a) a chlamydomonas reinhardtii szexuális életciklusa áll… / Töltse Le A Tudományos Diagramot

… a genetikai anyagok természete, amelyek szembeszálltak Mendel törvényével. Az elmúlt évszázadban végzett kiterjedt vizsgálatok, számos technikával, beleértve az elektronmikroszkópiát, a genetikát, a molekuláris biológiát és a biokémiát, kimutatták, hogy a genetikai anyagok valójában genomok a kloroplasztokban és a mitokondriumokban (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Úgy gondolják, hogy a kloroplasztok (CP) és a mitokondriumok (mt) a sejtmagos sejtek és a szabadon élő baktériumok-cianobaktériumok és alfa – lila baktériumok-közötti ősi endoszimbiotikus kapcsolatokból származnak. Saját genomjukat tartalmazzák, amelyek feltehetően őseik maradványai (Gray 1992). Ma már tudjuk, hogy a cp és mt gének kizárólag az anyai szülőktől származnak az utódoknak a magasabb rendű növények, páfrányok, mohák, algák (Kuroiwa 1991), gombák (Mitchell and Mitchell 1952; Kawano et al. 1987) és az állatok (Hutchison et al. 1974), beleértve az embereket is. A cp/mt genomok egyszülős öröklődését sokáig passzív eredménynek gondolták, azon a tényen alapulva, hogy a tojások több számú organellát tartalmaznak, míg a hím ivarsejtek legjobb esetben csak néhányat járulnak hozzá (Gyllensten et al. 1991). Az egyszülős öröklés folyamata azonban valószínűleg dinamikusabb lesz. Klasszikus és feltűnő példa lenne a nem Mendeli öröklés előfordulása az egysejtű zöld algákban, a Chlamydomonas reinhardtii-ban, amely azonos méretű ivarsejteket termel (izogám) (Sager 1954). A C életciklusa.reinhardtii rendkívül egyszerű. A C. reinhardtii két párzási típusa van, a párzási Típus Plusz (mt+) és a párzási típus mínusz (mt), amelyeket egyetlen komplex párzási típus vezérel loci a VI. 2002). C. reinhardtii szexuális életcikluson megy keresztül, amely magában foglalja a differenciálás meghatározott szakaszait (1.ábra). A vegetatív sejtek nitrogén éhezés és fénysugárzás esetén differenciálódnak ivarsejtekké (Pan et al. 1996). A keveréstől számított néhány percen belül az ellentétes párzási típusok ivarsejtjei egymáshoz tapadnak a flagellájukkal, és összeolvadnak, hogy zigótákat képezzenek. A kötelező nyugalmi időszak után a zigóta meiózison és csírázáson megy keresztül, hogy négy haploid utódot hozzon létre. A kialakult utódok több mint 90% – a kloroplaszt (cp) tulajdonságokat örököl, elsősorban az mt + szülőtől, ezt a jelenséget először több mint 50 évvel ezelőtt írták le (Sager 1954). Sager két UV-indukált mutáció öröklődési mintázatát írta le, az sr1-et és az sr2-t . Az sr1 mutáció rezisztenciát biztosít a sztreptomicin antibiotikum alacsony szintjével szemben, az sr2 mutáció pedig rezisztenciát biztosít a sztreptomicin magas szintjével szemben. Amikor az sr1-et sztreptomicin-érzékeny törzsre keresztezték, a sztreptomicin-rezisztencia alacsony szintje öröklődött, Mendel törvényét követve. Ezzel szemben, amikor az sr2 mutációt hordozó mt+ szülőt érzékeny mt – szülővé keresztezték, az összes meiotikus utód rezisztens volt a magas szintű sztreptomicinnel szemben. A kölcsönös keresztben a meiotikus utódok mind sztreptomicin-érzékenyek voltak (Sager 1954). 1962-ben a cpdns létezését ris és Plaut fény-és elektronmikroszkópos munkája bizonyította (Ris and Plaut 1962). Csak egy évvel később Sager és Ishida leírták a cpdns izolálását cézium-klorid (CsCl) sűrűséggradiens centrifugálással (Sager és Ishida 1963). 