Frontiers in Genetics

Le test de comète alcaline (électrophorèse sur gel monocellulaire) est la méthode la plus utilisée pour mesurer les dommages à l’ADN dans les cellules eucaryotes (Neri et al., 2015). Il détecte les ruptures de brins (SBs) et les sites labiles alcalins à des fréquences de quelques centaines à plusieurs milliers de ruptures par cellule – une gamme biologiquement utile, allant des faibles niveaux de dommages endogènes à l’étendue des dommages pouvant être infligés expérimentalement sans tuer les cellules. La digestion des nucléoïdes, après lyse, avec certaines endonucléases de réparation spécifiques à la lésion permet de mesurer des dommages autres que les SBs; notamment, la formamidopyrimidine ADN glycosylase (FPG) a été largement utilisée pour détecter les purines altérées, qui sont converties en cassures par l’enzyme. Récemment, (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) ont mis au point un test de comète bidimensionnelle à deux queues (TT-comet) qui peut différencier les ruptures d’ADN simple brin (SSB) et double brin (DSB) dans les mêmes comètes dans le sperme.

Depuis le premier rapport d’Ostling et Johanson (1984), le test de la comète a été largement utilisé dans les tests de génotoxicité de produits chimiques, dans des modèles in vitro et in vivo. Un avantage avec ce dernier est que les cellules de divers tissus peuvent être étudiées, dans une grande variété d’organismes eucaryotes. Au cours des 15 dernières années, le test comet a été largement utilisé chez Drosophila melanogaster pour tester la génotoxicité des produits chimiques (Gaivão et Sierra, 2014). Cette approche est très utile car Drosophila melanogaster est un modèle précieux pour toutes sortes de processus liés à la santé humaine, y compris les réponses aux dommages à l’ADN.

L’utilisation de plantes ainsi que d’un large éventail d’espèces terrestres et aquatiques dans le test des comètes a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie (Costa et al., 2014; de Lapuente et coll., 2015; Santos et coll., 2015), en particulier dans l’évaluation des risques environnementaux (EER). Une étude de validation récente a indiqué que le test de comète in vitro combiné au FPG pourrait constituer une source de preuve complémentaire efficace dans l’ERA, même dans des scénarios naturels particulièrement difficiles tels que les environnements estuariens (Costa et al., 2014).

Au cours de la dernière décennie, la production et l’utilisation de matériaux de taille nanométrique ont considérablement augmenté, ce qui a entraîné une exposition humaine à ces types de matériaux. Identifier et comprendre les dangers des nanomatériaux (NM) par rapport à la santé humaine n’est pas une mince affaire. Non seulement la composition chimique des nanomatériaux est responsable de leur génotoxicité, mais la forme, la surface spécifique, la taille, la distribution de la taille et le potentiel zêta déterminent également les effets de ces matériaux sur le génome. Bien qu’il existe encore un débat sur l’adéquation des tests de génotoxicité standard pour étudier les effets des NMs, jusqu’à présent, la méthode la plus utilisée en nanogénotoxicologie, grâce à sa robustesse, sa polyvalence et sa fiabilité, a été le test de la comète (Azqueta et Dusinska, 2015). En plus d’étudier la génotoxicité des radiations et de divers produits chimiques, le test de comète végétale a récemment également été utilisé pour étudier l’impact génotoxique des NPs (Santos et al., 2015).

Une autre application du test comet est un outil expérimental précieux pour la biosurveillance humaine ainsi que dans les études cliniques. La collecte de sang ou de tissus n’est pas toujours possible chez tous les sujets humains, et d’autres sources de cellules qui peuvent être collectées de manière non invasive ont été testées avec le test comet; par exemple, divers types de cellules épithéliales (Rojas et al., 2014) ainsi que du sperme (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et coll., 2015).

