneumoniae. Kahdessa tapauksessa (EC_13 ja KP_55) nad-ja ERY-pisteet olivat alhaiset, mikä oli sopusoinnussa neutrofiilien laukaiseman tulehduksen ja verisuonivaurion puuttumisen kanssa. Kuvassa 3 esitettyjen proteiinien suhteelliset pitoisuudet näissä kahdessa tapauksessa ja niiden samankaltaisuus lg_23: n kanssa tukivat käsitystä, että UTI: lle ominainen immuunivaste ei syntynyt bakteerien kolonisaation yhteydessä. Sitä, onko kyse oireettomasta bakteriuriasta (ASB), ei voida arvioida, koska asb: n molekyylitason immuunivasteita ei tunneta riittävästi. Yhteenvetona, nämä tiedot tukevat käsitystä, että proteomiset profiilit voivat tunnistaa tapauksia virtsaputken kolonisaatio uropatogeenien ilman aktivointi luontainen immuunijärjestelmä.

emättimen kontaminaatio ja urogenitaalitulehduksia

HCLSO-analyysi tuotti UP-näyteklusterin, jota kutsuimme emättimen kontaminaatioksi (VCO), kuvassa 1. VCO-klusteriprofiileissa oli runsaasti sytoskeletaalisia, desmosomaalisia ja reunustettuja solukuoren proteiineja, mutta pieniä tai kohtalaisia uromoduliinimääriä, mikä viittaa siihen, että emättimen proteiinipitoisuus oli lisääntynyt näissä näytteissä. VCO pisteet, kvantitatiivinen suhde viisi proteiineja ilmaistuna cervicovaginal epiteelikudokseen suhteellisen suuri spesifisyys tietokannan mukaan TiGER verrattuna uromoduliini laskettiin. Nämä proteiinit olivat kornifeliini, kornuliini, serpiini B3, galektiini-7 ja proteoglykaani mucin-5B. Neutrofiilispesifisiä proinflammatorisia molekyylejä, kuten proteiinia S100-A12 ja lysotsyymiä (LYZ) sekä verisuonivaurioon viittaavia tai siihen reagoivia proteiineja (hba1 ja fibrinogeeni-β), oli VCO-klusterissa enemmän kuin USEv-klusterissa, kuten kp_10: n ja Lg_23: n välillä Kuvassa 3. VCO-klusterissa oli 14 näytettä, kaikki yhtä lukuun ottamatta naispotilailta, joista puoleen liittyi UROPATOGEENIN tunniste. Viidestä näytteestä tunnistettiin G. vaginalis tai Lactobacillus. Kliiniset todisteet viittasivat kp_10-näytteeseen liittyvään potilaan emätinverenvuotoon, mikä tukee K. pneumoniae-bakteerin urogenitaalisen tai emätininfektion diagnoosia. VCO tulokset sisältyvät Lisätiedostoon 3: taulukko A3. Wilcoxon rank summa testi vertaamalla VCO tulokset VCO ja USEV klustereita tuotti p-arvo 0.017, mikä viittaa siihen, että pisteet on hyödyllistä erottaa ei tai vähäinen suurten emättimen saastuminen virtsanäytteitä. Mitään selkeitä arvioita voidaan tehdä koskien VCO pisteet hyödyllisyyttä erottaa UTI emätintulehdus.

proteomic analysis of urine sediments identified microbes with sensitivity and specificity levels comparable to those of urine culture

