Frontiers in Immunology

Einleitung

Dendritische Zellen (DC) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APCs), die eine zentrale Rolle bei der Induktion und Regulation von Immunantworten spielen, einschließlich der Induktion von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) -Reaktionen. Sie sind ein wichtiger Schwerpunkt für die Entwicklung von Impfstoffen gegen Krebs und viele Krankheitserreger, einschließlich HIV und Malaria, wo CTL-Reaktionen zum Schutz und zur Ausrottung von Krankheiten erforderlich sind. DC, die ex vivo mit Tumorantigen (Ag) beladen sind, werden Krebspatienten seit über 15 Jahren als Impfstoffe verabreicht. Sie sind gut verträglich und induzieren Immunantworten, einschließlich einiger klinischer Regressionen, aber es gibt eindeutig Raum für Verbesserungen (1). Das DC-Netzwerk sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen ist heterogen, wobei spezialisierte DC-Untergruppen spezifische Immunfunktionen steuern (2). Neue Entwicklungen in unserem Verständnis der DC-Biologie haben eine Teilmenge von DC identifiziert, die durch die Expression neuer Marker gekennzeichnet ist CLEC9A (DNGR-1) (3, 4) und XCR1 (5, 6) als wichtig für die Induktion von CTL-Antworten (7). Impfstoffstrategien, die Ag und Aktivatoren direkt an CLEC9A + XCR1 + DC in vivo liefern, versprechen, viele der logistischen Probleme zu überwinden, die mit In-vitro-abgeleiteten Impfstoffen verbunden sind, und ermöglichen Präzision und Spezifität der gewünschten Immunantwort (8). Hier diskutieren wir die biologischen Eigenschaften von CLEC9A + XCR1 + DC, die sie zu so attraktiven Zielen für CTL-Impfstoffe machen, und neue Impfstoffansätze, um sie in vivo anzusprechen.

CLEC9A + XCR1 + DC sind essentiell für die CTL-Induktion

Die aufkommende Komplexität des DC-Netzwerks und die optimale DC-Teilmenge für das Target ist die erste wichtige Überlegung für das Design neuer Impfstoffe, die auf DC in vivo abzielen. Bei Mensch und Maus gibt es mehrere DC-Untergruppen, die sich in Lokalisation, Phänotyp und spezialisierter Funktion unterscheiden (2). Sie können grob klassifiziert werden als (i) entzündliche Monozyten-abgeleitete (Mo) DC, die sich aus Monozyten entwickeln und schnell an Entzündungsstellen rekrutiert werden; (ii) plasmazytoide DC (pDC), die als Reaktion auf die TLR 7/9-Ligation Hauptproduzenten von Typ-I-Interferonen (IFN) sind und für die antivirale Immunität von entscheidender Bedeutung sind; und (iii) konventionelle DC (cDC), die je nach Standort weiter in “lymphoidresidente” und “wandernde” DC (2) unterteilt werden können. Die lymphoidresidenten DC fangen Ag direkt in lymphatischen Geweben ein, während die wandernden DC in den peripheren Organen (z.B. b. Lunge, Haut und Darm), wo sie Ag einfangen und dann in lymphoides Gewebe wandern, um ihre Ag mit anderen lymphoidresidenten DC zu teilen oder Ag direkt in T-Zellen zu präsentieren. An beiden Standorten kann cDC weiter in Teilmengen mit speziellen Funktionen unterteilt werden. Zunehmende Hinweise deuten auf eine Rolle der CD11b + cDC-Untergruppe der Maus bei der Induktion von CD4 + T-Zell-Reaktionen hin, obwohl eine ähnliche Rolle für die äquivalente CD1c + DC-Untergruppe des Menschen noch nicht erwiesen ist (2, 9). Es ist jedoch die Teilmenge, die durch die Expression des C-Typ-Lektin-ähnlichen Rezeptors CLEC9A und des Chemokin-Rezeptors XCR1 definiert wird, die für die Induktion von CTL-Reaktionen gegen Krebs, Viren und andere pathogene Infektionen entscheidend ist (2, 7).