Parallèlement au développement du test comet pour la mesure des dommages à l’ADN, des tests de réparation de l’ADN — un élément essentiel de la réponse cellulaire génotoxique — ont été développés. L’approche la plus simple pour mesurer la réparation de l’ADN consiste à traiter les cellules avec un agent dommageable pour l’ADN, puis à les incuber pour permettre à la réparation de se poursuivre, en mesurant la quantité de dommages restants à intervalles réguliers. Une autre approche biochimique pour évaluer la capacité de réparation a été décrite en 1994 (Collins et al., 1994), et depuis lors, diverses versions modifiées de l’essai pour mesurer à la fois la réparation par excision de base (BER) et la réparation par excision de nucléotides (NER) ont été publiées (revues par Azqueta et al., 2014). Cette approche biochimique a été appliquée pour étudier les effets de l’environnement, de la nutrition, du mode de vie et de l’occupation sur la capacité de réparation de l’ADN, en plus des études cliniques (Azqueta et al., 2014).

Cette approche alternative in vitro de la réparation de l’ADN évalue l’activité de réparation d’un extrait cellulaire sur un substrat d’ADN contenant des lésions définies. Le test comet est utilisé pour suivre l’accumulation de cassures d’ADN (intermédiaires de réparation) avec le temps d’incubation. Récemment, Slyskova et ses collègues ont été les premiers à appliquer les tests de réparation de l’ADN in vitro pour le BER et le NER avec succès sur des échantillons de tissus humains; en particulier, des biopsies de carcinome colorectal (Slyskova et al., 2012, 2014).

Un autre type de test de réparation de l’ADN, permettant aux cellules incorporées dans le gel de se réparer avant la lyse, a récemment été adopté pour étudier plus en détail la cinétique de réparation de l’ADN; plus précisément, étudier la régulation des protéines BER par des modifications post-transcriptionnelles (Nickson et Parsons, 2014). Une autre façon d’étudier la réparation de l’ADN, au niveau de gènes spécifiques, est la technique comet-FISH, qui utilise des sondes d’ADN marquées par fluorescence qui s’hybrideront à l’ADN monocaténaire de la queue de la comète. McAllister et coll. (2014) ont utilisé cette méthode pour étudier la réparation préférentielle des ruptures de brins dans l’ADN en vrac ainsi que dans des régions sélectionnées avec des gènes activement transcrits.

L’étude de la cinétique de réparation des dommages induits aidera à comprendre les réponses cellulaires aux produits chimiques génotoxiques. De plus, l’importance de la réparation de l’ADN en tant qu’acteur du processus (anti)cancérogène peut être élucidée en examinant la réparation au niveau de tissus cibles spécifiques du cancer. La régulation de la réparation — et d’autres aspects de la réponse cellulaire aux composés génotoxiques — impliquera probablement des mécanismes épigénétiques et le test comet a été adopté avec succès pour mesurer les changements dans le schéma global de méthylation de l’ADN dans des cellules individuelles dans diverses conditions de croissance (Lewies et al., 2014).

Le pourcentage d’ADN de la queue est recommandé comme meilleur descripteur des fréquences de cassure de l’ADN, car les comètes mentionnées — et l’étendue des dommages — peuvent facilement être visualisées. Cependant, de nombreux chercheurs préfèrent toujours l’utilisation du moment de queue (Møller et al., 2014). En fait, les deux descripteurs sont également influencés par les conditions d’essai (Azqueta et al., 2011; Ersson et Möller, 2011).

La variabilité du dosage des comètes est une question importante, qu’elle résulte de l’utilisation de différents protocoles, ou de variations expérimentales incontrôlables ou aléatoires. L’inclusion d’étalons de référence dans toutes les expériences est recommandée, en particulier lorsqu’un grand nombre d’échantillons — provenant d’un essai de biosurveillance, par exemple — sont analysés à différentes occasions. Les étalons de référence sont des cellules avec une quantité connue de dommages à l’ADN; soit des cellules non traitées (témoin négatif), des cellules exposées aux rayons X (témoin positif), soit des cellules traitées avec un photosensibilisateur plus lumière (témoin positif pour les dosages comprenant l’incubation FPG), préparées par lots et congelées sous forme d’aliquotes. Si les étalons varient considérablement au cours d’une série d’expériences, les résultats des échantillons peuvent être normalisés (Collins et al., 2014). Si des étalons de référence sont échangés entre laboratoires, les résultats de ces laboratoires peuvent plus facilement être comparés.

