Genomweite Analyse der Kondensinbindung bei Caenorhabditis elegans

Die Kondensine I und II teilen sich die beiden SMC-Untereinheiten MIX-1 und SMC-4 und unterscheiden sich durch drei Nicht-SMC-Untereinheiten (Abbildung 1A). Condensin IDC unterscheidet sich von Condensin I nur durch eine Untereinheit, die SMC-4-Variante DPY-27. Wir verwendeten ein oder zwei verschiedene Antikörper gegen jede Condensin-Untereinheit für ChIP-Seq und identifizierten die Bindungsstellen, die in mehreren Antikörpern und biologischen Replikaten üblich sind (zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Die Antikörpervalidierung und die erwarteten Co-Immunpräzipitationswechselwirkungen aus dem Condensin-Holocomplex sind in der zusätzlichen Datei 2 dargestellt. Die paarweise Korrelation der mittleren ChIP-Anreicherungswerte gruppierte die Untereinheiten Condensin I-IDC und II getrennt voneinander und bestätigte die Verteilung der einzelnen Untereinheiten zwischen den drei Condensintypen (Abbildung 1B).

Hochauflösende Bindungsmuster der drei Kondensinkomplexe sind ähnlich

C. elegans Condensin I und II haben teilweise überlappende, aber unterschiedliche chromosomale Lokalisationen in Mitose und Meiose , und Condensin IDC ist speziell auf das X ausgerichtet . Daher erwarteten wir unterschiedliche ChIP-Seq-Muster für Condensin I, IDC und II. Stattdessen waren die Bindungsmuster der Untereinheiten Condensin I, IDC und II im Allgemeinen ähnlich (Abbildung 1C). Diese Ähnlichkeit war nicht auf Antikörperkreuzreaktivität zurückzuführen, da der HCP-6-Antikörper, der keine Kreuzreaktivität zeigt und keine Kondensin-I-IDC-Untereinheit immunpräzipitiert , eine ausgedehnte Kolokalisierung mit Kondensin-I-IDC-Untereinheiten zeigte (siehe HCP-6 in Abbildung 1C). Wenn die Überlappung von Condensin II auf Kreuzreaktivität mit Condensin IDC zurückzuführen wäre, hätten wir außerdem eine Anreicherung von Condensin II-Bindungsstellen auf dem X erwartet, was nicht der Fall war (Abbildung 1D). Im Vergleich zu Condensin II hatten Condensin IDC-Untereinheiten durchweg höhere ChIP-Scores auf dem X, was auf einen Unterschied in der chromosomalen Assoziation der beiden Condensinkomplexe hindeutet, wie sie vom ChIP erfasst wurden (beachten Sie verschiedene Skalen auf X und Chromosom I in Abbildung 1C). Da wir ChIP-Seq in Embryonen im gemischten Stadium durchgeführt haben, befanden sich die meisten Zellen (mehr als 95% geschätzt durch 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) -Färbung) in Interphase. Das Fehlen von Kondensin-I-Untereinheiten auf Autosomen (Abbildung 1C und zusätzliche Datei 3: Abbildung S1A) und die vorherige Beobachtung, dass Kondensin I nach dem Abbau der Kernhülle auf mitotische Chromosomen lokalisiert ist, legen nahe, dass der größte Teil des ChIP-seq-Signals aus der Interphase stammt. Um dies zu unterstützen, wurde gezeigt, dass Condensin II während der Interphase nuklear ist und eine gleichmäßigere Verteilung der Bindungsstellen auf alle Chromosomen aufweist (Abbildung 1D).

KLE-2, HCP-6 und CAPG-2 sind Kondensin-II-spezifisch und stellen somit eine Kondensin-II-Bindung dar. Condensin I und IDC teilen sich alle drei Nicht-SMC-Untereinheiten, daher beziehen wir uns im Folgenden auf das ChIP-seq-Signal von DPY-26, DPY-28 und CAPG-1 als von Condensin I-IDC. Um uns auf die Stellen zu konzentrieren, die als Komplex gebunden sind, haben wir das Chipsignal aus den spezifischen CAP-Untereinheiten vom Condensin-Typ gemittelt. Zusätzlich zur Verwendung gemittelter Daten haben wir überprüft, ob jede Analyse mit einzelnen Untereinheiten zutrifft, und wir stellen HCP-6 und DPY-28 in ergänzenden Abbildungen vor. Wir identifizierten eine Reihe von kondensierten I-IDC- und II-Bindungsstellen mit hoher Konfidenz, indem wir nur die ChIP-Seq-Peaks auswählten, die über zwei oder mehr Nicht-SMC-Untereinheiten konsistent waren (Abbildung 1D). Wie bereits erwähnt, traten 97% der Kondensin-I-IDC-Bindung auf dem X-Chromosom auf . Condensin II war ähnlich zwischen Autosomen und dem X. Condensin II verteilt, das an stärkere Condensin I-IDC-Stellen auf dem X-Chromosom gebunden war (Abbildung 1E und zusätzliche Datei 3: Abbildung S1B).

