a Caenorhabditis elegans

Kondenzinkötésének genomszintű elemzése Caenorhabditis elegansban

az I. és II.Kondenzinek a MIX-1 és SMC-4 két SMC alegységben osztoznak, és három nem SMC alegységgel különböztetik meg őket (1a. ábra). A kondenzin IDC csak egy alegységgel, az SMC-4 dpy-27 változattal különbözik a kondenzin I-től. Minden kondenzin alegység ellen egy vagy két különböző antitestet használtunk a ChIP-seq-hoz, és azonosítottuk azokat a kötőhelyeket, amelyek több antitestben és biológiai replikációban gyakoriak (további fájl 1: S1 táblázat). A kondenzin holokomplexből származó antitest validációt és várható koimmunprecipitációs kölcsönhatásokat a 2. Kiegészítő fájl tartalmazza. A medián ChIP-dúsítási pontszámok páros korrelációja a fürtözött kondenzin I-IDC és II alegységek külön-külön, megerősítve az egyes alegységek eloszlását a három kondenzin típus között (1b ábra).

a három kondenzin komplex nagy felbontású kötési mintái hasonlóak

C. az elegans kondenzin I-nek és II-nek részben átfedő , de eltérő kromoszómális lokalizációja van a mitózisban és a meiózisban, és a kondenzin IDC kifejezetten az X-re irányul . Ezért arra számítottunk, hogy különböző ChIP-seq mintákat találunk a kondenzin I, IDC és II esetében. ehelyett a kondenzin I, IDC és II alegységek kötési mintái általában hasonlóak voltak (1C ábra). Ez a hasonlóság nem az antitest keresztreaktivitásának volt köszönhető, mivel a HCP – 6 antitest, amely nem mutat keresztreaktivitást és nem immunprecipitál semmilyen kondenzin I-IDC alegységet , kiterjedt co-lokalizációt mutatott a kondenzin I-IDC alegységekkel (lásd HCP-6 az 1C.ábrán). Ezenkívül, ha a II kondenzin átfedése a kondenzin IDC-vel való keresztreaktivitásnak köszönhető, akkor a II kondenzin kötőhelyeinek dúsulását vártuk volna az X-en, ami nem így volt (1D ábra). A kondenzin II-hez képest a kondenzin IDC alegységeknek következetesen magasabb volt a ChIP pontszáma az X-en, ami arra utal, hogy a két kondenzin komplex kromoszóma-asszociációja különbözik a ChIP által rögzített módon (vegye figyelembe az X és az I kromoszóma különböző skáláit az 1C ábrán). Mivel ChIP-seq-t végeztünk vegyes stádiumú embriókban, a sejtek többsége (több mint 95%-a 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) festéssel becsülhető) interfázisban volt. A kondenzin I alegységek hiánya az autoszómákon (1C Ábra és további Fájl 3: S1A ábra) és az előző megfigyelés, miszerint a kondenzin I a mitotikus kromoszómákra lokalizálódik a magburok lebontása után, arra utal, hogy a ChIP-seq jel nagy része interfázisból származik. Ennek alátámasztására kimutatták, hogy a kondenzin II az interfázis során nukleáris, és a kötő helyek egyenlőbb eloszlását mutatta az összes kromoszóma között (1D ábra).

a KLE-2, a HCP-6 és a CAPG-2 kondenzin II specifikusak, így kondenzin II kötődést jelentenek. A kondenzin I és az IDC mindhárom nem SMC alegységet megosztja, ezért a továbbiakban a Dpy-26, A DPY-28 és a CAPG-1 ChIP-seq jelére utalunk, mint a kondenzin I-IDC-re. Ahhoz, hogy a komplexként kötött helyekre összpontosítsunk, átlagoltuk a Kondenzin típusú specifikus CAP alegységek Chipjelét. Az átlagolt adatok használata mellett ellenőriztük, hogy minden elemzés igaz-e egyetlen alegységgel, és a HCP-6-ot és a DPY-28-at kiegészítő számadatokkal mutatjuk be. Nagy megbízhatóságú kondenzin I-IDC és II kötőhelyeket azonosítottunk úgy, hogy csak azokat a ChIP-seq csúcsokat választottuk ki, amelyek konzisztensek voltak két vagy több nem SMC alegységben (1D ábra). Mint korábban megjegyeztük, a kondenzin I-IDC kötésének 97% – a az X kromoszómán történt . A kondenzin II hasonlóan oszlott meg az autoszómák és az X. Kondenzin II között, amely erősebb kondenzin I-IDC helyekhez kötődik az X kromoszómán (1e Ábra és további 3.Fájl: S1B ábra).

