Gap Junction Protein Connexin-43 ist ein direkter Transkriptionsregulator von N-Cadherin in vivo

Embryomanipulation

Erwachsene X. laevis wurden bei 17 ° C gehalten und gemäß den Vorschriften der Biological Service Unit am University College London gemäß den im Animals Act festgelegten Richtlinien des britischen Innenministeriums verwendet 1986 wie beschrieben45. X. laevis-Embryonen wurden wie zuvor beschrieben gewonnen und inszeniert46,47. Um die Neuralleiste spezifisch anzuvisieren, wurden Embryonen in die ventralen Blastomere des Tieres im Acht-Zellen-Stadium auf einer Seite für alle Experimente injiziert, außer wenn embryonale Lysate verwendet wurden. In diesem Fall wurden Embryonen in beide Tierseiten von Embryonen im zweizelligen Stadium injiziert. Embryo-Mikroinjektionen wurden gemäß durchgeführt48. Falls erforderlich, wurden Fluorescein-Dextran (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) oder Rhodamin-Dextran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) als Tracer verwendet. Oligomorpholinos gegen X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5′-TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTCTTGTGGGTCGA-3′) und BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′- AACGGACCGGGTTTAAAGGCTTCCT-3′) wurden von Gene Tools LLC synthetisiert und bereitgestellt. Äquimolare Konzentrationen von Standardkontrollmorpholino (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5′) wurden verwendet. Die Mengen an Morpholinos entsprechen den Mengen, die in eine Seite von Embryonen im Achtzellstadium injiziert wurden, während die andere Seite als interne Kontrolle verwendet wurde. Wenn Embryonen zur Sammlung embryonaler Lysate verwendet wurden, wurden sie im zweizelligen Stadium in beide tierischen Blastomere injiziert und die doppelte der genannten Dosierungen verwendet. Um die Effizienz von Cx43MOs auf der endogenen cx43-mRNA zu testen, führten wir eine Western-Blot-Analyse durch. Beide Cx43MOs senkten effizient die Proteinspiegel des endogenen Cx43FL und Cx43iso (Abb. 3a, b). Um die BTF3MO-Effizienz zu validieren, testeten wir durch Immunfärbung von Neuralkammzellen die BTF3-Proteinexpression, die im Vergleich zu CTLMO verringerte BTF3-Spiegel in BTF3MO-Zellen zeigte (Ergänzende Abb. 3a).

Die In-situ-Hybridisierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt49,50. Kurz gesagt, Embryonen wurden in MEMPFA fixiert, gefolgt von einer Hybridisierung über Nacht mit Digoxigenin-markierten Sonden, inkubiert mit einem AP-Antikörper und AP-Aktivität wurde unter Verwendung von NBT / BCP-Substraten entwickelt. Digoxigenin-markierte RNA-Sonden wurden für foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) und sox1054, sox954 hergestellt. C3 (1 µg / ml), snail2 (0,8 µg / ml), foxD3 (2 µg / ml), sox10 (1 µg / ml), sox9 (1 µg / ml) und Twist (0,7 µg / ml) wurden zur Beurteilung der Neuralkasteninduktion verwendet, Twist (0.7 µg / ml) für die Neuralkammmigration, n-Cadherin (1 µg / ml) zur Beurteilung der Expressionsniveaus und des btf3-Expressionsmusters (0,7 µg / ml). Die Whole-Mount-Immunfärbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt55 unter Verwendung des Antikörpers Cx43 (1:1000, Sigma, C6219). Kurzzeitig wurden Embryonen in MEPMFA fixiert und über Nacht mit dem Antikörper bei der beschriebenen Verdünnung inkubiert.

Animal cap explants wurden aus Xenopus blastulas (stage 8) mit einer Standard technique48,56 seziert und für die In situ-Hybridisierung wie oben beschrieben vorbereitet. Für tierische Cap-Assays wurden 500 pg mRNA in die tierische Seite der beiden Blastomere von Embryonen im zweizelligen Stadium injiziert. Die Analyse von ISH wurde an 20-25 Embryonen pro Bedingung für jedes unabhängige Experiment durchgeführt.