Kondensinbindungsstellen sind an aktiven Promotoren angereichert

Um die Regionen zu identifizieren, in denen Kondensine bevorzugt binden, analysierten wir Kondensinbindungsstellen in Bezug auf mehrere genomische Annotationen. Kondensinbindungsstellen waren an Promotoren, in der Nähe von tRNA-Genen und nicht-kodierenden RNAs signifikant angereichert (Abbildung 2A, Zusätzliche Datei 4: Abbildung S2). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass kondensingebundene tRNA-Gene nur an Promotoren auftreten, entfernten wir tRNA-Gene, die sich innerhalb von 1 kb von einer Transkriptionsstartstelle (TSS) befanden, und stellten fest, dass die Überlappung von tRNA- und Kondensinbindungsstellen signifikant blieb (23% und 6% der tRNAs überlappten sich mit Kondensin I-IDC- bzw. II-Stellen, P = 0,0002). Die Kondensinbindung an tRNA-Gene legt nahe, dass die TFIIIC-vermittelte Kondensinrekrutierung zwischen C. elegans und Hefe konserviert werden kann .

Kondensationsstellen sind an Promotoren und tRNAs angereichert, und die Bindung korreliert positiv mit der Transkription. (A) Anreicherung oder Verarmung von Kondensinbindungsstellen an verschiedenen genomischen Annotationen sind angegeben. Zufällige Anreicherung und p-Werte wurden durch einen Permutationstest berechnet, bei dem die Kondensationsspitzen 10.000 Mal zufällig verteilt wurden. Sowohl für Kondensin I-IDC als auch für II gibt es eine signifikante Anreicherung von Bindungsstellen an 1 kb Promotoren und in der Nähe von nicht-kodierenden RNAs (P = 0.0002), Depletion innerhalb von Genkörpern (Transkriptionsstartstelle (TSS) bis Transkriptionsendstelle (TES)) (P = 0,0002) und keine signifikante Anreicherung oder Depletion an der 3′ von Genen (P > 0,05). (B) Das Kondensin-Chipsignal ist auf die TSSS von exprimierten Genen (obere 25% nach RNA-Ebene, durchgezogene Linien) und nicht exprimierten Genen (untere 25% nach RNA-Ebene, gestrichelte Linien) ausgerichtet. Die umgebenden Punkte repräsentieren das Konfidenzniveau von 95%. Als Kontrolle ist das Immunglobulin G (IgG)-Chipsignal am TSSS grau aufgetragen. (C) Der Spearman-Rangkorrelationskoeffizient zwischen dem medianen ChIP-Score bei 500 bp-Promotoren und dem RNA-Level bei den jeweiligen Genen wird für das gesamte Genom und das X-Chromosom angegeben. Es besteht eine leichte positive Korrelation zwischen Kondensinbindung und Transkription. (D) Der mediane ChIP-Score innerhalb von 500 bp stromaufwärts des TSS wird gegen den RNA-Spiegel jedes Gens aufgetragen. Kondensin-Promotor-gebundene Gene (definiert durch Überlappung mit einer Kondensinstelle innerhalb von 1 kb des TSS) sind orange (Kondensin I-IDC) und blau (Kondensin II) hervorgehoben. (E) GC-Gehalt von 50 bp-Fenstern ist über Kondensin I-IDC und II Bindungsgipfel aufgetragen. Als Kontrolle wurde der GC-Gehalt über 1500 Zufallskoordinaten bestimmt und in gleicher Weise wie die tatsächlichen Kondensingipfel aufgetragen. Der durchschnittliche GC-Gehalt ist um den Peak der Kondensationsbindung hoch.