a Kondenzinkötő helyek aktív promotereknél dúsulnak

azon régiók azonosítása érdekében, ahol a kondenzinek előnyösen kötődnek, elemeztük a kondenzinkötő helyeket több genomi annotáció tekintetében. A kondenzinkötő helyek szignifikánsan dúsultak a promotereknél, a tRNS gének közelében és a nem kódoló RNS-eknél (2a.ábra, 4. Kiegészítő fájl: S2. ábra). Annak elkerülése érdekében, hogy a kondenzinhez kötött tRNS gének csak a promotereknél forduljanak elő, eltávolítottuk azokat a tRNS géneket, amelyek a transzkripciós kezdő helytől (TSS) 1 kb-on belül voltak, és megállapítottuk, hogy a tRNS és a kondenzin kötő helyek átfedése továbbra is jelentős (a tRNS-ek 23% – a, illetve 6% – a átfedésben van a kondenzin I-IDC és II helyekkel, p = 0,0002). A tRNS gének kondenzinkötődése arra utal, hogy a TFIIIC által közvetített kondenzin-toborzás konzerválható a C. elegans és az élesztő között .

a Kondenzin helyek a promotereknél és a tRNS-eknél dúsulnak, és a kötődés pozitív korrelációt mutat a transzkripcióval. (A) A kondenzinkötő helyek dúsítása vagy kimerülése különböző genomikai jelölésekkel történik. A véletlen dúsítást és a p-értékeket egy permutációs teszttel számítottuk ki, amely véletlenszerűen elosztotta a kondenzin csúcsokat 10 000-szer. Mind az I-IDC, mind a II kondenzin esetében a kötőhelyek jelentősen dúsulnak 1 kb-os promotereknél és a nem kódoló RNS-ek közelében (P = 0.0002), a géntesteken belüli kimerülés (transzkripciós kezdő hely (TSS) a transzkripciós véghelyre (TES)) (P = 0,0002), és nincs jelentős dúsítás vagy kimerülés a 3′ géneknél (P > 0,05). (B) A Kondenzin ChIP jel az expresszált gének TSSs-jéhez igazodik (felső 25% az RNS szintjén, folytonos vonalak) és nem expresszált gének (alsó 25% az RNS szintjén, szaggatott vonalak). A környező pontok a 95% – os megbízhatósági szintet képviselik. Kontrollként az immunglobulin G (IgG) ChIP jelet a TSSs-nél szürke színnel ábrázoljuk. (C) Spearman rangkorrelációs koefficiens az 500 bp promoterek medián ChIP-pontszáma és a megfelelő gének RNS-szintje között a teljes genomra és az X kromoszómára vonatkozik. Enyhe pozitív korreláció van a kondenzinkötés és a transzkripció között. (D) medián ChIP pontszám 500 bp-n belül a TSS-től felfelé ábrázoljuk az egyes gének RNS-szintjével szemben. A kondenzin promoterhez kötött gének (amelyeket a TSS-től 1 kb-on belüli kondenzin hely átfedésével határoznak meg) narancssárga (kondenzin I-IDC) és kék (kondenzin II) színnel vannak kiemelve. E) az 50 bp-os ablakok GC-tartalmát a kondenzin I-IDC és II kötési csúcsokon ábrázolják. Kontrollként az 1500 véletlenszerű koordináta feletti GC-tartalmat ugyanúgy határoztuk meg és ábrázoltuk, mint a tényleges kondenzin-csúcsokat. Az átlagos GC-tartalom magas a kondenzinkötés csúcsa körül.