Neural crest manipulation and imaging

Neural crest transplantations were carried out as previously reported57. Kurz gesagt, Neuralleiste aus Stadium 18 fluoreszenzmarkierte Embryonen wurden mit Augenbrauenmessern seziert und in unmarkierte Wirtsembryonen gepfropft. Für In-vitro-Experimente wurden kraniale Neuralleistenexplantate im Stadium 18 unter Verwendung einer Standardtechnik präpariert58,59 und wie zuvor beschrieben auf Fibronektin (Sigma, F1141) beschichtete Schalen plattiert53. Für Einzelzelltests wurden Neuralkammzellen kurzzeitig in Ca2 + / Mg2 + -freiem Danilchick-Medium dissoziiert53. Für jede Bedingung wurden zehn Embryonen, die mit fluoreszierend markiertem NC transplantiert wurden, pro Experiment analysiert.

Die Immunfärbung wurde wie zuvor beschrieben an Neuralkammexlantaten durchgeführt54 unter Verwendung von Anti-N-Cadherin (1:50, Ratten-IgG, Klon MNCD2, DSHB), Anti-E-Cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Die Bildgebung der In-vitro-Neuralkammmigration wurde unter Verwendung von Zeitraffer-Kinematographie wie zuvor beschrieben durchgeführt53,60. Kurz gesagt, Neuralkammzellen wurden in mit Fibronektin beschichteten Kunststoff- oder Glaspetrischalen kultiviert, und nach einer Stunde In-vitro-Kultur wurde mit der Zeitraffer-Mikroskopie begonnen. Für die Zellmotilität und -migration wurden zusammengesetzte Mikroskope (entweder ein Eclipse 80i Nikon-Mikroskop mit einer Hamamatsu-Digitalkamera oder ein DMRXA2 Leica-Mikroskop mit einer Hamamatsu-Digitalkamera, gesteuert durch ein einfaches PCI-Programm) mit motorisierten Tischen und einer 10 × / 0,30NA-Trockenlinse verwendet. NC-Kulturen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Bilder wurden alle 5 Minuten für einen Zeitraum von 12 h aufgenommen. Für die Zellmorphologie-Bildgebung wurde ein TCS SP8-Mikroskop mit 63 × / 0,90NA–Wasser-Immersionsobjektiven verwendet, das von der LAS-AF-Software gesteuert wurde. Fixierte Zellen wurden mit einem Ölimmersionsobjektiv 63 × / 1,4 NA und einem Konfokalmikroskop Leica TCS SPE abgebildet, das von der LAS–AF-Software gesteuert wurde.

Für jede Lokalisation oder endogene IF-Spiegel wurden 10-15 NCCs für jede Bedingung pro Experiment analysiert.

Zellmigrations- und Zellmorphologieanalyse

Der Chemotaxis-Assay wurde nach einem Standardverfahren61 unter Verwendung von Heparin-Acrylkügelchen (Sigma, H5263) durchgeführt, die mit 1 µg / ml gereinigtem Faktor-1 aus humanen Stromazellen (Sigma, SRP3276) beschichtet waren. Zellmotilität und Chemotaxis wurden mit ImageJ (https://imagej.nih.gov) Analysetools analysiert, wie zuvor beschrieben53,60. Kurz gesagt, jede einzelne Zelle wurde manuell mit dem manuellen Tracking-Plugin von ImageJ verfolgt, die Daten wurden mit dem Chemotaxis-Plugin von ImageJ gesammelt und analysiert. Die Zellmorphologie wurde durch den Einsatz des Zirkularitätsindex (kompletter Kreis = 1) bewertet und durch ImageJ-Analysetools geschätzt. Die Zelldispersion wurde unter Verwendung des Delaunay-Triangulationsalgorithmus (ImageJ-Algorithmus) analysiert und wie zuvor beschrieben als durchschnittliche Explantationsdreieckfläche aufgetragen.54. Zellprotrusiver Bereich wurde in Neuralkammzellen am Rand eines Explantats analysiert, um den Auswuchsbereich zu messen, der sich aus zwei aufeinanderfolgenden Zeitrahmen mit 4 min Zeitintervall ergibt; Diese beiden aufeinanderfolgenden Rahmen wurden subtrahiert, um den neuen Bereich zu erzeugen12. Zur Analyse der Zellchemotaxis und Zelldispersion wurden 10-15 Explantate pro Bedingung für jedes unabhängige Experiment analysiert. Für Zellmotilität, Zellmorphologie und Zellvorsprünge wurden 15-25 NCCs pro Zustand und Experiment analysiert.

