Genetische Analyse einer Poliovirus /Hepatitis C-Virus (HCV) -Chimäre: Interaktion zwischen dem Poliovirus-Kleeblatt und einer Sequenz in der HCV 5′-nichttranslatierten Region führt zu einem Replikationsphänotyp
ABSTRACT
Interne ribosomale Eintrittsstellen (IRESs) können in fremden viralen Genomen oder in künstlichen dicistronischen mRNAs funktionieren. Wir beschreiben eine Wechselwirkung zwischen der Wildtyp-Hepatitis-C-Virus (HCV) -spezifischen Sequenz und dem Poliovirus (PV) 5′-terminalen Kleeblatt in einem PV / HCV-chimären Virus (das die HCV-IRES enthält), was zu einem Replikationsphänotyp führt. Entweder eine Punktmutation am Nukleotid (nt) 29 oder eine Deletion bis zu nt 40 in der nicht translatierten HCV 5′-Region des Replikationsblocks, wodurch PV / HCV-Varianten mit hohen Titern repliziert werden. Zufällige, aber lähmende Wechselwirkungen zwischen einem IRES und der umgebenden heterologen RNA müssen berücksichtigt werden, wenn IRES-basierte dicistronische Expressionsvektoren konstruiert werden.
Alle Picornavirus-Genome enthalten ein genetisches Element namens Internal Ribosomal Entry Site (IRES), das die Translation viraler genomischer mRNAs auf 5′- und cap-unabhängige Weise ermöglicht (5, 12, 13, 16, 20, 25). Ähnliche genetische Elemente wurden auch in Genomen des Hepatitis-C-Virus (HCV) (24), eines Hepacivirus, und des bovinen Virusdiarrhoevirus (21), eines Pestvirus, der Familie der Flaviviridae entdeckt. IRESs befinden sich im 5′-terminalen Segment der Genome, wo sie die Initiierung der Polyproteinsynthese steuern. Bestimmte Insekten-RNA-Viren, z. B. das Plautia-Stalium-Virus, sind jedoch insofern außergewöhnlich, als ihr verwandtes IRES mehrere tausend Nukleotide stromabwärts des 5′-Endes des Genoms abbildet und zwei Cistrone trennt, die für zwei verschiedene Polyproteine kodieren (23). Es ist von Interesse, dass wir zuvor ein dicistronisches Poliovirus (PV) entwickelt haben, indem wir das IRES des Enzephalomyokarditisvirus in die kodierende Region des PV-Polyproteins (16) eingeführt haben. Die genetische Organisation dieser dicistronischen PV, die zwei durch ein IRES-Element getrennte Polyproteine codiert, ähnelt stark der des P. stali-Darmvirus.
IRES-Elemente werden durch Funktion und nicht durch Nukleotidsequenz definiert. In der Tat haben die IRESs von PV, einem Picornavirus, und HCV, einem Flavivirus, wenig oder gar keine Sequenz gemeinsam, aber beide fungieren als Promotoren des internen ribosomalen Eintritts für die Initiierung der Translation. Dieses Phänomen tritt am deutlichsten bei chimären PV / HCV-Viren auf, bei denen das verwandte PV IRES mit dem von HCV ausgetauscht wurde (15, 28). Unerwarteterweise enthält das HCV-IRES eine Sequenz stromabwärts des AUG-Codons, die sein Polyprotein initiiert (15, 22). Bei der Konstruktion eines lebensfähigen PV / HCV-chimären Virus war ein Teil der Kernprotein-kodierenden Sequenz notwendig, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten (Abb.1, ΔCore) (15). Die ΔCore-Sequenz führt zur Bildung eines ΔCore/PV-Fusionspolyproteins, das durch Spaltung durch die PV-Virusproteinase 2Apro am ΔCore*1A-Übergang verarbeitet werden muss (Fig. 1) (28). Für die Funktion der HCV-IRES in P/H710-d17* (28) ist jedoch die Herstellung von Core-Sequenz-codierten Peptiden infolge der Translation der ΔCore-Sequenz nicht notwendig. (In früheren Studien wurde P / H710-d17 als P / H701-2A bezeichnet, da das chimäre Genom die HCV-spezifische Sequenz aus den Nukleotiden 18 bis 710 des HCV-Genoms enthielt . Die Nummerierung der HCV 5’nicht übersetzten Region in diesem Papier entspricht der Nummerierung des HCV 5’NTR in voller Länge.)