a kötődés a TSS-től számított 500 bp-n belül volt a legmagasabb (további 5.Fájl: S3A Ábra), és a kondenzin I-IDC 45% – A és a kondenzin II csúcsok 62% – a A promotereknél helyezkedett el. A promoterek kondenzinkötése pozitív korrelációt mutatott a downstream gén transzkripciós aktivitásával (2b., C. ábra), de nem minden aktív promoter volt kötve (2D. ábra). A kötött promoterek gén ontológiai term analízise enyhe (1,3-szeres), de szignifikáns (P = 3,5 e-17) dúsítást mutatott az embriófejlődési funkcióval rendelkező gének esetében (kiegészítő fájl 6: S2 táblázat). Az erősen expresszált gének körülbelül 20%-ánál (az RNS szintjén a felső kvartilis) a kondenzin II kötőhelye 1 kb-on belül, az X kromoszóma gének körülbelül 70% – ánál pedig a kondenzin I-IDC kötőhelye 1 kb-on belül volt. Ezért, bár a transzkripciós aktivitás fontos, nem elegendő megmagyarázni a kondenzin kötődés specifitását bizonyos promotereknél.

megfigyeltük, hogy minden kondenzinkötő hely a GC-tartalom kiemelkedő dúsulását mutatta a környező régiókhoz és a véletlenszerű koordinátákhoz képest (2e ábra). A C. elegans-ban az X kromoszóma-promoterek GC-tartalma magasabb, mint az autoszomális promotereké . Lehetséges, hogy a magasabb GC-tartalom a kondenzinkötés DNS-szekvenciájának jellemzője, és az X-promoterek úgy fejlődtek ki, hogy magasabb GC-tartalmat tartalmazzanak a kondenzin IDC-kötésének támogatására.

a Kondenzinkötő helyek szignifikánsan egybeesnek a

transzkripciós faktorok egy részhalmazával a kondenzinhez kötött promotereket megkülönböztető további tényezők meghatározásához összehasonlítottuk a kondenzin és a TF kötő helyeket, és találtunk egy TFS részhalmazt, amely ugyanazokhoz a promoterekhez kötődik, mint a kondenzinek (3a.ábra). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy több TF kötődik egy sor magas kihasználtságú kötőhelyhez (forró) . A KONDENZIN I-IDC és a kondenzin II helyek 5% – os, illetve 22% – os átfedése volt a forró helyekkel (P = 0,0002). A TFs-sel való átfedés jelentősége változatlan maradt, amikor a forró helyeket kizárták az elemzésből (5.Kiegészítő fájl: S3B ábra). Az egyes TF-ek átfedésének százalékos aránya a kötőhelyek számától függött, és az 5. további fájlban látható: S3C ábra.az egyes TF-ek között azt találtuk, hogy a kondenzin II-helyek 69% – A és a LIN-13-helyek 53% – a átfedésben van egymással, így a LIN-13 a legfontosabb TF, amely jelentősen átfedésben van a kondenzin II-vel.