CLEC9A + XCR1+ DC wurden ursprünglich in Mäusen durch Expression der Marker CD8a auf lymphoidresidentem DC oder CD103 auf migratorischem DC identifiziert und werden allgemein als CD8a + lymphoid und CD103 + migratorischem DC bezeichnet. Beim Menschen kommt CLEC9A + XCR1 + DC, allgemein als CD141 + DC bezeichnet, sowohl in lymphoiden als auch in nicht-lymphoiden Geweben vor, einschließlich Haut, Darm, Leber und Lunge (6, 10-13). CLEC9A und XCR1 werden ausschließlich von dieser einzigartigen DC-Untergruppe in lymphoiden und nicht-lymphoiden Geweben beider Spezies exprimiert, mit Ausnahme geringer Expression von Clec9A durch Maus-pDC. Da diese Marker zusammen derzeit das spezifischste Mittel zur Definition dieser DC bei beiden Arten sind, bezeichnen wir sie im Folgenden als CLEC9A + XCR1 + DC. Neben CLEC9A und XCR1 teilen sich diese ZELLEN die Expression des Nectin-ähnlichen Proteins Necl2 (14) und TLR3 und sind Hauptproduzenten von IFN-λ nach TLR3-Ligation (15). Wichtig ist, dass sie sich durch Cross-Presentation auszeichnen, den Mechanismus, der es ermöglicht, exogene Ag, wie sie aus Tumoren und viral infizierten Zellen gewonnen wurde, zu verarbeiten und auf MHC I zur Erkennung durch CTLs zu präsentieren (16).

Was macht CLEC9A+XCR1+ DC so effektiv bei der CTL-Grundierung?

Obwohl andere Zelltypen, einschließlich Makrophagen, B-Zellen und andere DC-Untergruppen, unter bestimmten Umständen in vitro kreuzpräsentieren können (17-20), gibt es erhebliche Hinweise darauf, dass CLEC9A + XCR1 + DC sind in vitro und in vivo inhärent effizienter bei diesem Prozess (6, 7, 10, 11, 16). Die genauen molekularen Mechanismen sind nicht verstanden, aber umfangreiche Bemühungen haben noch spezialisierte Cross-Präsentation Maschinen einzigartig für CLEC9A + XCR1 + DC (16) zu offenbaren. Es gibt jedoch mehrere Merkmale dieser DC, die gemeinsam ihre überlegene Kreuzansaugfähigkeit trotz einer ähnlichen Ag-Aufnahmekapazität im Vergleich zu anderen DC-Teilmengen erklären. Erstens halten CLEC9A + XCR1 + DC einen weniger sauren pH-Wert in Endosomen und Phagosomen aufrecht, begünstigen die Kreuzpräsentation von frühen endozytischen Vesikeln (21) und erleichtern die Kreuzpräsentation von Ag, die auf späte Endosomen / Lysosomen abzielt (20, 22). Zweitens sind CLEC9A + XCR1 + DC effizienter bei der Translokation von Ag aus Endosomen / Phagosomen in das Cytosol für den Zugang zum klassischen MHC I-Verarbeitungsweg (23). Drittens spielt CLEC9A, ein Rezeptor für Aktinfilamente, die auf toten Zellen exponiert sind, eine Schlüsselrolle bei der Abgabe von AG, das aus toten Zellen für das Cross-Priming gewonnen wird (24-27). Viertens exprimieren CLEC9A + XCR1 + DC hohe Konzentrationen von TLR3, einem bekannten Verstärker der Kreuzansaugung (28). Schließlich wurde kürzlich gezeigt, dass die konstitutive Aktivierung des Unfolded-Protein-Response-Sensors IRE-1α und des Transkriptionsfaktors XBP-1 die Kreuzpräsentation spezifisch durch CLEC9A + XCR1 + DC reguliert (29). Es gibt auch Hinweise darauf, dass XCR1 und Necl2 an der CTL-Aktivierung beteiligt sind, wenn auch nicht direkt über die Verstärkung des Kreuzpräsentationswegs (5, 6, 14). Diese Merkmale bieten eine starke Begründung für die Entwicklung von Technologien, die speziell Ag für den Cross-Presentation-Weg von CLEC9A + XCR1 + DC in vivo liefern.

