A chlorobi törzs finomítása a mélyen elágazó, nem művelt vonal képviselőjének filogenetikai és metabolikus potenciáljának feloldásával

a NICIL-2 genomikai rekonstrukciója

A biomassza szubsztrátokon (cellulóz, xilán és xilán) történő növekedésre adaptált termofil baktériumkonzorciumok mikrobiális közösségének összetételi elemzése switchgrass), mint egyetlen szénforrásuk a 60cc-nél következetesen azonosította a mindenütt jelenlévőt OTU97, amely távoli kapcsolatban állt a chlorobi törzs Kulturált tagjaival (Eichorst et al., 2013, 2014). Egy olyan konzorcium metagenomikus szekvenálását végezték el, amely Ionos-folyékony előkezelt kapcsolófüvön nőtt, amelyben a Klórbival kapcsolatos OTU97 bőséges volt, hogy megértsék az OTU97 által képviselt populáció filogenitását és metabolikus potenciálját. Összeszerelés (lásd anyagok és módszerek) és automatizált binning (Wu et al., 2014) ennek a Konzorciumnak a metagenómájából 20 genomi kukát hoztak létre (S3 kiegészítő táblázat), amelyek közül a leggyakoribb kukák a CHITINOPHAGACEAE nyfb törzshez szorosan kapcsolódó populáció (61,8%) volt, amelyet cellulózon termesztett rokon dúsításból izoláltak (Eichorst et al., 2013), valamint a Klórbival kapcsolatos bin (23,1%). A >1% – ban jelenlévő kukák több, a Paenibacillaceae (003 és 006 kukák), a Verrucomicrobia 3.alkörzetben (bin 004) csoportosuló, nem tenyésztett populációt, valamint a Thermobipora bisporához (bin 005), egy aktinobaktérium termofilhez közeli populációt tartalmaztak.

A Klórbival rokon kukát NICIL-2-nek nevezték el (a Newby Island komposzt Ionos folyadék-2.bőségesen). A NICIL-2 genomból előre jelzett fehérjék elemzése összhangban volt az FCB szuperféreg tagjaival távoli rokonságban álló populációként való azonosításával, a Bacteroidetes (33%) és az Ignavibacteria (15,7%) a legszorosabban rokon fehérjeszekvenciákkal (1.ábra). A visszanyert NICIL-2 vázlat genomja viszonylag kicsi (2,67 Mbps) és majdnem teljes (95,3%; 102 A 107-ből egyetlen másolatú marker gén 152 állványban). A NICIL-2 vázlat genomjának N50 hossza 168 929 bp volt, a legnagyobb contig pedig 1 volt.1 MB, ami arra utal, hogy az állványok többsége kiváló minőségű szerelvényt képviselt (1.táblázat).

az összes NICIL-2 fehérje legjobban illeszkedő vonalának eloszlása. A százalékokat úgy becsüljük meg, hogy elosztjuk az egyes nemzetségekhez tartozó fehérjeszámokat az összes NICIL-2 fehérje számával. Lásd anyagok és módszerek a részletekért.

filogenetikai elemzése NICIL-2

a 16S rRNS gén (1451 bp) nyertünk a NICIL-2 tervezet Genom. A nicil-2 16S rRNS génjéhez legközelebb eső ribotípust (>99% – ban azonos) egy japán aranybánya-szekvenciában (nunoura et al.) hőáramból kinyert foszmid klónból (JFF029_06) szekvenáltuk., 2005). A Bacteroidetes és Chlorobi tenyésztett képviselőiből származó 16S rRNS gének < 85% – ban azonosak voltak a NICIL-2 szekvenciával. A 16S rRNS génszekvenciák összehangolásával létrehozott filogenetikai fa a NICIL-2-hez kapcsolódóan kimutatta, hogy a NICIL-2-t tartalmazó vonal különbözik a Bacteroidetesektől és a Chlorobi-tól (2.ábra). A NICIL-2 vonal két süllyedési vonalat tartalmazott a mintavételi környezet hőmérséklete alapján. A magas hőmérsékletű klaszter (a 2.ábrán piros színnel ábrázolva) olyan ribotípusokat tartalmazott, amelyek elsősorban az 55-től 80-ig terjedő magas hőmérsékletű környezetekből származnak C-tól 80-ig terjedő tartományban, mint például az OPB56 klón (Hugenholtz et al., 1998). A második klaszter olyan ribotípusokat tartalmazott, amelyek elsősorban mérsékelt hőmérsékleti környezetekből származnak, 20-tól 32-ig (a 2.ábrán zöld színnel ábrázolva). Mivel az OPB56 volt az első felfedezett klón, amely kapcsolatban áll ezzel a filogenetikai klaszterrel, a NICIL-2-t tartalmazó származást OPB56 kládnak nevezik. A 16S rRNS génfa kibővített nézetét az S1 kiegészítő ábra ábrázolja.

