Getting CLARITY: Hydrogel-Prozess schafft transparentes Gehirn
CLARITY process: Interview mit Stanford Bioengineer und Psychiater Karl Deisseroth. Länge: 3:58
” Das Studium intakter Systeme mit dieser Art von molekularer Auflösung und globaler Reichweite – um die feinen Details und das Gesamtbild gleichzeitig sehen zu können — war ein großes unerfülltes Ziel in der Biologie und ein Ziel, das CLARITY zu erreichen beginnt “, sagte Deisseroth.
“Diese Leistung der chemischen Technik verspricht, die Art und Weise zu verändern, wie wir die Anatomie des Gehirns untersuchen und wie Krankheiten es verändern”, sagte Thomas Insel, MD, Direktor des National Institute of Mental Health. “Die eingehende Untersuchung unseres wichtigsten dreidimensionalen Organs wird nicht mehr durch zweidimensionale Methoden eingeschränkt.”
Intaktes erwachsenes Mausgehirn vor und nach dem zweitägigen CLARITY-Prozess. Im Bild rechts, Die feinen Gehirnstrukturen sind schwach als Unschärfebereiche über den Wörtern “Zahl,””unerforscht,” “Kontinent” und “erstreckt sich.”
Die Forschung in dieser Studie wurde in erster Linie an einem Mausgehirn durchgeführt, aber die Forscher haben STUDIEN an Zebrafischen und an konservierten menschlichen Gehirnproben mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt, um einen Weg für zukünftige Studien an menschlichen Proben und anderen Organismen zu finden.
“CLARITY verspricht, unser Verständnis davon zu revolutionieren, wie lokale und globale Veränderungen der Gehirnstruktur und -aktivität in Verhalten umgesetzt werden”, sagte Paul Frankland, PhD, leitender Wissenschaftler für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit am Hospital for Sick Children Research Institute in Toronto, der nicht an der Forschung beteiligt war. Franklands Kollegin, Senior Scientist Sheena Josselyn, PhD, fügte hinzu, dass der Prozess das Gehirn von “einer mysteriösen Black Box” in etwas im Wesentlichen Transparentes verwandeln könnte.
Ein unergründlicher Ort
Der Hügel der verschlungenen grauen Substanz und Verdrahtung, der das Gehirn ist, ist ein komplexer und unergründlicher Ort. Neurowissenschaftler haben sich bemüht, seine Schaltkreise vollständig zu verstehen, um zu verstehen, wie das Gehirn funktioniert und warum es manchmal nicht funktioniert.
Karl Deisseroth
CLARITY ist das Ergebnis einer Forschungsarbeit in Deisseroths Labor, um die opaken Elemente — insbesondere die Lipide — aus einem Gehirn zu extrahieren und dennoch die wichtigen Merkmale vollständig zu erhalten. Lipide sind Fettmoleküle, die im gesamten Gehirn und Körper vorkommen. Insbesondere im Gehirn helfen sie bei der Bildung von Zellmembranen und geben dem Gehirn einen Großteil seiner Struktur. Lipide stellen jedoch eine doppelte Herausforderung für biologische Studien dar, da sie das Gehirn sowohl für Chemikalien als auch für Licht weitgehend undurchlässig machen.
Neurowissenschaftler hätten die Lipide gerne extrahiert, um die feine Struktur des Gehirns zu enthüllen, ohne sie zu schneiden oder zu schneiden, aber mit einem großen Problem: Wenn diese strukturell wichtigen Moleküle entfernt werden, fällt das verbleibende Gewebe auseinander.
Frühere Untersuchungen konzentrierten sich stattdessen auf die Automatisierung des Slicing / Sectioning-Ansatzes oder auf die Behandlung des Gehirns mit organischen Molekülen, die nur das Eindringen von Licht erleichtern, jedoch keine makromolekularen Sonden. Mit KLARHEIT hat Deisseroths Team einen grundlegend anderen Ansatz gewählt.
“Wir nutzten die chemische Technik, um biologisches Gewebe in einen neuen Zustand zu verwandeln, der intakt, aber optisch transparent und durchlässig für Makromoleküle ist”, sagte Chung, der Erstautor des Papiers.
Diese neue Form entsteht, indem die Lipide des Gehirns durch ein Hydrogel ersetzt werden. Das Hydrogel wird aus dem Gehirn selbst in einem Prozess aufgebaut, der der Versteinerung konzeptionell ähnlich ist, wobei zunächst eine wässrige Suspension von kurzen, einzelnen Molekülen verwendet wird, die als Hydrogelmonomere bekannt sind. Das intakte, postmortale Gehirn wird in die Hydrogellösung eingetaucht, und die Monomere infundieren das Gewebe. Wenn sie dann “thermisch ausgelöst” oder leicht auf etwa Körpertemperatur erhitzt werden, beginnen die Monomere zu langen Molekülketten zu erstarren, die als Polymere bekannt sind und ein Netz im gesamten Gehirn bilden. Dieses Netz hält alles zusammen, bindet aber vor allem nicht an die Lipide.
Wenn das Gewebe auf diese Weise gestützt ist, ist das Team in der Lage, Lipide durch einen Prozess namens Elektrophorese kräftig und schnell zu extrahieren. Was bleibt, ist ein 3-D, transparentes Gehirn mit all seinen wichtigen Strukturen – Neuronen, Axone, Dendriten, Synapsen, Proteine, Nukleinsäuren und so weiter – intakt und an Ort und Stelle.