a Kondenzin II kötés átfedésben van a transzkripciós faktorokkal nem véletlenszerűen, és az expressziós elemzés a kondenzin II elnyomó funkcióját sugallja. a) A modENCODE transzkripciós faktor helyeit a kondenzin kötőhelyekkel való átfedés dúsítása alapján rangsorolják. A hajtás dúsítását a megfigyelt százalékos átfedés arányaként határozzuk meg, szemben a kondenzin helyek véletlenszerű eloszlásának átlagával 10 000-szer a genomban. Az eredmények azt mutatják, hogy a kondenzinkötés nem véletlenszerű a TF kötőhelyek tekintetében. B) a Venn-diagramok a kondenzin II kötőhelyeinek átfedését mutatják a LIN-13-mal (modENCODE_3342, embriók) és a LIN-35-tel (modENCODE_3925, késői embriók) (felül), csak a LIN-13-mal (bal alsó rész) és csak a LIN-35-tel (jobb alsó rész). A kondenzin II és a Lin-13 és a LIN-35 közötti átfedés aránya nagyobb a két fehérje által elfoglalt helyeken. A megadott átfedés a megfelelő Lin-13 és LIN-35 helyekkel átfedő kondenzin II csúcsok számát jelenti. C) A Kondenzin II-ből, LIN-13-ból és LIN-35-ből származó átlagos ChIP-seq dúsítást az egyes kondenzin II-csúcsok csúcsán ábrázoljuk. A kondenzin II kötőhelyek négy csoportra oszthatók. A felső csoport a Lin-13-mal és a LIN-35-tel átfedő kondenzin II kötőhelyekből áll, a második csak a LIN-13-mal, a harmadik csak a LIN-35-tel, az utolsó csoport pedig nem fedi át sem a LIN-13-mal, sem a LIN-35-tel. A csúcsok csökkenő sorrendben vannak a ChIP dúsításuk alapján. A kondenzin II helyek nagy száma magas Lin-13, de nem Lin-35, kötés. A kondenzin II kötés erősebb mind a LIN-13, mind a LIN-35 által kötött helyeken. (D) differenciál expressziós elemzés (RNS-seq) a kle-2 null heterozigóta versus homozigóta lárva stádiumú 2/3 (L2/L3) lárvákban. A homozigóta mutáns transzkriptumszintjének növekedésével vagy csökkenésével a kle-2 által kötött vagy nem kötött gének aránya látható. Az arányosan több gén transzkriptumszintje növekszik a kle-2 mutánsban. TF, transzkripciós faktor.

a Lin-13 retinoblastoma protein (pRb) interakciós motívummal rendelkezik, és a C. elegans egyetlen pRb homológjával, A Lin-35-tel működik a vulva fejlődésében . A D. melanogasterben a kondenzin II dcapd3 alegység a kromatinhoz való kötődése csökken a pRb mutáció hatására . Ha a C. elegans-ban a LIN-13 A Lin-35-en keresztül toborozza a kondenzin II-t, akkor azoknak a LIN-13 helyeknek, amelyeket szintén a LIN-35 (576) köt, átfedésben kell lenniük a kondenzin II-vel, mint azoknak a LIN-13 helyeknek, amelyeket nem köt a LIN-35 (1033). A Lin-13 és a Lin-35 által közösen elfoglalt helyek és a kondenzin II helyek átfedése csak kismértékben volt nagyobb, mint a Lin-13 Lin-35 nélküli helyeké, 60% és 50% (3b ábra). Ezzel szemben a Lin-35 és a kondenzin II átfedése magasabb volt azokon a helyeken, amelyeket a LIN-13 is kötött (45%), szemben a nem kötött helyekkel (9%). Ez arra utal, hogy a Lin-13 és a kondenzin II közötti potenciális kölcsönhatás többnyire Lin-35 független. A LIN-35 egy konzervált multi-protein komplexben működik, amelyet DRM-nek neveznek a C. elegans-ban (hDREAM emberben), amely EFL-1-et és DPL-1-et is tartalmaz . Az 555 DRM kötőhely, amelyet a LIN-13 kötött, nagyobb átfedést mutatott a kondenzin II-vel (63%), szemben a 787 DRM-hellyel, amelyeket a LIN-13 nem kötött (13%). A kondenzin II helyeket négy csoportra osztottuk a Lin-13 és LIN-35 kötőhelyekkel való átfedés szerint (3C ábra). Ez a csoportosítás azt jelezte, hogy a kondenzin II helyek nagy száma magas Lin-13 kötődést mutat, de nem LIN-35, ami arra utal, hogy ha a pRb által közvetített kondenzin II toborzás konzerválódik a C. elegans-ban, a LIN-35 függhet a Lin-13 jelenlététől a kondenzin II toborzáshoz.

a Kondenzin II mutáció transzkripciós hibákat okoz, amelyek elnyomó funkcióra utalnak