Molekularbiologie, Plasmide und Reagenzien

Für die cDNA-Synthese wurde Gesamt-RNA aus 10-15 Embryonen der Stadien 23-24 oder 10-15 Tierzellen der Stufe 8 von X. laevis pro Bedingung für jedes unabhängige Experiment isoliert und drei technische Repliken wurden in jedem Experiment verwendet25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) als Vorlage. Cx43 in voller Länge (Cx43FL, aa 1-379), Cx43 carboxyterminal verkürztes Konstrukt (Cx43Trunc, aa 1-212) und Cx43-20k-Konstrukt (Cx43Tail, aa 213-379) wurden in 5’BamHI / 3’XhoI von PCS2 + – oder pCS2-EGFP-Vektoren kloniert. Der pCS2-EGFP Vektor wurde freundlicherweise von Dr. Masa Tada zur Verfügung gestellt. Ein induzierbares Konstrukt von Cx43Tail wurde durch Fusionieren des Cx43-20kTail (aa 219-379) mit der Ligandenbindungsdomäne des humanen GR (aa 512-777) hergestellt. Cx43-20k wurde in 5’Ecori/3’Saci und GR in 5’Saci/3’Xhoi von pCS2+ und pCS2-EGFP kloniert. BTF3-Konstrukte wurden unter Verwendung des X synthetisiert. laevis-Sequenz aus cDNA-Klon (UniGene ID XL.3536). BTF3FL (aa 1-162) wurde in 5’Ecori/3’XhoI von pCS2+ oder pCS2-EGFP kloniert. BTF3-Deletionskonstrukt ohne die NLS-Region RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) wurde in 5’Bamhi/3’Clai von pCS2+ kloniert. Für die BiFC-Experimente (Abb. 4b, c), Cx43Tail und Cx43Trunc wurden in 5’Bamhi/3’BamHI von pCS2-VC155 kloniert. BTF3FL wurde in 5’BamHI/3’BamHI von pCS2-VN9m kloniert. BiFC-Vektoren wurden freundlicherweise von Prof. James C. Smith zur Verfügung gestellt. Alle Konstruktsequenzen werden durch automatisierte DNA-Sequenzierung verifiziert (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg/Embryo,63).

Alle Analysen an Fluoreszenzkonstrukten wurden durch Normalisierung auf die Hintergrundfluoreszenz und, falls erforderlich, auf die Gesamtzellflächenfluoreszenz bewertet.

Folgende Reagenzien wurden verwendet: flufenaminsäure (50 µM für die NC−Explantationsinkubation −100 µm für die Embryonenbehandlung, Sigma, F9005), Meclofenaminsäure (50 µM für die NC-Explantationsinkubation -100 µm für die Embryonenbehandlung, Sigma, M4531), Actinomycin D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) und in Ethanol gelöstes Dexamethason (10 µM) wurden dem Kulturmedium in den Stadien 14-15 zugesetzt und bis zum wandernden embryonalen Stadium der Neuralleiste (Stadium 23) aufrechterhalten. Um das mögliche Auslaufen induzierbarer Chimären zu kontrollieren, wurde eine Geschwistercharge von Embryonen ohne Dexamethason kultiviert und zur In-situ-Hybridisierung verarbeitet. Für den Kopplungstest (Testen der Gap Junction-Kanalaktivität) wurden 10-15 NCCs pro Bedingung und Experiment analysiert.