Die Bindung war innerhalb von 500 bp des TSS am höchsten (Zusätzliche Datei 5: Abbildung S3A) und 45% der Kondensin-I-IDC- und 62% der Kondensin-II-Peaks befanden sich an Promotoren. Die Kondensinbindung an Promotoren korrelierte positiv mit der Transkriptionsaktivität des Downstream-Gens (Abbildung 2B, C), aber nicht alle aktiven Promotoren waren gebunden (Abbildung 2D). Die genontologische Termanalyse gebundener Promotoren zeigte eine leichte (1,3-fache), aber signifikante (P = 3,5e-17) Anreicherung für Gene mit embryonaler Entwicklungsfunktion (Zusätzliche Datei 6: Tabelle S2). Ungefähr 20% der stark exprimierten Gene (oberstes Quartil nach RNA-Ebene) hatten eine Kondensin-II-Bindungsstelle innerhalb von 1 kb und etwa 70% der X-Chromosomengene hatten eine Kondensin-I-IDC-Bindungsstelle innerhalb von 1 kb. Obwohl die Transkriptionsaktivität wichtig ist, reicht es daher nicht aus, die Spezifität der Kondensationsbindung an bestimmten Promotoren zu erklären.

Wir stellten fest, dass alle Kondensinbindungsstellen eine deutliche Anreicherung des GC-Gehalts im Vergleich zu umgebenden Regionen und zufälligen Koordinaten aufwiesen (Abbildung 2E). In C. elegans ist der GC-Gehalt von X-Chromosomenpromotoren höher als der von autosomalen Promotoren . Es ist möglich, dass ein höherer GC-Gehalt ein DNA-Sequenzmerkmal für die Kondensationsbindung ist, und X-Promotoren haben sich entwickelt, um einen höheren GC-Gehalt zu enthalten, um die Kondensationsbindung zu unterstützen.

Kondensin-Bindungsstellen stimmen signifikant mit einer Teilmenge von Transkriptionsfaktoren überein

Um zusätzliche Faktoren zu bestimmen, die Kondensin-gebundene Promotoren unterscheiden, verglichen wir Kondensin- und TF-Bindungsstellen und fanden eine Teilmenge von TFs, die an dieselben Promotoren wie Kondensine gebunden waren (Abbildung 3A). Frühere Studien zeigten, dass mehrere TFs an eine Reihe von Bindungsstellen mit hoher Belegung (HOT) binden . Es gab eine Überlappung von 5% bzw. 22% der Kondensin-I-IDC- und Kondensin-II-Standorte mit HEIßEN Standorten (P = 0,0002). Die Signifikanz der Überlappung mit TFs blieb gleich, als HOT Sites aus der Analyse eliminiert wurden (Zusätzliche Datei 5: Abbildung S3B). Die Prozentsätze der Überlappung für jede TF hingen von der Anzahl der Bindungsstellen ab und sind in zusätzlicher Datei 5: Abbildung S3C dargestellt. Unter den einzelnen TFs fanden wir, dass 69% der Condensin-II-Stellen und 53% der LIN-13-Stellen sich überlappten, was LIN-13 zur obersten TF machte, die sich signifikant mit Condensin II überlappte.