1989-ben kimutatták, hogy az sr2 mutáció a cp Genom rps12 génjén belül lokalizálódik (Liu et al. 1989). 1972 – ben egy biokémiai vizsgálat kimutatta, hogy az mt-cpdns mennyisége csökkent az mt + cpdns-hez képest, 6-24 órával a párzás után (Sager and Lane 1972). Az mt+ és az mt – ivarsejtekből származó DNS – t 14 N – vagy 15 NH 4 Cl-vel jelöltük, és CsCl sűrűséggradiens centrifugálással figyeltük meg a nukleáris DNS és cpdns sorsát a 6-és 24-órás zigótákban. Hat órával a zigóta fejlődése után az mt – cpdns-t képviselő jel egyértelműen alacsonyabb volt, mint az mt+ cpdns, ami az mt – cpdns preferenciális csökkenését jelzi az mt+ cpdns-hez képest. 1980 – ban az mt-cpdns preferenciális redukciójának első molekuláris bizonyítékát Grant et al. (Grant et al. 1980). A szerzők az mt+ és az mt – cpdns viselkedését figyelték meg, kihasználva a restrikciós fragmentum hosszúságú polimorfizmusokat (RFLP-k) egy C. reinhardtii mutáns AC-u-g-23 törzsben, amely két kis deléciót hordoz a kloroplaszt DNS-ben. A szerzők megállapították, hogy mind a cpdns deléciói, mind a nem fotoszintetikus fenotípus egyszülőn öröklődtek. A C. reinhardtii 203 kb-os kloroplaszt genomja (Maul et al. 2002) sejtenként ~80-100 példányban van jelen, és 5-10 DNS–fehérje komplexbe szerveződik, amelyeket kloroplaszt nukleoidoknak neveznek (Kuroiwa et al. 1981). 1982-ben Kuroiwa et al. megállapította, hogy a dapi (dsDNS-specifikus fluorokróm,4′, 6-diamidino-2-fenilindol) – festett mt-cp nukleoidok előnyösen eltűntek a fiatal zigótákban a párzástól számított 50 percen belül (Kuroiwa et al. 1982). 1999 – ben az mt-cp nukleoidok preferenciális eltűnését figyelték meg egy élő zigótában, SYBR Green I (dsDNS-specifikus fluorokróm, amely áthatolhat az élő sejtekbe) alkalmazásával (1.ábra) (Nishimura et al. 1999). Ennek a drámai jelenségnek az értelmezése azonban ellentmondásos volt, mivel a fluoreszcens Mt – cp nukleoidok preferenciális eltűnése jóval azelőtt történt, hogy a DNS redukcióját biokémiai vagy molekuláris biológiai módszerekkel detektálták volna (6-24 órával a párzás után) (Sager and Lane 1972). Ennek magyarázatára két elsődleges lehetőséget javasoltak. Az egyik lehetőség az volt, hogy a CP nukleoidok szétesése a cpdns molekulák diszperziójához vezethet, a második lehetőség pedig az volt, hogy a cpdns molekulák gyors emésztése a cpdns nukleoidok eltűnéséhez vezethet. Ennek a kérdésnek az egyik problémája az, hogy a párzási reakciót millió mt+ és mt – ivarsejt felhasználásával hajtják végre (2.ábra). A sejtpopuláció elkerülhetetlenül a sejtek heterogén keveréke, mint például a nem párosított mt+ és mt – ivarsejtek, mt – CP nukleoidokkal vagy anélkül rendelkező zigóták és kivételes meitotikus zigóták (1~5%), amelyek nem alkotnak meitotikus zigótákat (Ebersold 1967). Általában a molekuláris és biokémiai módszerek nagy mennyiségű homogén mintát igényelnek a pontos elemzésekhez, és a minták bármilyen heterogenitása megzavarná az eredményeket. Más szavakkal, az egyes sejtek vagy organellák” személyisége ” egy populáción belül hígulna, és valószínűleg elveszne az elemzések során. Másrészt a mikroszkópia morfológiai szinten felfedheti a “személyiségeket”, de molekuláris szinten nem. A cpdns molekulák állapotának tanulmányozásához az mt – cp nukleoidok eltűnése során zigótákat kellett gyűjteni az mt – cp nukleoidok jelenléte vagy hiánya alapján, valamint az egyes zigótákat molekuláris biológiai technikákkal elemezni. Ennek eléréséhez optikai csipeszeket alkalmaztak (3.