élesztőben és D. melanogasterben a kondenzin szerepet játszik a transzkripciós elnyomásban . Melanogaster jelezte, hogy a kondenzin II CAPD3 alegység szükséges az antimikrobiális peptid gének klaszterének transzkripciós aktiválásához . A kondenzin II transzkripciós szabályozásban betöltött szerepének megértéséhez RNS-seq-t hajtottunk végre kle – 2 null mutáns L2/L3 lárvákban. Az anyával terhelt KLE-2 lehetővé teszi a kle-2 null mutáns (ok1151 allél) steril felnőttekké felnőni. Összehasonlítottuk a heterozigóta és homozigóta kle-2 mutánsok génexpresszióját az L2 / L3 lárvákban, mielőtt a csíravonal elszaporodna, így szinte teljes egészében interphase magokat tartalmaz. A DESeq2 alkalmazásával végzett differenciális expressziós elemzés 356 gént azonosított, amelyek expressziója szignifikánsan különbözött a homozigótában a heterozigóta lárvákhoz képest (hamis felfedezési Arány < 5%; A DESeq2 eredményeket a 7.további fájlban mutatjuk be: S3 táblázat). A differenciálisan expresszált gének többsége nőtt (70%), nem pedig csökkent (30%) az expresszióban. A gén ontológiai kifejezés elemzése nem tárt fel egy adott géncsoportot, amelyet a KLE-2 mutáció befolyásolt. A kondenzin IDC közzétett adataihoz hasonlóan nem volt közvetlen összefüggés a KLE – 2 kötődés és a génexpresszió változásai között. Fontos, hogy a 46 differenciálisan expresszált és a KLE-2-hez kötött gén közül 83%-kal nőtt az expresszió, szemben a 67% – kal a 310 gén közül, amelyek nem voltak KLE-2-hez kötve (3D ábra), ami arra utal, hogy a kondenzin II kötés közvetlen hatása nagyrészt elnyomó.

a nyílt kromatinhoz kapcsolódó hiszton módosítások pozitív korrelációt mutatnak a kondenzinkötéssel

a kondenzinkötés kromatin kontextusának megértéséhez elemeztük a kondenzinkötő helyek és a modENCODE által leképezett kromatin jellemzők közötti kapcsolatot . Általános pozitív korrelációt figyeltünk meg a kondenzinkötés és az aktív kromatin nyomai között. Élesztőben a kondenzinkötő helyek száma a sejtciklus során közvetlenül korrelál a kromoszóma hosszával. A C száma. az elegans kondenzin II kötőhelyei nem voltak arányosak a kromoszóma hosszával (4a ábra), de pozitívan korreláltak az aktív hisztonjelekhez kapcsolódó kromoszómák hosszával (4b ábra). Az X kromoszóma kivétel volt, talán a kromatint megváltoztató dóziskompenzációs mechanizmusok miatt . A kondenzin I-IDC és II kötődése a genomban pozitívan korrelált a nyitott kromatin jelekkel, mint például a H3K27ac, és negatívan a heterokromatin jelekkel, mint például a H3K27me3 és a H3K9me3 (4c Ábra és további 8.Fájl: S4 ábra). Ez a korreláció az egész tartományra kiterjedő szinten volt (amint azt az 1 kb-os windows elemezte), mivel nem láttunk egy adott hisztonmódosítást, amely a kondenzin helyeken tetőzött egy metagén típusú elemzésben (az adatok nem jelennek meg). Immunfluoreszcencia vizsgálatokban a centromer fehérjék átfedésben voltak a mitotikus sejtekben a kondenzin II kötődésével . Nem figyeltünk meg pozitív korrelációt a cenp-A és a kondenzin II ChIP-seq jelek között vegyes stádiumú embriókban, ami arra utal, hogy az interfázisos magokban (a legtöbb sejtmag vegyes stádiumú embriósejtekben) nincs átfedés. Alternatív megoldásként, tekintettel arra , hogy a CENP-A sejtenként a genom cenp-a pozitív régióinak csak egy kis részhalmazához kötődik, a cenp-A és a kondenzin II átfedése csak egyetlen sejtben lehet nyilvánvaló. Ahhoz, hogy megértsük, mely kromatin faktorok jósolják legjobban a kondenzinkötést, gépi tanulási megközelítést alkalmaztunk. A C. elegans-ban a H4K20me1 nagymértékben dúsul az X kromoszómán a DCC által, így a h4k20me1 volt a leginkább megkülönböztető tényező a kondenzin IDC kötésében (4D ábra). A kondenzin II esetében az erősen prediktív kromatin jellemzők a H3K27ac és a CBP, mindkét aktív fokozó markere, ami arra utal, hogy a kondenzin kötődés dúsul az aktív fokozóknál . A 201 kondenzin II kötőhely közül, amelyek 2 kb-ra voltak a jegyzetekkel ellátott TSS-től, 58 átfedésben volt egy CBP kötőhellyel (P = 0,0002).