Die Bindung von Condensin II überlappt sich nicht zufällig mit Transkriptionsfaktoren, und die Expressionsanalyse legt eine repressive Funktion für Condensin II nahe. (A) Transkriptionsfaktorstellen aus modENCODE werden nach dem Faltengrad der Überlappung mit Condensin-Bindungsstellen eingestuft. Die Faltenanreicherung wird als das Verhältnis der prozentualen Überlappung der beobachteten im Vergleich zum Durchschnitt der zufälligen Verteilungen von Kondensationsstellen 10.000 Mal über das Genom bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kondensinbindung in Bezug auf TF-Bindungsstellen nicht zufällig ist. (B) Venn-Diagramme zeigen die Überlappung von Condensin-II-Bindungsstellen mit LIN-13 (modENCODE_3342, Embryonen) und LIN-35 (modENCODE_3925, späte Embryonen) (oben), nur mit LIN-13 (unten links) und nur mit LIN-35 (unten rechts). Der Anteil der Überlappung zwischen Condensin II und LIN-13 und LIN-35 ist an Stellen, die von beiden Proteinen besetzt sind, höher. Die angegebene Überlappung stellt die Anzahl der Kondensin-II-Peaks dar, die sich mit den jeweiligen LIN-13- und LIN-35-Stellen überlappen. (C) Die durchschnittliche ChIP-Seq-Anreicherung von Condensin II, LIN-13 und LIN-35 wird über den Gipfel jedes Condensin II-Peaks aufgetragen. Die Kondensin-II-Bindungsstellen sind in vier Gruppen unterteilt. Die oberste Gruppe besteht aus Kondensin-II-Bindungsstellen, die sich mit LIN-13 und LIN-35 überlappen, die zweite überlappt sich nur mit LIN-13, die dritte nur mit LIN-35 und die letzte Gruppe überlappt sich weder mit LIN-13 noch mit LIN-35. Die Peaks sind in abnehmender Reihenfolge basierend auf ihrer Chipanreicherung angeordnet. Eine große Anzahl von Kondensin-II-Stellen zeigt eine hohe LIN-13-Bindung, jedoch keine LIN-35-Bindung. Die Bindung von Condensin II ist an Stellen, die sowohl an LIN-13 als auch an LIN-35 gebunden sind, stärker. (D) Differentielle Expressionsanalyse (RNA-seq) in kle-2 null heterozygote versus homozygote Larvenstadium 2/3 (L2 / L3) Larven. Die Anteile der durch KLE-2 gebundenen oder ungebundenen Gene mit Zunahme oder Abnahme des Transkriptspiegels in der homozygoten Mutante sind gezeigt. Die Transkriptspiegel von proportional mehr Genen nehmen bei der kle-2-Mutante zu. TF, Transkriptionsfaktor.

Lin-13 hat ein Retinoblastom-Protein (pRb) -Interaktionsmotiv und Funktionen in der Vulvaentwicklung mit dem einzelnen pRb-Homolog LIN-35 in C. elegans . In D. melanogaster, Condensin II Untereinheit dCAPD3 Bindung an Chromatin wird bei pRb-Mutation reduziert . Wenn in C. elegans LIN-13 Condensin II über LIN-35 rekrutiert, sollten sich die LIN-13-Stellen, die ebenfalls an LIN-35 gebunden sind (576), stärker mit Condensin II überlappen als die LIN-13-Stellen, die nicht an LIN-35 gebunden sind (1,033). Die Überlappung von LIN-13- und LIN-35-Standorten mit Kondensin-II-Standorten war nur geringfügig höher als die von LIN-13-Standorten ohne LIN-35, 60% bzw. 50% (Abbildung 3B). Umgekehrt war die Überlappung von LIN-35 mit Condensin II an den Stellen, die ebenfalls an LIN-13 gebunden waren, höher (45%) als an ungebundenen Stellen (9%). Dies deutet darauf hin, dass die potenzielle Wechselwirkung zwischen LIN-13 und Condensin II größtenteils unabhängig von LIN-35 ist. LIN-35 funktioniert innerhalb eines konservierten Multiproteinkomplexes namens DRM in C. elegans (Huntington-Krankheit beim Menschen), der auch EFL-1 und DPL-1 enthält . Die 555 DRM-Bindungsstellen, die an LIN-13 gebunden waren, zeigten eine größere Überlappung mit Condensin II (63%) im Vergleich zu 787 DRM-Stellen, die nicht an LIN-13 gebunden waren (13%). Wir teilten die Kondensin-II-Stellen in vier Gruppen entsprechend der Bindungsstellenüberlappung mit LIN-13 und LIN-35 ein (Abbildung 3C). Diese Gruppierung zeigte, dass eine große Anzahl von Kondensin-II-Stellen eine hohe LIN-13-Bindung zeigt, aber nicht LIN-35, was darauf hindeutet, dass, wenn pRb-vermittelte Kondensin-II-Rekrutierung in konserviert wird C. elegans, LIN-35 kann von der Anwesenheit von LIN-13 für die Kondensin-II-Rekrutierung abhängen.

