Test de libération de chrome: La méthode classique de test des lymphocytes T cytotoxiques

Il existe plusieurs méthodes que vous pouvez utiliser pour voir si vos lymphocytes T sont cytotoxiques, mais un test de libération de chrome utilisant du 51chromium radioactif (51Cr) est l’un des plus anciens. Il donne de bons résultats et est idéal pour les laboratoires qui ne peuvent pas se permettre ou qui n’ont pas de cytométrie en flux facilement disponible.

Ici, je vais décrire une méthode simple pour tester la fonction de destruction des lymphocytes T à l’aide de 51Cr. Mais avant de commencer votre analyse, assurez-vous de lire les mesures de sécurité appropriées lors de la manipulation de matières radioactives.

Choisissez votre Cible et vos effecteurs

Pour effectuer un test de libération de chrome, vous incubez d’abord vos cellules cibles (T) avec 51Cr. Vous incubez ensuite les cellules cibles avec des cellules effectrices (vos cellules T; E). Si les cellules effectrices tuent les cibles, elles libéreront le 51Cr, que vous détecterez avec un compteur gamma.

Les cibles et effecteurs que vous utilisez dépendent entièrement de votre application. Vos cellules cibles sont ce contre quoi vous testez la fonction des cellules T. Vous voudrez peut-être tuer votre cible (mesurer la cytotoxicité) ou vous pourriez chercher à voir si les lymphocytes T sont tolérants (comme tester les cellules fabriquées avant d’entrer chez un patient pour plus de sécurité!). Vos cellules T effectrices peuvent également provenir de différentes sources. Par exemple, vous pouvez utiliser des lignées de cellules T fabriquées ou des cellules T fraîchement isolées d’un animal.

Obtenons Radioactifs

Une fois que vous avez rassemblé vos cibles et effecteurs, il est temps de cuisiner.

1. Comptez vos cellules. Vous pouvez utiliser un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique. Le nombre de cellules dont vous avez besoin dépend du nombre de conditions et du nombre de répliques de chaque condition que vous faites. En règle générale, j’exécute mes tests en trois exemplaires et j’ai quatre rapports (5:1, 10:1, 20:1 et 40:1 E:T). Aliquotez vos cellules cibles (dans mon cas 500 000 – environ 25 000 par puits) dans des tubes coniques de 15 ml, en gardant chaque condition expérimentale séparée! Assurez-vous de suspendre vos cellules dans un petit volume afin qu’elles aient la chance d’entrer en contact avec le chrome.

1. Ajoutez le 51Cr (environ 50 µCi) et incubez vos cibles avec le chrome pendant une heure. Feuilletez les tubes environ toutes les 20 minutes pour augmenter les possibilités pour les cellules d’absorber le chrome.

1. Pendant que vous couvrez ….Cette longue incubation est le moment idéal pour mettre en place vos cellules effectrices. Lavez les lymphocytes T deux fois avec du PBS pour éliminer l’excès de cytokines qui pourrait fausser vos résultats. Puis remettez-les en suspension dans le support approprié.

1. Une fois les lavages terminés, vous êtes prêt à poser vos effecteurs sur l’assiette ! J’utilise généralement une plaque à 96 puits car les volumes sont plutôt petits. Plaquez les effecteurs dans différents rapports aux cibles pour déterminer le seuil de mise à mort. J’exécute généralement le test en triplicats, mais cela dépend du nombre de cellules dont vous disposez. Les rapports 40, 20, 10 et 5 à 1 (Effecteurs sur cibles) sont un bon modèle si vous avez suffisamment de cellules disponibles.

En plus de ces tests, configurez deux conditions de contrôle:

• un contrôle de libération spontanée contenant uniquement des cellules cibles (essentiellement un contrôle négatif car il ne devrait pas y avoir de mise à mort sans les effecteurs) et
• un contrôle de libération maximale dans lequel vous lysez les cellules cibles (un contrôle positif qui indique la quantité maximale de chrome absorbée par les cellules).

1. Revenons à ces cellules ciblesOnce Une fois que vos cellules cibles ont fini d’incuber, lavez-les trois fois avec du milieu de culture cellulaire pour éliminer l’excès de chrome. Essorez délicatement les cellules à 400g pendant 5 min pour chacun de ces lavages. Décanter le surnageant dans un récipient à déchets qui peut être transféré dans une zone de décomposition sûre plutôt que d’essayer de le pipeter. Cela aidera à réduire la contamination possible puisque vous n’aurez pas à faire face à des conseils.

1. Après les lavages, remettez vos cellules en suspension à 5000 cellules par 100?l. Puis ajouter 100?l de cellules à chaque puits, même les puits spontanés et maximaux. Incubez les cellules ensemble pendant un minimum de 4 heures à 37 °C, la durée exacte dépend de votre application.

1. Quatre heures plus tard….Sortez votre assiette de l’incubateur. Ajouter 100?l d’une solution de triton-x à 1% dans vos cellules dans les puits maximaux pour lyser les cellules et libérer tout le chrome.

1. Faites tourner la plaque à 1250 tr / min pendant dix minutes pour pelleter les cellules.

1. Transférer le surnageant de chaque puits vers le puits d’une plaque absorbante (par exemple des plaques Luma) en veillant à ne pas toucher la pastille au fond du puits.

1. Laissez sécher la plaque pendant la nuit. Le matin, insérez-le dans le lecteur de plaques et obtenez vos résultats.

Les résultats que vous verrez dépendront de votre application spécifique

Calcul des Résultats de Votre Test de libération de chrome

Une fois que vous avez les lectures, vous devez effectuer un calcul simple pour déterminer la cytotoxicité de vos cellules.

Tout d’abord, faites la moyenne de vos triplés pour chaque condition. Ensuite, prenez ces moyennes et branchez-les dans cette formule:

(Libération de chrome pour la condition d’intérêt – Libération de chrome dans les puits spontanés) / (libération maximale de chrome – Libération de chrome dans les puits spontanés)

Multipliez la valeur par 100 pour obtenir votre pourcentage de lyse.