Targeting CLEC9A + XCR1+DC in vivo

Antikörper (Ab) spezifisch für DC-Oberflächenrezeptoren, insbesondere Ag-Aufnahmerezeptoren, können genutzt werden, um Ag direkt an DC in vivo zu liefern (30). Die Wahl des Rezeptors hängt von seiner Spezifität für die anzuvisierende DC-Teilmenge zusätzlich zu dem Ag-Verarbeitungs- und Präsentationsweg ab, den der Rezeptor nach der Internalisierung verwendet. Eine Vielzahl von C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLR) wurden für diesen Zweck ausgenutzt, und dies wird an anderer Stelle überprüft (1, 30), aber für die Abgabe von Ag an CLEC9A + XCR1 + DC bei Mäusen war DEC-205 ein Hauptfokus. Die Abgabe von Ag über DEC-205 Ab induziert sowohl CD4 + – als auch CD8 + -T-Zellantworten in Gegenwart von Adjuvans und ist bei der Verhinderung des Tumorwachstums ex vivo beladenen DC-Impfstoffen überlegen . Klinische Phase-I / II-Studien, die auf NY-ESO-1 Ag zur Behandlung multipler solider Malignome abzielen, die diese Ag exprimieren, werden derzeit unter Verwendung von CDX-1401, einem vollständig humanisierten Ab gegen DEC-205 (CellDex Therapeutics), durchgeführt. Beim Menschen wird DEC-205 zusätzlich zu B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen auf allen DC exprimiert. Obwohl gezeigt wurde, dass CLEC9A + XCR1 + DC, CD1c + DC, pDC und MoDC Ag verarbeiten und präsentieren, das von DEC-205 an CD4 + – und CD8 + -T-Zellen in vitro abgegeben wird (20, 31-33), deuten begrenzte direkte Vergleiche darauf hin, dass CLEC9A + XCR1 + DC bei der Kreuzpräsentation wirksamer ist (20). Dies ist wahrscheinlich auf den bevorzugten Handel von DEC-205 mit späten Endosomen zurückzuführen, der typischerweise die Ag-Verarbeitung über den MHC II-Weg begünstigt (34), während die Kreuzpräsentation durch CLEC9A + XCR1 + DC weiterhin möglich ist (20).

Ein attraktiver Ansatz besteht darin, Ag spezifischer an CLEC9A + XCR1 + DC unter Verwendung von Ab- oder für CLEC9A (3, 4) oder XCR1 (35) spezifischen Liganden zu liefern. Studien unter Verwendung von Clec9A für die Ag-Abgabe bei Mäusen beobachten effektive CD8 + T-Zell-Reaktionen und überraschenderweise überlegene CD4 + T-Zell-Immunität im direkten Vergleich zu DEC-205, auch in Abwesenheit von Adjuvans (3, 4, 36). Hauptgründe für die Wirksamkeit des Targetings von Clec9A sind der intrazelluläre Handel, da Clec9A Ag an frühe und recyclingende Endosomen abgibt (27), und die Persistenz von Anti-Clec9A Ab im Serum, was zu einer verlängerten Ag-Präsentation führt (36). Die Bestimmung der molekularen Wechselwirkungen von CLEC9A nach der Internalisierung und wie dies den AG-Handel und die Verarbeitung beeinflusst, wird zweifellos Aufschluss über die Grundlage für die Wirksamkeit des Clec9A-Targetings geben.

Anti-human CLEC9A Ab kann Ag an humanes CLEC9A + XCR1+ DC zur Verarbeitung und Präsentation an CD4 + – und CD8+ -T-Zelllinien in vitro liefern (37). Dies liefert einen Proof-of-Principle und eine starke Begründung, um Anti-Human-CLEC9A Ab für Impfstoffe weiterzuentwickeln und umfassender mit DEC-205 Ab und anderen Ansätzen zu vergleichen, die auf mehrere DC-Teilmengen abzielen. Solche Studien waren aufgrund von Schwierigkeiten, eine ausreichende Anzahl von humanem CLEC9A + XCR1 + DC für eine detaillierte Funktionsanalyse zu erhalten, begrenzt, sind jedoch jetzt mit der Entwicklung neuer humanisierter Mausmodelle durchführbar, bei denen sich funktionelles humanes CLEC9A + XCR1 + DC entwickelt und mit CLEC9A oder DEC-205 Abs in vivo (38).

Adjuvantien zur Aktivierung von CLEC9A + XCR1 + DC

Frühe klinische DC-Studien und Mausstudien zur Untersuchung von Clec9A oder DEC-205 Targeting Ab haben eindeutig gezeigt, dass eine DC-Aktivierung erforderlich ist, um optimale CTL-Reaktionen zu induzieren (31, 39). TLR-Liganden sind einige der vielversprechendsten Adjuvantien, die derzeit in der Klinik untersucht werden, und die differentielle Expression von TLR durch DC-Untergruppen könnte die Wahl des Adjuvans tiefgreifend beeinflussen. Dies ist eine besonders wichtige Überlegung für die präklinische Bewertung von Impfstoffen, die auf CLEC9A + XCR1 + DC abzielen, da die TLR-Expression in Maus- und humanen DC-Teilmengen variiert. Der TLR9-Ligand CpG wurde häufig als Adjuvans bei Mäusen verwendet, einschließlich mit Clec9A Ab (36) und wurde klinisch mit begrenzten Nebenwirkungen als Adjuvans in der Krebschemotherapie und ex-vivo-DC-Impfstoffen untersucht (40). Während TLR9 in Mäusen weit verbreitet ist, einschließlich durch CLEC9A + XCR1 + DC, ist es beim Menschen auf PDCs beschränkt (39). Die Aktivierung von humanem pDC durch CpG induziert jedoch große Mengen an Typ-I-IFN, die möglicherweise eine wichtige Zuschauerfunktion für die Aktivierung von CLEC9A + XCR1 + DC und die anschließende Induktion von Antitumorantworten spielen könnten (41, 42). Im Gegensatz zu ihren Mäusekollegen fehlt menschlichen CLEC9A + XCR1 + DC auch die Expression von TLR4, exprimiert jedoch TLR8, das bei Mäusen nicht funktionsfähig ist (39).