Die Mutation von Condensin II verursacht transkriptionelle Defekte, die auf eine repressive Funktion hindeuten

In Hefe und D. melanogaster wurde Condensin an der transkriptionellen Repression beteiligt . Eine kürzlich durchgeführte Studie in D. melanogaster zeigte, dass die CAPD3-Untereinheit Condensin II für die transkriptionelle Aktivierung eines Clusters antimikrobieller Peptidgene erforderlich ist . Um die Rolle von Condensin II bei der Transkriptionsregulation zu verstehen, führten wir RNA-seq in kle-2-Nullmutanten-L2 / L3-Larven durch. Maternal beladenes KLE-2 ermöglicht es der kle-2-Nullmutante (ok1151-Allel), zu sterilen Erwachsenen heranzuwachsen. Wir verglichen die Genexpression in heterozygoten und homozygoten kle-2-Mutanten in L2 / L3-Larven, bevor die Keimbahn proliferiert wird und somit fast ausschließlich Interphasenkerne enthält. Die differentielle Expressionsanalyse mit DESeq2 identifizierte 356 Gene, deren Expression bei Homozygoten im Vergleich zu heterozygoten Larven signifikant unterschiedlich war (Falschentdeckungsrate < 5%; DESeq2-Ergebnisse sind in zusätzlicher Datei 7: Tabelle S3 dargestellt). Die Mehrheit der differentiell exprimierten Gene erhöhte (70%) eher als verringert (30%) in der Expression. Die Analyse der Genontologie-Terme ergab keine bestimmte Gruppe von Genen, die von der KLE-2-Mutation betroffen waren. Ähnlich wie bei veröffentlichten Daten für Condensin IDC gab es keine direkte Korrelation zwischen KLE-2-Bindung und Veränderungen der Genexpression. Wichtig ist, dass unter den 46 differentiell exprimierten und KLE-2-gebundenen Genen 83% der Expression zunahmen, verglichen mit 67% von 310 Genen, die nicht an KLE-2 gebunden waren (Abbildung 3D), was darauf hindeutet, dass die direkte Wirkung der Kondensin-II-Bindung weitgehend repressiv ist.

Histonmodifikationen, die mit offenem Chromatin assoziiert sind, korrelieren positiv mit der Kondensationsbindung

Um den Chromatinkontext der Kondensationsbindung zu verstehen, analysierten wir die Beziehung zwischen Kondensationsbindungsstellen und Chromatinmerkmalen, die von modENCODE abgebildet wurden . Wir beobachteten eine allgemein positive Korrelation zwischen Kondensinbindung und Markierungen von aktivem Chromatin. In Hefe korreliert die Anzahl der Kondensinbindungsstellen während des gesamten Zellzyklus direkt mit der Chromosomenlänge. Die Anzahl der C. elegansin II-Bindungsstellen waren nicht proportional zur Chromosomenlänge (Abbildung 4A), korrelierten jedoch positiv mit der Länge der Chromosomen, die mit aktiven Histonmarken assoziiert waren (Abbildung 4B). Das X-Chromosom war eine Ausnahme, vielleicht aufgrund der Dosiskompensationsmechanismen, die sein Chromatin verändern . Die Bindung von Kondensin I-IDC und II über das Genom korrelierte positiv mit offenen Chromatinmarken wie H3K27ac und negativ mit Heterochromatinmarken wie H3K27me3 und H3K9me3 (Abbildung 4C und zusätzliche Datei 8: Abbildung S4). Diese Korrelation war auf domänenweiter Ebene (wie in 1-kb-Fenstern analysiert), da wir keine bestimmte Histonmodifikation sahen, die an Kondensationsstellen in einem Metagen-Analysetyp ihren Höhepunkt erreichte (Daten nicht gezeigt). In Immunfluoreszenzstudien überlappten sich Zentromerproteine mit der Kondensin-II-Bindung in mitotischen Zellen . Wir haben keine positive Korrelation zwischen CENP-A- und Condensin-II-ChIP-Seq-Signalen in Embryonen im gemischten Stadium beobachtet, was darauf hindeutet, dass es in Interphasenkernen (die meisten Kerne in Embryozellen im gemischten Stadium) keine Überlappung gibt. Da CENP-A pro Zelle nur an eine kleine Teilmenge der CENP-A-positiven Regionen im Genom bindet , ist die Überlappung von CENP-A mit Condensin II möglicherweise nur in einzelnen Zellen erkennbar. Um zu verstehen, welche Chromatinfaktoren die Kondensinbindung am besten vorhersagen, haben wir einen maschinellen Lernansatz verwendet. In C. elegans ist H4K20me1 über das X-Chromosom durch DCC stark angereichert , und daher war H4K20me1 der diskriminativste Faktor für die Kondensin-IDC-Bindung (Abbildung 4D). Für Condensin II sind H3K27ac und CBP, beide Marker für aktive Enhancer, sehr prädiktive Chromatinmerkmale, was darauf hindeutet, dass die Condensinbindung an aktiven Enhancern angereichert ist . Unter 201 Kondensin-II-Bindungsstellen, die 2 kb von einem annotierten TSS entfernt waren, überlappten sich 58 mit einer CBP-Bindungsstelle (P = 0,0002).