ábra). Az optikai csipeszek használata újszerű technika az élő sejtek vagy organellák közvetlen mikroszkópos megfigyelés alatt történő manipulálására (Ashkin et al. 1987). Ebben a vizsgálatban egyetlen zigótát gyűjtöttünk CP nukleoidokkal vagy anélkül optikai csipesszel, és az mt – cpdns molekulák jelenlétét vagy hiányát beágyazott PCR analízissel határoztuk meg. Az mt+ és az mt – zigotikus cpdns egyéni sorsát külön-külön követték egy kloroplaszt transzformáns LO3c-vel , amely az Aada (aminoglikozid adenil-transzferáz) baktériumgént tartalmazza. Az optikai csipesszel kapott egyetlen zigótákat nagyon érzékenynek vetettük alá beágyazott-PCR elemzés az aadA számára(4.ábra) (Nishimura et al. 1999). Amikor az L03c mt + ivarsejteket vad típusú mt-ivarsejtekkel keresztezték, az összes vizsgált zigótában Aada génszekvenciákat detektáltak. Éppen ellenkezőleg, amikor az L03c mt – ivarsejteket vad típusú ivarsejtekkel keresztezték, az Aada szekvenciákat csak fiatalabb zigótákban erősítették meg (10 és 30 perccel a zigóta kialakulása után). Miután a fluoreszcens Mt-cp nukleoidok eltűntek, az aadA szekvenciák már nem voltak kimutathatók a zigótákban (90 és 120 perccel a zigóta kialakulása után). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az mt – cpdns molekulák 10 perc alatt teljesen emészthetők, amelynek során az mt – cp nukleoidok eltűnnek, valamint hogy legalább egy nagyon hatékony nukleáz aktiválódik az mt – kloroplasztban közvetlenül a zigóta kialakulása után. Az mt-cpdns ezen aktív emésztése valószínűleg a cpdns anyai öröklődésének alapja. A cpdns egyszülős öröklődésének legegyszerűbb modellje az, hogy a folyamat két különálló eseményből áll, amelyek valószínűleg az életciklus különböző szakaszaiban fordulnak elő: az mt+ cpdns “védelme”, talán a gametogenezis során, és a védtelen mt – cpdns “pusztítója” a korai zigóta fejlődés során. A) restrikciós metilációs hipotézis 1972 – ben Sager és munkatársai azt javasolták, hogy az mt – cpdns-t restrikciós enzimek hatására emésztjük meg, míg az mt+ cpdns-t metilációval védjük-a bakteriális restrikciós metilációs rendszerhez hasonló modell (Sager and Lane 1972). Sager és munkatársai gyorsan meggyőző bizonyítékokat gyűjtöttek, amelyek az mt+ cpdns metilációs szintjének növekedését mutatják, amelyet a párzás után 7 órával észleltek (Burton et al. 1979; Royer és Sager 1979; Sano et al. 1980). Továbbá beszámoltak mt+ ivarsejt-specifikus DNS-metiltranszferázok 60 kDa és 20 kDa molekulatömegű tisztításáról (Sano et al. 1981). Ez az mt + ivarsejt-specifikus metilációs esemény nyilvánvalóan reverzibilis volt, amint az a védelem szempontjából várható volt (Sano et al. 1984). A kloroplaszt-rezidens DNS-metiltranszferáz génjét végül 2002-ben azonosították, és mt+ ivarsejt-specifikus expresszióját és kloroplaszt lokalizációját megerősítették (Nishiyama et al. 2002). Másrészt a független csoportok egy sor dokumentuma ezt követően azzal érvelt, hogy az mt+ cpdns metilezése nem magyarázza meg megfelelően a védelmet. Bolen et al. izolált egy nukleáris mutáns me1, amely konstitutívan metilálja a cpdns – t magasabb szinten mind az mt+, mind az mt-sejtekben (Bolen et al. 1982). Amikor az me1 ivarsejteket keresztezésre használták, normális uniparental öröklődési mintákat figyeltek meg, nem egyeztethető össze a …