a nyitott kromatinhoz és fokozókhoz kapcsolódó kromatin faktorok pozitív korrelációt mutatnak a kondenzin kötődéssel. (A) A kondenzin II csúcsok számát az egyes kromoszómák lineáris hosszához viszonyítva ábrázoljuk. (B) a kondenzin II csúcsok számát A h4k8ac és H4K16Ac csúcsok által lefedett kromoszóma hosszához viszonyítva ábrázoljuk. Az autoszomális adatokhoz illesztett trendvonal pozitív korrelációt jelez (R2 = 0,9). C) Az X kromoszómán (balra) és az autoszómákon (jobbra) 1 kb-os összefüggő ablakokon belüli Kondenzinkötés pozitív korrelációt mutat az aktív jelekkel (például H3K27ac, H2A.Z), és negatívan korrelál az elnyomó jelekkel (például H3K27me3, H3K9me3). (D) egy ensemble osztályozó (véletlen erdők) megtanulták megjósolni kondenzin kötődés az egész genom. A legnagyobb prediktív teljesítménnyel rendelkező Top 20 funkció (a 92 összes funkció közül, további 1.fájl: S1 táblázat) a condensin I-IDC (balra) és a condensin II (jobbra), felül a legfontosabb funkcióval. A jellemzőket a pontosság átlagos csökkenése alapján rangsorolják, amely leírja a tényleges osztályozás hibaaránya és a tulajdonság permutálása utáni hibaarány közötti különbséget, az összes osztályozóra (fára) átlagolva.

a kondenzinkötő helyeken dúsított DNS-szekvencia motívumok specifikus tulajdonságokat mutatnak

bár a kondenzin II kötődik az X kondenzin I-IDC helyeihez, a kondenzin I-IDC nem kötődött az autoszomális kondenzin II kötőhelyek többségéhez (1D ábra). A kondenzin IDC és a II toborzás sajátosságainak megértéséhez olyan DNS-szekvencia jellemzőket kerestünk, amelyek megkülönböztetik a kondenzin II és a kondenzin IDC kötődést. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a kondenzin IDC-t először körülbelül 100 helyre toborozzák, majd átterjed más kromoszómális helyekre . Egy 10 bp DNS-szekvencia motívum dúsult a kondenzin IDC toborzási helyeken (5a Ábra), és a motívum mutációja megszüntette a kondenzin IDC toborzást az extrakromoszomális tömbökön, jelezve, hogy a kondenzin IDC DNS-szekvencia motívum fontos szerepet játszik a kondenzin IDC toborzásban.