Chromatinfaktoren, die mit offenem Chromatin und Enhancern assoziiert sind, korrelieren positiv mit der Kondensationsbindung. (A) Die Anzahl der Kondensin-II-Peaks wird in Bezug auf die lineare Länge jedes Chromosoms aufgetragen. (B) Die Anzahl der Kondensin-II-Peaks wird gegen die Länge des Chromosoms aufgetragen, das von H4K8Ac- und H4K16Ac-Peaks bedeckt ist. Eine an autosomale Daten angepasste Trendlinie weist auf eine positive Korrelation hin (R2 = 0,9). (C) Die Kondensinbindung innerhalb von 1 kb zusammenhängenden Fenstern über das X-Chromosom (links) und Autosomen (rechts) korreliert positiv mit aktiven Markierungen (z. B. H3K27ac, H2A.Z) und negativ mit repressiven Markierungen (z. B. H3K27me3, H3K9me3). (D) Ein Ensemble-Klassifikator (Random Forests) wurde gelernt, um die Kondensinbindung im gesamten Genom vorherzusagen. Die Top 20 Features (von insgesamt 92 Features, Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1) mit der höchsten Vorhersagekraft sind für Condensin I-IDC (links) und Condensin II (rechts) mit dem wichtigsten Feature oben dargestellt. Die Merkmale werden basierend auf der mittleren Abnahme der Genauigkeit eingestuft, die die Differenz zwischen der Fehlerrate der tatsächlichen Klassifizierung und der Fehlerrate nach dem Permutieren des Merkmals beschreibt, gemittelt über alle Klassifikatoren (Bäume).

DNA-Sequenzmotive, die an Kondensin-Bindungsstellen angereichert sind, zeigen spezifische Merkmale

Obwohl Kondensin II an die Kondensin-I-IDC-Stellen auf dem X gebunden ist, hat Kondensin I-IDC nicht an die meisten autosomalen Kondensin-II-Bindungsstellen gebunden (Abbildung 1D). Um die Spezifität der Rekrutierung von Condensin IDC und II zu verstehen, suchten wir nach DNA-Sequenzmerkmalen, die die Bindung von Condensin II und Condensin IDC unterscheiden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Condensin IDC zuerst an ungefähr 100 Stellen rekrutiert wird und sich dann auf andere chromosomale Stellen ausbreitet . Ein 10 bp DNA-Sequenzmotiv wurde an den Condensin IDC-Rekrutierungsstellen angereichert (Abbildung 5A) und Mutation des Motivs führte zur Condensin IDC-Rekrutierung auf extrachromosomalen Arrays , was darauf hinweist, dass das Condensin IDC DNA-Sequenzmotiv eine wichtige Rolle bei der Condensin IDC-Rekrutierung spielt.

Wir fanden ein GCGC-haltiges DNA-Sequenzmotiv, das unter Condensin II-Bindungsstellen angereichert war (Abbildung 5A). Es ist interessant festzustellen, dass sowohl das Condensin II- als auch das Condensin IDC-Motiv den GCGC-Kern enthielten, das Condensin IDC-Motiv jedoch auf einer Seite durch AGGG erweitert wurde, was darauf hindeutet, dass die X-Spezifität der Condensin IDC-Rekrutierung durch Cofaktoren erreicht wird, die AGGG erkennen. Genomweit waren 11% der Condensin-II-Motive durch Condensin II. Ähnlich wie bei anderen TFs (zum Beispiel ) wurde daher nur ein Teil der potenziellen DNA-Sequenzmotive durch Condensin II. Andere Faktoren wie Chromatinzugänglichkeit und unbekannte Cofaktoren können an der Bindungsspezifität beteiligt sein. In der Tat, wenn wir diejenigen Motive nahmen, die in einem 2 kb-Fenster signifikant für eine aktive Histonmarke angereichert waren, wie H4K16ac, stieg der Prozentsatz der Motive, die gebunden waren, von 11% auf 29%. Ähnlich wie das IDC-Motiv von Condensin, das an den gebundenen Stellen stärker geclustert ist, fanden wir außerdem heraus, dass 1-kb-Genomfenster, die mehr als ein Condensin-II-Motiv enthielten, etwa 2,5-mal häufiger von Condensin II gebunden wurden als solche mit nur einem Motiv. Daher helfen Motivclustering und offener Chromatinkontext bei der Auswahl der gebundenen Motive.