Les cellules standard de référence sont normalement placées dans des gels en parallèle aux gels d’échantillons. Normes internes – c.-à-d., cellules standard dans le même gel que les cellules échantillons – serait idéal; mais il est bien sûr essentiel de pouvoir distinguer les deux types de cellules. Des cellules de poissons dont la taille du génome est plus ou moins grande que celle des cellules humaines ont été adoptées avec succès à cette fin (Brunborg et al., 2015). Ces cellules de référence peuvent être utilisées en combinaison avec une courbe étalon ou d’étalonnage (établie avec des cellules recevant différentes doses de rayonnements ionisants), permettant une quantification plus précise des lésions de l’ADN exprimées en fréquence de rupture de l’ADN plutôt qu’en % de l’ADN de la queue.

Les statistiques sont un outil important dans toutes les applications du test de comète, pour vérifier si de petites différences se produisent par hasard. Des descriptions concises de l’analyse statistique et des recommandations pour les tests ont été publiées (Lovell et al., 1999; Lovell et Omori, 2008). Møller et Loft (2014) nous rappellent que pour que l’analyse statistique du test de la comète reste simple, une conception d’étude appropriée et une puissance statistique doivent être soigneusement prises en compte lors de la planification des expériences.

Comme pour tous les tests biologiques, l’intégration des données est cruciale pour interpréter les résultats de l’analyse de la comète dans l’ensemble. L’intégration des informations fournies par le test comet avec d’autres indicateurs de dommages à l’ADN et des réponses cellulaires (par exemple, stress oxydatif, division cellulaire ou mort cellulaire) a été appliquée à la fois dans ERA (Costa et al., 2014; Santos et coll., 2015) ainsi que des études humaines (biosurveillance) (p. ex., Langie et al., 2010; Slyskova et coll., 2012). L’inclusion également de données “omiques” aidera à démêler le mode d’action des composés génotoxiques (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et coll., 2015) – bien qu’il soit intéressant de souligner que plusieurs études ont montré que les mesures phénotypiques de la réparation de l’ADN ne sont pas nécessairement corrélées avec les données génomiques ou transcriptomiques (Collins et al., 2012; Slyskova et coll., 2012, 2014); les différentes approches doivent être considérées comme complémentaires.

Même après trois décennies de développement et de modification, le test comet reste un test assez simple, polyvalent mais nécessitant beaucoup de travail. Diverses modifications à haut débit de l’essai ont récemment été examinées (Brunborg et al., 2014). Les applications in vivo et in vitro tireraient un grand avantage de nouvelles améliorations de l’efficacité, de la normalisation du protocole et du débit. L’automatisation et la miniaturisation sont des stratégies courantes dans de nombreux domaines de la biologie, permettant des changements d’ordre de grandeur dans le nombre d’échantillons analysés par expérience, réduisant les biais subjectifs et améliorant la reproductibilité.

Alors – que pouvons-nous espérer dans les 30 prochaines années ? Acceptation du test in vitro des comètes pour les tests de génotoxicité, notation automatisée peu coûteuse des comètes pour éviter aux chercheurs une visualisation interminable au microscope, normalisation des protocoles (peut-être) et normes de référence internes fiables, plus d’études de biosurveillance humaine de la réparation de l’ADN (en acceptant que les tests phénotypiques occupent une place importante aux côtés de la génomique et de la transcriptomique), surveillance de l’environnement utilisant une variété d’espèces animales et végétales; et bien d’autres développements et applications imprévisibles.

Déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières pouvant être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous tenons à remercier tous les auteurs ainsi que les réviseurs et les éditeurs qui ont contribué à ce sujet de recherche Frontiers. SL est bénéficiaire d’une bourse post-doctorale du Fonds AXA pour la Recherche et du Prix Scientifique Innovant Cefic-LRI 2013. AA remercie le Ministerio de Economía y Competitividad (programme “Ramón y Cajal “, 2013) du gouvernement espagnol pour son soutien personnel.