találtunk egy gcgc-tartalmú DNS-szekvencia motívumot, amelyet kondenzin II kötőhelyek alatt dúsítottak (5a ábra). Érdekes megjegyezni, hogy mind a kondenzin II, mind a kondenzin IDC motívum tartalmazta a GCGC magot, de a kondenzin IDC motívumot az egyik oldalon az AGGG kiterjesztette, ami arra utal, hogy a kondenzin IDC toborzásának X-specifitását az AGGG-t felismerő kofaktorok érik el. Genomszintű, a kondenzin II motívumok 11% – át kötötte a kondenzin II. így a többi TF-hez hasonlóan (például) a potenciális DNS-szekvencia motívumoknak csak egy részét kötötte a kondenzin II.más tényezők, például a kromatin hozzáférhetősége és az ismeretlen Ko-faktorok is szerepet játszhatnak a kötési specifitásban. Valójában, ha azokat a motívumokat vettük fel, amelyek egy 2 kb-os ablakban jelentősen gazdagodtak egy aktív hisztonjelhez, például a H4K16ac-hoz, akkor a kötött motívumok aránya 11% – ról 29% – ra nőtt. Ezen túlmenően, hasonlóan a kondenzin IDC motívumhoz , amely jobban csoportosul a kötött helyeken, azt találtuk, hogy az 1 kb genomi ablakok, amelyek egynél több kondenzin II motívumot tartalmaztak, körülbelül 2,5-szer nagyobb valószínűséggel kötődnek a kondenzin II-hez, összehasonlítva azokkal, amelyek csak egy motívummal rendelkeznek. Ezért a motívumcsoportosítás és a nyitott kromatin kontextus segít meghatározni a kötött motívumok kiválasztását.

a kondenzin IDC és a kondenzin II kromoszómális toborzása magában foglalja mind a megosztott, mind a különálló szabályozókat. (A) motívum logók 10 bp DNS szekvencia motívumok dúsított felső kondenzin helyek láthatók. B) A kondenzin I-IDC, a kondenzin II és az SCC-2 kötőhelyei közötti átfedés látható. Az egyes tényezők alatti számok a kötőhelyek teljes számát jelzik. Az átfedő számok az SCC-2 csúcsok számán alapulnak. (C) University of California Santa Cruz (UCSC) böngésző nézet példázza SCC-2 ChIP-seq jel, amely többnyire korlátozódik promóterek. D) SCC-2 és kondenzin II kötés egy jól meghatározott kondenzin IDC toborzási helyszínen az X-en (rex-1). (E) az sdc-2 null mutáns (TY1072), kondenzin I-IDC (DPY-26), kondenzin II (HCP-6, KLE-2) és SCC-2 kötődés csökkent a rex-2 (bal panel), de továbbra is nagyrészt hasonló az autoszómák (jobb panel). F) az sdc-2 mutáns Forgácsdúsításának aránya a vad típushoz képest az SCC-2 kötési csúcsain belül. A kötőhelyeket autoszómákon, az X-en alacsony SDC-2 kötéssel és magas SDC-2 kötéssel osztályozzák. (G) a dpy-27 ChIP dúsítás qPCR analízise olyan felnőttekből izolált embriókban, akiket vektor (kontroll) és PQN-85 RNAi tápláltak. A ChIP dúsítását a negatív kontroll lókuszhoz viszonyítva fejezzük ki. A hibasávok a három-öt biológiai replikátum szórásai. ChIP, kromatin immunprecipitáció; DCC, dóziskompenzációs komplex.

nem minden kondenzin II kötőhelynek van motívuma. Azokon a kondenzin II helyeken, ahol nincs motívum, más tényezők felelősek lehetnek a kötődésért. Alternatív megoldásként a motívumot tartalmazó kondenzin II helyek alacsony aránya (27%) a kondenzin II potenciális terjedésével magyarázható toborzás után. A terjesztési helyek várhatóan nem tartalmazzák a motívumot. Például a kondenzin IDC esetében a potenciális toborzási helyek nagy százaléka (56%) tartalmazza a motívumot, de nem terjedési helyek (8%) . Az azonosított kondenzin II helyek toborzási kapacitásának szisztematikus elemzésére van szükség annak kezelésére, hogy van-e terjedés.

SDC-2 szükséges a kondenzin I-IDC, a kondenzin II és a kohéziós betöltő X kromoszómális DCC felvételi helyekhez