Die chromosomale Rekrutierung von Condensin IDC und Condensin II umfasst sowohl gemeinsame als auch unterschiedliche Regulatoren. (A) Motivlogos von 10 bp DNA-Sequenzmotiven, die an den oberen Kondensationsstellen angereichert sind, sind gezeigt. (B) Überlappung zwischen Bindungsstellen von Condensin I-IDC, Condensin II und SCC-2 wird gezeigt. Zahlen unter jedem Faktor geben die Gesamtzahl der Bindungsstellen an. Überlappende Zahlen basieren auf der Anzahl der SCC-2-Peaks. (C) Browseransicht der University of California Santa Cruz (UCSC), die das SCC-2-ChIP-seq-Signal veranschaulicht, das hauptsächlich auf Promotoren beschränkt ist. (D) SCC-2- und Condensin-II-Bindung an einer gut definierten IDC-Rekrutierungsstelle für Condensin auf dem X (rex-1). (E) In der sdc-2-Nullmutante (TY1072) ist die Bindung von Condensin I-IDC (DPY-26), Condensin II (HCP-6, KLE-2) und SCC-2 an rex-2 vermindert (linkes Panel), bleibt aber auf Autosomen weitgehend ähnlich (rechtes Panel). (F) Boxplot des Verhältnisses der Chipanreicherung in der sdc-2-Mutante gegenüber dem Wildtyp innerhalb der Bindungsspitzen von SCC-2. Bindungsstellen werden als auf Autosomen klassifiziert, auf dem X mit geringer SDC-2-Bindung und hoher SDC-2-Bindung. (G) qPCR-Analyse der DPY-27-Chipanreicherung in Embryonen, die von Erwachsenen isoliert wurden, die mit Vektor (Kontrolle) und PQN-85-RNAi gefüttert wurden. Die Chipanreicherung wird als relativ zum negativen Kontrollort ausgedrückt. Fehlerbalken sind die Standardabweichungen von drei bis fünf biologischen Replikaten. ChIP, Chromatinimmunpräzipitation; DCC, Dosiskompensationskomplex.

Nicht alle Kondensin-II-Bindungsstellen weisen das Motiv auf. An diesen Kondensin-II-Stellen ohne Motiv können andere Faktoren für die Bindung verantwortlich sein. Alternativ kann der geringe Anteil an Condensin-II-Stellen (27%), die ein Motiv enthalten, durch eine mögliche Ausbreitung von Condensin II nach Rekrutierung erklärt werden. Es wird nicht erwartet, dass die Verbreitungsorte das Motiv enthalten. Zum Beispiel für condensin IDC, ein hoher Prozentsatz der potenziellen Rekrutierungsstellen (56%) enthalten das Motiv, aber nicht Standorte der Verbreitung (8%) . Eine systematische Analyse der Rekrutierungskapazität der identifizierten Condensin-II-Standorte ist erforderlich, um festzustellen, ob eine Ausbreitung vorliegt.

SDC-2 ist für die Bindung von Condensin I-IDC, Condensin II und dem Cohesin Loader an X-chromosomale DCC-Rekrutierungsstellen erforderlich

