Mutants promoteurs du CMV avec une propension réduite à la perte de productivité dans les cellules CHO

Afin de surveiller les effets des sites CpG sujets à la méthylation à partir de l’activateur, de la région proximale et du promoteur central, nous avons choisi d’étudier non seulement C-179 mais également les cytosines aux positions -508 (C-508) et -41 (C-41). Aucun des sites de CpG sélectionnés ne chevauche les sites connus de liaison aux facteurs de transcription chez les espèces de Cricetidae. Afin de maintenir la teneur globale en GC, nous avons effectué des transversions de C à G (Fig. 1 bis). Outre C-41, C-13 est la deuxième cytosine dans la région du promoteur central qui semble être fréquemment méthylée. Parce que la mutation de C-13 en G créerait un nouveau site CpG, nous avons préféré étudier C-41G. Les variantes promotrices mutées ont été abrégées avec un code à trois lettres, par exemple la variante GCC a de la guanine au lieu de la cytosine à la position -508, alors que les bases cytosines à -179 et -41 sont préservées. CCC est le hCMV-MIE témoin non muté (Fig. 1 bis). Des promoteurs mutés ou natifs ont été introduits dans divers plasmides et placés en amont de différents gènes rapporteurs.

Afin de voir si les mutations affectent la force du promoteur, nous avons effectué deux expériences indépendantes en transfectant transitoirement des plasmides rapporteurs exprimant la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) dans des cellules CHO-K1 et avons examiné l’expression de SEAP cinq jours après la transfection. Le promoteur non muté a été utilisé comme référence (Fig. 1b). L’expression de SEAP des promoteurs GGG, GCG et CGC était constamment inférieure d’environ 20 % à celle du promoteur non muté, avec une variation mineure entre les expériences répliquées. En général, les mutations de C à G ont montré une tendance à une force promotrice modestement réduite, ce qui semblait toutefois acceptable.

Ensuite, nous avons demandé si les variantes du promoteur hCMV-MIE influencent la stabilité d’expression des cellules CHO transfectées en permanence pendant la culture à long terme. Pour cela, nous avons choisi un rapporteur eGFP qui permet l’analyse cytométrique de l’expression du gène rapporteur au niveau de la cellule unique. Des plasmides rapporteurs eGFP ont été transfectés dans des cellules CHO-K1 et trois à quatre pools indépendants de cellules transfectées en permanence ont été sélectionnés avec du méthotrexate (MTX). Ceux-ci ont été cultivés pendant trois mois en présence de l’agent de sélection MTX. Trente-quatre et quatre-vingt-sept jours après la transfection, l’expression de l’eGFP a été mesurée par cytométrie (deux pools ont été perdus entre les jours 34 et 87 en raison de la contamination). Les moyennes géométriques de l’intensité de fluorescence de 10 000 événements par mesure ont été calculées pour chaque pool de cellules et tracées pour les deux points temporels (Fig. 1c). Trente-quatre jours après la transfection, il y avait peu de différence entre les constructions. Un seul groupe de CCG présentait des niveaux d’expression élevés. Quatre-vingt-sept jours après la transfection, deux pools sur quatre transfectés avec la CCG et deux pools sur trois transfectés avec la GCC affichaient des valeurs eGFP nettement plus élevées que tous les autres pools, transfectés soit avec le contrôle non muté, soit avec les variantes de promoteur restantes. Ces observations ont suggéré un effet stabilisant des mutations C-41G ou C-179G uniques sur l’expression de l’eGFP. Afin de consolider ce résultat, nous avons répété l’expérience avec les deux variantes de promoteurs et avec un plus grand nombre de pools. Nous avons généré dix piscines avec CCG ou CCC, respectivement et huit piscines avec CGC (deux piscines ont été perdues en raison de la contamination). Les cellules ont été cultivées comme précédemment et analysées par cytométrie en flux du jour 42 au jour 69 après transfection (Fig. 1d et Fig. supplémentaires. S1 en ligne). Après 42 jours, l’expression eGFP a été fortement augmentée dans quatre pools de GCC par rapport aux pools de contrôle CCC, tandis que deux pools de GCC ont montré une augmentation modérée de l’expression eGFP (Fig. 1d, panneau de gauche). Après 69 jours, trois groupes de GCC affichaient encore des niveaux élevés de PFEG, alors que l’expression de PFEG des groupes de la CCG était tombée à des niveaux de contrôle CCC (Fig. 1d, panneau de droite). Les différences entre les groupes ont été testées à chaque moment avec le test Steel-Dwass non paramétrique. Le niveau alpha a été fixé à 0,05. Une différence significative a été observée entre la GCC et la CCC au jour 56 après la transfection (p = 0,0305; voir la Fig. S1 en ligne). Pris ensemble, les résultats de la Fig. 1c, d a suggéré que les deux mutations C-41G et C-179G peuvent retarder la perte de l’expression génique recombinante entraînée par le VHC-MIE.