Immunpräzipitation, Fraktionierung und Western Blotting

Für jede Bedingung wurden 10-15 Embryonen zur Herstellung von Embryo-Lysaten pro Experiment verwendet. Ganze Embryonen wurden nach Homogenisierung in Lysepuffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) mit Zusatz von Proteaseinhibitoren (Roche, 11836153001) und Phosphataseinhibitoren (Roche, 04906837001) 54,64 für den Western Blot präpariert. Für Western Blots wurden folgende Antikörper verwendet: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); kurzzeitig wurden Zellen in Lysepuffer suspendiert und 5 min bei 20.000×g bei 4°C zentrifugiert, der Überstand gewonnen und das Volumen mit Verdünnungspuffer eingestellt. Beads wurden in Verdünnungspuffer äquilibriert und mit dem resuspendierten Zelllysat vermischt. Die Mischung wurde magnetisch gereinigt und für den Western Blot vorbereitet. Die Isolierung der Kernfraktion von X. laevis-Embryonen wurde unter Verwendung von Differentialzentrifugationsprotokollen mit Modifikationen durchgeführt64,65. Kurz gesagt, Stufe 18 X. laevis Embryo Lysate mit einer 22 G Nadel und 20 µL Homogenisierungspuffer (HB: 250 mM Saccharose, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, Phosphatase- und Proteaseinhibitoren) pro Embryo. Alle Proben wurden bei 250 × g für 5 min zentrifugiert, um Embryotrümmer zu entfernen. Nach dem Sammeln des Überstandes wurde dieser auf drei verschiedene Röhrchen verteilt und bei drei verschiedenen Geschwindigkeiten (400×g, 600×g) für 5 min zur Isolierung der Zellkerne versponnen. Die postnuklearen Überstände wurden zur Weiterverarbeitung aufbewahrt. Die Kernpellets wurden noch einmal in Puffer HG gewaschen und bei entsprechender Geschwindigkeit (400×g, 600×g) zentrifugiert. Kernpellets wurden dann in 40 µL 10% Glycerin/0,1% SDS/1% Triton-X in HB resuspendiert. Jeder Probe wurde eine geeignete Menge Probenpuffer zugesetzt, und die Proben wurden für die Acrylamidgelelektrophorese und die Western-Blot-Analyse verarbeitet. Um Belastungsfehler zu vermeiden, wurde die gleiche Membran nach dem Strippen wie zuvor beschrieben gegen die Belastungskontrolle getupft 54,64.

Western Blot-Daten wurden mit ImageJ-Analysetools analysiert. Die Bildintensitäten wurden normalisiert und das Verhältnis des interessierenden Proteins zur Beladungskontrolle (d.h., Mapk oder α-Tubulin) wurde berechnet, durchschnittliche Verhältnisse wurden aufgetragen. Ungeschnittene Blots sind als ergänzende Figuren enthalten (ergänzende Fig. 5–7).

Zellkulturen

HeLa-Zellen (Leibniz-Institut für Mikroorganismen und Zellkultur, DSMZ, Deutschland) wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (Life Technologies, CA, USA), bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO2 kultiviert und wie angegeben mit Rotifect (Carl Roth, Deutschland) gemäß Herstellerangaben transfiziert.

Xenopus embryonale Fibroblasten (XTC, ein freundliches Geschenk von Ana Losada) wurden in 67% DMEM/H2O, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, bei 25 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2 kultiviert und wie angegeben mit Viafect (Promega, USA) transfiziert. Plasmide für die Transfektion waren wie angegeben und 10-20 Hela- oder XTC-Zellen wurden für jede Bedingung pro Experiment analysiert.

Für siRNA-Experimente wurde eine Kombination von drei gegen BTF3 gerichteten siRNA wie oben beschrieben transfiziert. Als Kontrolle wurde eine Standard-siRNA (Scrambled siRNA von Sigma) verwendet. Katalognummer für diese kommerziellen siRNA gegen BTF3 sind: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion gesammelt und für qPCR-, Western Blot- oder immunhistochemische Experimente verarbeitet. Wie in den jeweiligen Abschnitten beschrieben.

Alle Zelllinien wurden auf Mycoplasma-Kontamination getestet.

Immunhistochemische und Phalloidin-Färbung

Zum Proteinnachweis wurden Säugetierzellen oder Neuralleistenexlantate in 4% Formaldehyd in 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) für 10 min fixiert und mit 10% NGS für 1 h blockiert. Primärantikörper wurden bei 4°C in 10% igem NGS inkubiert. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: 1/100 Anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µg/ml Anti-N-Cadherin (MNCD2 Developmental Studies Hybridoma Bank) und 1:100 Anti-Cx43 (Sigma, C6219) in 10% igem NGS und bei 4°C inkubiert. Explantate wurden 3 mal mit PBS + 0,2% Tween-20 gewaschen und bei 4°C mit sekundärem Antikörper inkubiert, bei 1:350 in 10% NGS. DAPI wurde bei 1:1000 verdünnt und mit den Sekundärantikörpern gemischt.