Bei Metazoen sind Proteine, die an der Condensin-Rekrutierung an Chromosomen beteiligt sind, nicht gut verstanden. In Hefe überschneidet sich die Kondensinbindung mit der des Cohesin-Beladungskomplexes Scc2 / 4, was die Kondensinassoziation mit Chromosomen erhöht . Um zu testen, ob die Überlappung mit Scc2 / 4 zwischen Hefe und C konserviert ist. elegans, führten wir ChIP-seq-Analyse von SCC-2 (auch bekannt als PQN-85) und festgestellt, dass eine bemerkenswerte 95% der SCC-2-Sites überlappt mit Condensin I-IDC auf dem Genom, und 60% mit Condensin II genomweite (Abbildung 5B). Die Überlappung blieb ähnlich, wenn HEIßE Regionen ausgeschlossen wurden (Zusätzliche Datei 9: Abbildung S5A). Nicht alle Kondensinstellen überlappten sich mit SCC-2, was darauf hindeutet, dass Kondensin im Gegensatz zu Hefe nicht von SCC-2 für die Bindung abhängt. Die SCC-2-Bindung war an Promotoren höher und korrelierte positiv mit der Transkription (Zusätzliche Datei 9: Abbildung S5B). Ein GAGA-haltiges DNA-Sequenzmotiv war in 58% der SCC-2-Bindungsstellen vorhanden (Zusätzliche Datei 9: Abbildung S5C). Im Gegensatz zu Drosophila Nipped-B und ähnlich wie S. cerevisiae Scc2 war die SCC-2-Bindung innerhalb transkribierter Regionen nicht hoch, blieb aber intergen (Abbildung 5C).

Eine fast vollständige Überlappung (96%) der Kondensin-II-Bindungsstellen mit Kondensin-I-IDC auf dem X-Chromosom unterstützt die Existenz gemeinsamer Mechanismen für die chromosomale Bindung verschiedener Kondensine. Da Condensin II und SCC-2 an Condensin IDC-Rekrutierungsstellen auf dem X gebunden sind (Abbildung 5D und zusätzliche Datei 9: Abbildung S5D) stellten wir die Hypothese auf, dass Condensin IDC-Recruiter auch Condensin II und SCC-2 rekrutieren. Hermaphrodit-spezifische Rekrutierung von Condensin IDC auf das X-Chromosom wird durch SDC-2, SDC-3 und DPY-30 erreicht . Wir führten HCP-6 und KLE-2 (Condensin II), DPY-26 (Condensin I-IDC) und SCC-2 ChIP-seq in sdc-2 Null-mutierten Embryonen durch. In der sdc-2-Mutante wurde die DPY-26-, HCP-6-, KLE-2- und SCC-2-Bindung an einer X-spezifischen Kondensin-IDC-Rekrutierungsstelle (rex-2) aufgehoben (Abbildung 5E). Es ist unklar, warum die Bindung von HCP-6 und KLE-2 an rex-2 vermindert war, anstatt einer autosomalen Kondensinstelle zu ähneln. Die SCC-2-Bindung an Autosomen und X-Chromosomenstellen, die von SDC-2 unabhängig sind, blieb in der sdc-2-Mutante im Vergleich zu Stellen, die von SDC-2 gebunden wurden, ähnlich (Abbildung 5F). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass SDC-2, die hermaphrodit-spezifische TF, die Condensin IDC auf das X-Chromosom rekrutiert, auch Condensin II und die Cohesin-Komplex-Untereinheit SCC-2 an denselben Stellen rekrutiert (Zusätzliche Datei 10: Abbildung S6). Frühere genetische Studien haben gezeigt, dass eine SDC-2-Nullmutation bei Männern keine embryonale Letalität verursacht, daher ist die Funktion von Condensin II und SCC-2 Rekrutierung durch SDC-2 ist für die allgemeine Chromosomenkondensation und -segregation nicht wesentlich . Es ist möglich, dass die Rekrutierung von SCC-2 und Condensin II durch SDC-2 eine hermaphrodit-spezifische genregulatorische Funktion hat.

Um zu testen, ob SCC-2 einen Einfluss auf die chromosomale Assoziation von Condensin IDC an der Rekrutierungsstelle hat, führten wir eine quantitative PCR-Analyse des DPY-27-Chips unter Kontrolle gegenüber SCC-2-Knockdown-Embryonen durch. Durch die Fütterung von RNAi konnten wir die SCC-2-Spiegel um ungefähr 80% senken (Zusätzliche Datei 9: Abbildung S5E). Beim SCC-2-Knockdown sahen wir keine signifikante Veränderung der DPY-27-Bindung an rex-1 oder Rex-2 (Abbildung 5G). Konsistent zeigte die Immunfluoreszenzanalyse der Bindung von Condensin I und II an meiotische Chromosomen keinen signifikanten Unterschied zwischen Wildtyp- und scc-2-Mutanten .