Les mutations C-41G et C-179G inhibent complètement la méthylation de l’ADN au site respectif car la guanine ne peut pas être méthylée. Nous nous sommes demandé si ces mutations affectaient également les niveaux de méthylation d’autres sites de CpG au sein du HCMV-MIE. Par conséquent, nous avons mesuré les niveaux de méthylation de tous les sites CpG dans les variantes individuelles de hCMV-MIE par conversion de bisulfite couplée à un séquençage de prochaine génération. À cette fin, nous avons extrait l’ADN génomique des pools cellulaires de la deuxième expérience 42 et 69 jours après la transfection et l’avons traité avec du bisulfite pour discriminer la cytosine méthylée et non méthylée. L’ADN du hCMV-MIE a été amplifié et séquencé avec le système Illumina MiSeq (Fig. 1e). Le C-179 a été le plus fortement méthylé dans tous les bassins transfectés avec CCC ou CCG, confirmant les observations précédentes avec le hCMV-MIE12 non muté. De plus, nous avons observé un schéma de méthylation distinct qui était très similaire avec tous les pools mais différait en intensité globale. En particulier, les sites C-508 et C-41 non mutés figuraient systématiquement parmi les sites les plus fréquemment méthylés. La mutation de C-41 dans le variant promoteur CCG, en particulier la mutation de C-179 dans le variant CGC, semble diminuer uniformément la méthylation de tous les sites CpG plutôt que de modifier le schéma de méthylation. Lorsque nous avons calculé les niveaux moyens de méthylation sur tous les sites CpG pour chaque pool, nous avons détecté une méthylation globale plus faible avec les variants de promoteurs mutés (voir la Fig. S2 en ligne). La différence était plus prononcée avec la variante CGC, mais n’atteignait pas de signification statistique avec le test Steel-Dwass (α = 0,05). En moyenne, la méthylation a augmenté avec le temps avec toutes les constructions.

Outre le silençage du promoteur épigénétique, la perte de copies du transgène est une cause majeure d’instabilité de la production dans les cellules recombinantes20. Afin d’estimer la contribution relative, nous avons mesuré le nombre de copies de plasmides par qPCR 42 et 69 jours après la transfection. Le nombre moyen de copies de plasmides a diminué avec le temps, sans différence évidente entre les constructions (voir Fig. S2 en ligne). Fait intéressant, la distribution des numéros de copie a été déplacée vers des valeurs inférieures dans le groupe de la CCG. Cependant, lorsque nous avons testé la signification statistique avec le test Steel-Dwass, les différences entre les constructions ne se sont pas révélées significatives (α = 0,05).

Les pools de cellules transfectées en permanence sont des mélanges très hétérogènes de clones dont l’expression du transgène et le taux de croissance diffèrent. Les clones hautement productifs ont tendance à avoir un taux de croissance plus bas21. Par conséquent, les cellules à faible production, dont beaucoup sont présentes dans la culture après transfection, envahissent presque inévitablement tôt ou tard les producteurs élevés. Afin de minimiser ce biais, nous avons étudié les mutations C-179G et C-41G dans les lignées cellulaires clonales. Comme nous voulions évaluer les effets sur la production d’un produit commercial potentiel, nous sommes passés à une protéine de fusion IgG-IL2 en tant que reporter. Ainsi, des variants promoteurs contenant les deux mutations soit seuls (CGC ou CCG), soit en combinaison (CGG) ont été insérés en amont de la chaîne légère et du gène de la chaîne lourde d’un plasmide d’expression d’IgG-IL2.

Des plasmides d’expression portant CCG, CGC, CGG ou le HCMV-MIE non muté ont été transfectés dans des cellules CHO-K1 et des clones transfectés de manière stable ont été isolés dans des plaques à 384 puits. Trente lignées cellulaires clonales par construction ont été sélectionnées au hasard et étendues en plaques à six puits. Après une croissance stable des lignées cellulaires, nous avons étudié leur productivité pendant environ deux mois, du jour 68 au jour 134 après la transfection. Certaines lignées cellulaires ont été perdues en raison d’une contamination ou d’une viabilité réduite, mais 23 à 29 clones par construction ont été examinés sur toute la période.

Pendant toute l’étude, nous avons déterminé les concentrations d’IgG-IL2 dans les surnageants de culture cellulaire et la productivité par cellule et par jour (qP de productivité spécifique). Au début (jour 68) et à la fin (jour 134) de l’étude, les lignées cellulaires transfectées avec la CCG présentaient des titres significativement plus élevés que les transfectants témoins (α = 0,05; Fig. 2 bis). Des lignées cellulaires avec des titres remarquablement élevés ont également été observées chez les transfectants CGG au jour 68 et chez les transfectants CCG et CGG au jour 134. Lorsque nous avons comparé des productivités spécifiques entre des lignées cellulaires transfectées avec des constructions différentes, nous avons fait des observations similaires (Fig. 2b). Afin de compenser l’imprécision dans le comptage cellulaire, nous avons fait la moyenne des productivités spécifiques qP de deux passages au début (jour 68-71 et 83-86 après transfection représentant les premiers points de données disponibles) et de trois passages à la fin de la culture à long terme (jour 124-127, jour 127-131 et jour 131-134 après transfection). Des différences significatives entre les lignées cellulaires transfectées avec CGC ou CCC ont été observées à la fin de la culture à long terme (α = 0,05).

Des titres plus élevés et des productivités spécifiques de lignées cellulaires porteuses de G-179 ou de G-41 suggèrent un effet stabilisant de ces mutations sur l’expression génique pilotée par le VHC-MIE. Afin de documenter cet effet, nous avons calculé le pourcentage d’altération de la qP pendant la culture à long terme pour chaque lignée cellulaire individuelle comme mesure la plus appropriée de sa stabilité de production (Fig. 2c). Bien sûr, cela n’était réalisable qu’avec des lignées cellulaires produisant encore de l’IgG-IL2 au jour 68 après la transfection. Un transfectant témoin a augmenté sa productivité spécifique de 500 % et a été identifié comme une valeur aberrante par l’analyse des valeurs aberrantes de jackknife (Fig. 2c, tracé à gauche). Par conséquent, cette lignée cellulaire a été exclue d’une analyse plus approfondie (Fig. 2c, tracé à droite). Les lignées cellulaires transfectées avec CGC ou CCG étaient significativement plus stables que les lignées cellulaires témoins transfectées avec CCC (α = 0,05). Étonnamment, le CGG double mutant ne différait pas du contrôle.

Published by admin

Laisser un commentaire Annuler la réponse