Massenspektrometrie

Zur Co-Immunpräzipitation des FLAG-markierten CX43TAILS für die massenspektrometrische Analyse wurden Zellen lysiert und Lysate über Nacht mit Anti-HA und equilibrierten High Affinity Beads bei 4°C inkubiert, die Immunpräzipitate anschließend gewaschen und eluiert 27. Nach saurer Elution mit 0,1 M Glycin pH 2,5 wurde der pH-Wert der Eluate mit 0,5 M Tris auf pH 8,0 eingestellt. Für den Proteinverdau wurden Proben über Nacht mit 2 µg Trypsin (Trypsin Gold, Promega, USA) inkubiert, gefolgt von Zugabe von 0.1 µg Lys-C (Roche, Deutschland) und Inkubation für weitere 6 h. Die Peptide wurden auf C-18 Reversed Phase stage Tips (Nest Group, USA) entsalzt, im Vakuum getrocknet und bis zur Analyse bei -20°C gelagert. Getrocknete Peptidemischungen wurden in 3 µl 30%iger Ameisensäure gewonnen und mit Wasser auf 23 µl verdünnt. Fünf µl des Digests wurden auf ein Nano-LC-System (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) injiziert und Peptide durch Reversed-Phase-Chromatographie auf selbst hergestellten C-18-Säulen (Reprosil-Pur C18-AQ, 1,9 µm, Dr. Maisch, Deutschland, PicoFrit-Säulen, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) in einem linearen Gradienten von 100% Laufmittel A (0,1% Ameisensäure) zu 55% Laufmittel B (60% Actenitril, 0,1% Ameisensäure) in 120 min. Das LC-System wurde als belüftete Säule aufgebaut und die Probe mit einer Flussrate von 400 nl/min gereinigt und entsalzt und die Trennung mit einer Flussrate von 200 nl/min durchgeführt. Das Nano-LC-System wurde mit dem Massenspektrometer (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Deutschland) verbunden, das im datenabhängigen Modus betrieben wurde. Die Dateninterpretation wurde mit Mascot V2.2 (Matrixscience, UK) und Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, UK) durchgeführt. Die Dateninterpretation erfolgte mit MaxQuant V1.6.1.0 und Perseus V1.6.1.3 (MPI für Biochemie, Deutschland).

Kopplungsassay

Die intrazelluläre Gap Junction-Kommunikation wurde mit einem Farbstoffkupplungsassay getestet. Hier wurde der Fluoreszenzfarbstoff Calcein-AM (Sigma, 17783) verwendet. Eine Neuralkastenpopulation, die aus nicht injizierten Embryonen präpariert wurde, wurde mit dem Farbstoff Calcein-AM für ungefähr 10 min inkubiert oder bis der Farbstoff in alle Zellen geladen war. Eine weitere Neuralkastenpopulation aus Embryonen, die mit einem Kernmarker injiziert wurden (nRFP-mRNA-Injektionen, siehe oben), wurde separat seziert. Nachdem die beiden Populationen in Abwesenheit von Calcium und Magnesium dissoziiert wurden, wurden sie gemischt und 1 h bei 14 °C in einem Reagenzglas inkubiert. Nach milder Zentrifugation wurden die Neuralleistenexplantate in ähnlich große Stücke geschnitten und wie oben beschrieben kultiviert und dann gefilmt. Um die Kanalaktivität von Gap Junctions zu testen, wurden Gap Junction Blocker; Meclofenaminsäure (Sigma, M4531) und Flufenaminsäure (Sigma, F9005) verwendet. Die Zellkommunikation wurde bewertet, indem das Verhältnis der Anzahl der Zellen, die beide Tracer, den Kernmarker und das Calcein aufweisen, zur Gesamtzahl der Zellen, die den Kernmarker aufweisen, geschätzt wurde.