Dinge besser machen
KLARHEIT geht dann besser. Durch die Erhaltung der vollen Kontinuität neuronaler Strukturen ermöglicht CLARITY nicht nur die Verfolgung einzelner neuronaler Verbindungen über große Entfernungen durch das Gehirn, sondern bietet auch eine Möglichkeit, reichhaltige molekulare Informationen zu sammeln, die die Funktion einer Zelle beschreiben, die mit anderen Methoden nicht möglich ist.
“Wir dachten, wenn wir die Lipide zerstörungsfrei entfernen könnten, könnten wir sowohl Licht als auch Makromoleküle tief in das Gewebe eindringen lassen, was nicht nur eine 3D-Bildgebung, sondern auch eine 3D-Molekülanalyse des intakten Gehirns ermöglicht”, sagte Deisseroth, der die DH Chen-Professur innehat.
Mit fluoreszierenden Antikörpern, von denen bekannt ist, dass sie nur bestimmte Proteine suchen und sich daran anlagern, zeigte Deisseroths Team, dass es bestimmte Strukturen innerhalb des CLARITY-modifizierten — oder “geklärten” — Mausgehirns anvisieren und diese Strukturen und nur diese Strukturen unter Beleuchtung zum Leuchten bringen kann. Die Forscher können neuronale Schaltkreise durch das gesamte Gehirn verfolgen oder die Nuancen der lokalen Schaltungsverdrahtung tief erforschen. Sie können die Beziehungen zwischen Zellen sehen und subzelluläre Strukturen untersuchen. Sie können sogar chemische Beziehungen von Proteinkomplexen, Nukleinsäuren und Neurotransmittern untersuchen.
Eine dreidimensionale Darstellung des Gehirns von unten (ventrale Hälfte). Ein Fly-Through-Video von Nagetier Gehirn ist hier verfügbar.
” In der Lage zu sein, die molekulare Struktur verschiedener Zellen und ihre Kontakte durch Antikörperfärbung zu bestimmen, ist eine Kernkompetenz der KLARHEIT, getrennt von der optischen Transparenz, die es uns ermöglicht, Beziehungen zwischen Gehirnkomponenten auf grundlegend neue Weise zu visualisieren “, sagte Deisseroth, einer von 15 Experten im “Dream Team”, das Ziele für die 100 Millionen Dollar teure Hirnforschungsinitiative festlegen wird, die Präsident Obama am 2. April angekündigt hat.
Und in einer weiteren bedeutenden Fähigkeit aus Forschungssicht sind Forscher nun in der Lage, das geklärte Gehirn zu zerstören, die fluoreszierenden Antikörper auszuspülen und den Färbeprozess erneut mit verschiedenen Antikörpern zu wiederholen, um verschiedene molekulare Ziele im selben Gehirn zu erforschen. Dieser Färbe- / Entfärbungsprozess kann mehrmals wiederholt werden, zeigten die Autoren, und die verschiedenen Datensätze stimmten aufeinander ab.
Öffnen der Tür
CLARITY hat es demnach ermöglicht, sehr detaillierte, feinstrukturelle Analysen an intakten Gehirnen durchzuführen – sogar an menschlichen Geweben, die seit vielen Jahren konserviert sind, zeigte das Team. Die Umwandlung menschlicher Gehirne in transparente, aber stabile Proben mit zugänglicher Verkabelung und molekularen Details kann zu einem besseren Verständnis der strukturellen Grundlagen von Gehirnfunktion und -krankheit führen.
Dreidimensionale Ansicht des gefärbten Hippocampus mit fluoreszenz-exprimierenden Neuronen (grün), verbindenden Interneuronen (rot) und unterstützenden Glia (blau).
Über den unmittelbaren und offensichtlichen Nutzen für die Neurowissenschaften hinaus warnte Deisseroth, dass die KLARHEIT unsere Fähigkeit, mit den Daten umzugehen, übertroffen habe. “Die Umwandlung großer Datenmengen in nützliche Erkenntnisse stellt immense Rechenherausforderungen dar, die angegangen werden müssen. Wir müssen verbesserte computergestützte Ansätze für Bildsegmentierung, 3D-Bildregistrierung, automatisierte Verfolgung und Bilderfassung entwickeln “, sagte er.
In der Tat wird dieser Druck zunehmen, da KLARHEIT beginnen könnte, ein tieferes Verständnis von großen intakten biologischen Systemen und Organen, vielleicht sogar ganzen Organismen, zu unterstützen.
“Von besonderem Interesse für zukünftige Studien sind Intrasystembeziehungen, nicht nur im Gehirn von Säugetieren, sondern auch in anderen Geweben oder Krankheiten, für die ein vollständiges Verständnis nur möglich ist, wenn eine gründliche Analyse einzelner intakter Systeme durchgeführt werden kann”, sagte Deisseroth. “KLARHEIT kann auf jedes biologische System anwendbar sein, und es wird interessant sein zu sehen, wie andere Zweige der Biologie es nutzen können.”
Weitere Co-Autoren sind die Studentin Jenelle Wallace; doktorandensung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin und Logan Grosenick; Forschungsassistenten Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak und Charu Ramakrishnan; Postdoktoranden Aaron Andalman, PhD, und Tom Davidson, PhD; ehemalige Studentin Hannah Bernstein; und ehemalige Mitarbeiterin Viviana Gradinaru.
Die Forschung wurde vom National Institute of Mental Health (Grant MH099647) unterstützt; die National Science Foundation; die Simons Foundation; der Präsident und Propst der Stanford University; die Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby und Yu Stiftungen; das DARPA REPAIR Program; und der Burroughs Wellcome Fund.
Stanfords Department of Bioengineering unterstützte die Arbeit ebenfalls. Die Abteilung wird gemeinsam von der School of Engineering und der School of Medicine betrieben.