metazoánokban a kondenzin kromoszómákba történő felvételében részt vevő fehérjék nem jól ismertek. Élesztőben a kondenzinkötés átfedésben van a kohéziós terhelésű Scc2/4 komplexével, ami növeli a kondenzin asszociációt a kromoszómákkal . Annak vizsgálata, hogy az scc2/4-gyel való átfedés megmarad-e az élesztő és a C között. elegans, elvégeztük az SCC-2 (más néven PQN-85) ChIP-seq elemzését, és azt találtuk, hogy az SCC-2 helyek figyelemre méltó 95%-a átfedésben van az X kondenzin I-IDC-vel, és 60% a kondenzin II Genom egészével (5b ábra). Az átfedés hasonló maradt, amikor a forró régiókat kizárták (további fájl 9: S5A ábra). Nem minden kondenzin hely átfedésben van az SCC-2-vel, ami arra utal, hogy az élesztővel ellentétben a kondenzin nem függ az SCC-2-től a kötéshez . Az SCC-2 kötődés magasabb volt a promotereknél, és pozitív korrelációt mutatott a transzkripcióval (további 9.fájl: S5B ábra). A GAGA-tartalmú DNS-szekvencia motívum az SCC-2 kötőhelyek 58% – ában volt jelen (további fájl 9: S5C ábra). A Drosophila Nipped-B-vel ellentétben , és hasonlóan az S. cerevisiae Scc2-hez , az SCC-2 kötődés nem volt magas az átírt régiókban, de intergenikus maradt (5c ábra).

a kondenzin II kötőhelyek majdnem teljes átfedése (96%) az X kromoszómán lévő kondenzin I-IDC-vel támogatja a különböző kondenzinek kromoszómális kötődésének közös mechanizmusait. Mivel a kondenzin II és az SCC-2 a kondenzin IDC toborzási helyeihez kötődik az X – en (5D Ábra és további fájl 9: S5D ábra), feltételeztük, hogy a kondenzin IDC toborzók a kondenzin II-t és az SCC-2-t is toborozzák. A kondenzin IDC hermafrodit-specifikus felvételét az X kromoszómába SDC-2, SDC-3 és DPY-30 végzi . HCP-6 és KLE-2 (kondenzin II), DPY-26 (kondenzin I-IDC) és SCC-2 ChIP-seq-t végeztünk sdc-2 null mutáns embriókban. Az sdc-2 mutánsban a DPY-26, a HCP-6, A KLE-2 és az SCC-2 kötődés megszűnt egy X-specifikus kondenzin IDC felvételi helyen (rex-2) (5e.ábra). Nem világos, hogy miért csökkent a HCP-6 és a KLE-2 kötődése a rex-2-nél ahelyett, hogy az autoszomális kondenzin helyére hasonlított volna. Az SCC-2 kötődése az SDC-2-től független autoszómákhoz és X kromoszóma helyekhez hasonló maradt az sdc-2 mutánsban, mint az SDC-2 által kötött helyekhez (5f ábra). Eredményeink azt sugallják, hogy az SDC-2, a hermafrodit-specifikus TF, amely a kondenzin IDC-t az X kromoszómába toborozza, a kondenzin II-t és az SCC-2 kohéziós betöltő komplex alegységet is ugyanazon helyekre toborozza (további fájl 10: S6 ábra). Korábbi genetikai vizsgálatok megállapították, hogy az sdc-2 nullmutáció nem okoz embrionális letalitást a férfiaknál, így a kondenzin II és az SCC-2 SDC-2 általi toborzása nem elengedhetetlen az Általános kromoszóma kondenzációhoz és szegregációhoz . Lehetséges, hogy az SCC-2 és a kondenzin II SDC-2 általi toborzása hermafrodit-specifikus génszabályozó funkcióval rendelkezik.

annak tesztelésére, hogy az SCC-2 hatással van-e a kondenzin IDC kromoszómális asszociációjára a toborzási helyszínen kvantitatív PCR-elemzést végeztünk a dpy-27 ChIP kontrolljában az SCC-2 leütésével szemben embriók. Az RNAi táplálásával körülbelül 80%-kal tudtuk leütni az SCC-2 szintjét (további 9.fájl: S5E ábra). Az SCC-2 leütésekor nem láttunk jelentős változást a DPY-27 kötésben a rex-1 vagy a rex-2-nél (5g ábra). A meiotikus kromoszómákhoz kötődő kondenzin i és II immunfluoreszcens analízise következetesen nem mutatott szignifikáns különbséget a vad típusú és az scc-2 mutánsok között .