Ein TLR7 / 8-Ligand, R848 oder Resiquimod, wurde von der FDA für die topische Anwendung zugelassen und befindet sich derzeit in klinischen Studien mit DEC-205 (CDX-1401, CellDex) (43). Es aktiviert auch CD1c + DC über TLR8 und pDC über TLR7. Studien an Mäusen zeigen, dass seine kurze Halbwertszeit und Formulierung möglicherweise nicht ideal ist, um DC lokal zu aktivieren, um adaptive Immunantworten auszulösen, und es wurde mit schweren Nebenwirkungen in Verbindung gebracht, die in klinischen Studien beobachtet wurden (43).

Der TLR3-Ligand, polyI: C, entwickelt sich als attraktives Adjuvans für die Kombination mit DC Targeting Ab, da die TLR3-Expression in Mensch und Maus CLEC9A + XCR1 + DC konserviert ist. PolyI:Es wurde festgestellt, dass C das optimale Adjuvans für die Verwendung in Kombination mit DEC-205 Targeting Ab bei Mäusen ist (44). Die Poly I: C-Derivate Hiltonol und Ampligen sind beim Menschen gut verträglich und induzieren eine IFN-Reaktion vom Typ I, die die einer Virusinfektion nachahmt (45). Diese werden nun in klinischen Studien in Verbindung mit DEC-205 Targeting Ab (CellDex Therapeutics; NCT00948961) evaluiert.

Schlussfolgerung

Es besteht weiterhin ein großer Bedarf an der Entwicklung von Impfstoffen, die wirksame antivirale und tumorhemmende CTL-Reaktionen hervorrufen. Die Entdeckung des CLEC9A + XCR1 + DC in Mäusen und Menschen als Teilmenge, die auf Ag-Cross-Presentation und Cross-Priming-CTL spezialisiert ist, hat vielversprechende neue Wege für das Impfstoffdesign aufgezeigt. Der Beitrag anderer DC-Teilmengen zur Wirksamkeit dieses Prozesses muss jedoch noch bestimmt werden. Daher bleiben die Fragen offen: Ist es effektiver, Ag an die CLEC9A + XCR1 + DC zu liefern, die am besten für die Cross-Präsentation gerüstet sind, oder wird die Co-Lieferung an andere DC-Teilmengen helfen? Welche Rezeptoren liefern das Ag am besten an die erforderlichen intrazellulären Kompartimente und welche Adjuvantien verstärken die Immunantwort am besten? Bisherige Studien deuten darauf hin, dass das Targeting von CLEC9A + XCR1 + DC in vivo zusammen mit Adjuvantien zur spezifischen Aktivierung dieser DC vielversprechend ist. Die Weiterentwicklung humanisierter Mausmodelle, die die Entwicklung von CLEC9A + XCR1 + DC und anderen DC-Teilmengen ermöglichen, wird es ermöglichen, diese und andere Fragen zu beantworten und die Übersetzung von der Bank zur Bettseite zu erleichtern.

Erklärung zu Interessenkonflikten

Mireille H. Lahoud und Kirsteen M. Tullett sind als Erfinder bei Patentanmeldungen im Zusammenhang mit Clec9A aufgeführt. Kristen J. Radford hat keine Interessenkonflikte zu melden.

Danksagungen

Mireille H. Lahoud und Kristen J. Radford werden durch Projektstipendien des National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC 604306 und 1025201) und der Prostate Cancer Foundation of Australia (PG2110) unterstützt. Kristen J. Radford hält ein NHMRC CDF Level 2 Stipendium. Kirsteen M. Tullett ist Trägerin eines internationalen Doktorandenstipendiums der University of Queensland. Diese Arbeit wurde durch Victorian State Government Operational Infrastructure Support und Australian Government NHMRC Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme ermöglicht.