we identified bacteries from 76 UP samples, and Candida albicans from one UP sample (63% kaikista analysoiduista tapauksista). Virtsaviljelmiä tehtiin vain 55 tapauksessa, joista 44%: ssa tunnistettiin vähintään yksi taudinaiheuttaja, 24%: ssa vastaavia organismeja ja 17%: ssa ei todettu mikrobikasvustoa (Lisätiedosto 3: taulukko A3). Patogeenien tunnistamisen yhteydessä proteomitiedot ja UC-tulokset eivät aina olleet yhdenmukaisia (Taulukko 1). Erimielisyyksiin vaikuttaa olevan useita syitä. Tunnistettuihin mikrobiproteiineihin perustuvan metaproteomitiedon tulkitsemisen haasteet seuraavat. Ensinnäkin harvinaisempien uropatogeenien proteiinitunnukset saattavat jäädä huomaamatta, koska niiden proteiinisekvenssejä ei löydy haetusta tietokannasta. Tietokannassa edustettuina olevat bakteerilajit tunnistettiin proteomisella analyysillä (K. pneumoniae ja E. faecalis) kahdessa tapauksessa, mutta UC: n tiedot viittasivat fylogeneettisesti läheisiin lajeihin Enterobacter aerogenes ja E. faecium. Toiseksi, mikrobiorganismeja, joita esiintyy vähän virtsassa, on vaikeampi tunnistaa erittäin runsaiden mikrobien läsnä ollessa, varsinkin jos mikrobilajeilla on laaja sekvenssiidentiteetti ortologisten proteiinien joukossa. Ec_85-ja KP_11-profiilit (Lisätiedosto 5: tietokokonaisuus A1) kuvaavat tätä ongelmaa, ja ne koskevat erityisesti Enterobakteereita, jotka aiheuttavat suurimman osan kaikista virtsatietulehduksista. Epätarkkoja genomisia merkintöjä, esim. yhden lajin puuttuvat geenit (esiintyvät UP-näytteessä) johtavat sukulaisen lajin genomissa oikein merkittyjen ortologisten proteiinien tunnistamiseen (mutta puuttuvat UP-näytteestä). Pienet tryptiset peptidit tunnistetaan hauliproteiinianalyysissä, mikä tekee hakualgoritmin virheellisistä proteiinimäärityksistä todennäköisempiä tapauksissa, joissa on erittäin sekvenssinen identiteetti. Kolmanneksi, ID bakteerien läsnä alhainen määrä virtsassa, alle ~ 10000 solua / mL, yhdistettynä korkea isäntä proteomic tausta voidaan hukata, koska isäntä ja mikrobiproteiineja ei erikseen kartoitettu LC-MS / MS. Low PMY laskee bakteerien organismien mukaan UC data osoitti pienempi match rate proteomic IDs kuin korkea PMY laskee (Lisätiedosto 3: taulukko A3). Sen sijaan mikrobien proteomisilla tunnisteilla on se etu, että ne ovat kulttuurista riippumattomia ja että ne antavat tietoa virulenssista, antibioottiresistenssistä, kohdatusta stressistä ja tunnistettujen taudinaiheuttajien kasvutilasta. Näistä kattavista tiedoista on kaksi esimerkkiä (Lisätiedosto 5: tietokokonaisuus A1). Yhdessä aineistossa (EC_85) profiloitiin upecin, G. vaginalisin ja lactobacilluksen proteiinit. Toisessa aineistossa (KP_11) Utin aiheuttaja oli K. pneumoniae. Taulukossa 1 esitetään yhteenveto nitriittitestin vertailusta, jossa enterobakteerit tunnistetaan virtsasta nitraattien vähentämiskyvyn perusteella, ja UC-tulosten vertailusta proteomitiedon kanssa. 90% positiivisista nitriittitesteistä koski bakteriuriatapauksia, joissa aiheuttajana oli UPEC tai K. pneumoniae, ja ne tunnistettiin poikkeuksetta myös proteomisilla ja UC-menetelmillä. Proteomianalyysistä poiketen nitriittitestit eivät näyttäneet olevan riittävän herkkiä enterobakteerien tunnistamiseen kymmenessä tapauksessa. Nitriittitestit eivät olleet positiivisia 21 tapauksessa, joissa PROTEOMISTEN analyysien tunniste oli G. vaginalis. Proteomisten ja UC-menetelmien kautta saatujen taudinaiheuttajatunnisteiden eroista β-hemolyyttiset streptokokit tunnistettiin UC-kokeissa kolmessa tapauksessa, kun taas proteomiset tiedot viittasivat G. vaginalis-bakteerin esiintymiseen. Kuten taulukosta 1 ilmenee, UPEC: n ja vähemmässä määrin K. pneumoniae: n vastaavien tunnusten määrä oli suuri. Yhteenvetona voidaan todeta, että proteominenmenetelmä osoitti suurempaa herkkyyttä kuin nitriittitesti ja UC: hen verrattavia herkkyys-ja spesifisyystasoja. Korkea isäntäproteomitausta virtsanäytteessä vähentää mikrobien tunnistusherkkyyttä.