Statistische Analyse

Die Schätzung der Stichprobengröße erfolgte nach zuvor veröffentlichten Arbeiten, und es wurde keine spezifische statistische Methode verwendet. Die Experimente wurden nicht randomisiert und aufgrund der Art der Experimente waren die Autoren sowohl bei Experimenten als auch bei der Ergebnisanalyse nicht blind für die Zuordnung. Es wurden nur lebensfähige Embryonen und Explantate analysiert. Falsch injizierte Embryonen wurden für In-situ-Hybridisierungsexperimente nicht eingeschlossen. Die korrekte Injektion wurde durch Injektion linearer Tracer bestimmt. Unsere experimentellen Parameter wurden zufällig gemessen, sobald lebensfähige und ordnungsgemäß injizierte Embryonen ausgewählt wurden.

Der Vergleich der Prozentsätze wurde unter Verwendung von Kontingenztabellen durchgeführt66. Die Normalität der Datensätze wurde mit dem Kolmogorov–Smirnov–Test, dem D’Agostino- und Pearson-Test und dem Shapiro-Wilk-Test mit Prism6 (GraphPad) getestet. Datensätze nach Normalverteilung wurden mit dem Student-t-Test (two-tailed, ungleiche Varianzen) oder ANOVA mit einem Dunnett-Mehrfachvergleich nach dem Test mit Excel oder Prism6 (GraphPad) verglichen. Datensätze, die keiner Normalverteilung folgten, wurden mit Mann Whitney’s Test oder einer nichtparametrischen ANOVA (Kruskal Wallis mit Dunn’s Multiple comparisons post-Test) mit Excel oder Prism6 verglichen. Kreuzvergleiche wurden nur durchgeführt, wenn der Gesamt-p-Wert der ANOVA kleiner als 0,05 war. In allen Figurenlegenden N = Anzahl der unabhängigen Experimente; n = Gesamtstichprobengröße.

X. laevis n-cadherin partial promotor identification

Um den basischen Promotor von Xenopus n-cad zu identifizieren, verwendeten wir die folgende Strategie. Die basische Promotorregion von Küken- und Säugetier-n-Cadherin-Genen wurde an den 5′-UTR-Regionen innerhalb der Position -3000 bis -1 bp der Translationsinitiationsstelle 41,67 beschrieben. Mit Hilfe der X. laevis Genome Project resource (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) identifizierten wir eine Region von 2800 bp in der 5′-UTR des X. laevis n-cadherin Gens (Ergänzende Abb. 4). Da unsere Daten darauf hindeuten, dass CX436, BTF-3 und Pol II einen Komplex bilden, verwenden wir das ElemeNT tool68, um nach potenziell aktiven TATA-Boxen in der Region zu suchen, die wir isoliert haben. Unsere In-Silico-Analyse zeigt eine TATA-reiche Region zwischen den Positionen -166 bis -618 bp, relativ zur Translationsstartstelle (Ergänzende Abb. 4). Schließlich entwerfen wir überlappende Primer, um Fragmente von 200 bp in dieser Region zu amplifizieren. Primersequenzen sind im Chipabschnitt aufgelistet und ihre Bindungsbereiche sind in ergänzender Fig. 4.

Chromatinimmunpräzipitation (ChIP)

Für die Chromatinimmunpräzipitation (ChiP) folgten wir einem Standardverfahren für X. laevis-Embryonen69,70. Für jedes unabhängige Experiment verwendeten wir zwei technische Repliken und 250-300 Xenopus-Embryonen pro Zustand. Kurz gesagt, Neurula Stadien X. laevis Embryonen wurden für 15 min fixiert und 3 µg Pol II Antikörper (Diagenode, C15100055) oder GFP ChIP Grade Antikörper (Abcam, ab290) wurden verwendet. Für die DNA-Extraktion folgten wir einem Standardprotokoll69,70. Mit der Elementanalyseressource, Wir suchten nach mutmaßlichen TATA-Boxen im X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′-GCCAAGTTTTCCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′-GGAAGCAAATGCTTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5′-AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3′

und ihre relativen Bindungsstellen sind in ergänzender Abb. 4b. Die Experimente wurden wie folgt quantifiziert: Das normalisierte Verhältnis der Bandintensität für jede Bedingung wurde gemittelt und die Faltenzunahme in der IgG-Kontrolle wurde berechnet und als Faltenanreicherung aufgetragen. Die Bandintensität wurde mithilfe des ImageJ-Datenanalyse-Plugins registriert. Uncropped Gele sind in ergänzenden Fig. 7c, gest.