a maximális valószínűségű filogenetikai fa az új nemzetséghez épült NICIL-2 a 16S riboszomális RNS gén felhasználásával. A NICIL-2 fajhoz legközelebb eső klád egy japán aranybányából izolált fosmidból származott (Nunoura et al., 2005). A fajok hőmérsékleti tartományait az egyes NCBI csatlakozási számokhoz kapcsolódó szakirodalom alapján határoztuk meg. A fajok lakóhőmérsékletét piros (>55 C), zöld (20-32 C) vagy fekete (meghatározatlan) jelölte. A skála sáv nukleotidhelyenként 0,05 változást jelöl. A faépítéssel kapcsolatos részleteket az anyagok és módszerek tartalmazzák. Az összes csomópontot mutató kibővített filogenetikai fa megtalálható az S1 kiegészítő ábrán. Ennek az ábrának a színes változata elérhető az ISME Journal online oldalon.

a NICIL-2 és az OPB56 klád filogenetikai hovatartozásának teljesebb megállapításához természetes mintákból nyert adatokból további riboszomális fehérjeszekvenciákat nyertünk. A NICIL-2 22 konzervált riboszomális génjének homológjait két japán termálforrás-foszmid klónban találták (JFF029_C06 és JFF027_B02). Ezt a 22 riboszomális fehérjét használták metagenomikus adatkészletek keresésére magas hőmérsékletű környezetekből. Ezeknek a konzervált riboszomális géneknek a teljes készletét négy metagenomikus adatkészletben azonosították magas hőmérsékletű környezetekből. Ezeknek az adathalmazoknak az automatizált binningje hat majdnem teljes (>90% teljes) genomot tartalmazott, amelyek a konzervált 22 riboszomális fehérje szekvenciáit tartalmazták a NICIL-2 genomban és a japán aranybánya foszmid klónokban (S4 kiegészítő táblázat). A hat összefűzött fehérjeszekvenciából öt csoportosult az OPB56 vonalban a NICIL-2-vel, míg a Yellowstone Fairy Falls egyik szekvenciája az Ignavibacteria-val csoportosult (3a ábra). Ez a filogenetikai fa bizonyította, hogy a Chlorobea, Ignavibacteria és OPB56 nagy megbízhatósággal (97%) monofiletikus kládot alkotott. A Bacteroidetes különálló klasztert alkotott, a Rhodothermaceae család pedig megkérdőjelezte a Bacteroideteshez való kapcsolódását (Nolan et al., 2009) nagy megbízhatósággal (>80%) kapcsolódtak a Bacteroideteshez. Egy második filogenetikai fát úgy hoztak létre, hogy 86 egypéldányos gént összefűztek a Bacteroidetes, a Chlorobi és a Fibrobacter között (3b ábra). Ez a fa reprodukálta a 22 riboszomális génből felépített gén topológiáját, tovább támogatva a Chlorobea, az Ignavibacteria és az OPB56 rokonságát.

a legnagyobb valószínűséggel filogenetikai fa épült az új vonal NICIL – 2 felhasználásával (a) 22 riboszomális fehérjék és (b) 86 egypéldányos fehérjék között megosztott Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 és Fibrobacter klaszterek. A skála sáv 0,1 változást jelöl aminosav-helyenként. A faépítéssel kapcsolatos részleteket az anyagok és módszerek tartalmazzák.

a Bakteriodéták és a Klorobi közötti evolúciós kapcsolatok megértésének kiegészítő megközelítése a konzervált fehérjék indeleinek azonosítása volt (Gupta and Lorenzini, 2007). A DNS-polimeráz III (28 aa) és az alanil-tRNS szintetáz (12-14 aa) inszercióit, amelyek a GSB-ben konzerváltak, a Bakteriodetákban pedig hiányoznak, a Chlorobi törzs jellegzetességeinek tulajdonították. E két fehérje összehangolása (S2 és S3 kiegészítő ábrák) azt jelzi, hogy a GSB fehérjeszekvenciákba történő DNS-polimeráz III inszerció nincs jelen az ignavibacteriae és NICIL-2 genomokból származó előre jelzett fehérjékben, míg a GSB alanil-tRNS szintetáz szekvenciákba történő inszercióból származó 2-3 aminosav konzerválódik az Ignavibacteria és NICIL-2 fehérjeszekvenciákban.

a NICIL-2 metabolikus rekonstrukciója

a NICIL-2 fiziológiájára a metabolikus rekonstrukció és metabolikus potenciálja következtetett a GSB (Chlorobaculum tepidum), a Bacteroidetes (Rhodothermus marinus és Salinbacter ruber) és az Ignavibacteria (Ignavibacterium album és Meliobacter roseus) képviselőivel összehasonlítva. A fotoszintézishez kapcsolódó fehérjéket kódoló gének, beleértve a C homológjait is. a tepidum fotoszintetikus reakcióközpont alegységei (CT1020, pscB, psC, pscD), klórszóma burokfehérjék (csmABCDEFHIJX) és bakterioklór-a fehérjék (fmoa) hiányoznak az összes többi genomban, megkülönböztetve a GSB-t ebben az összehasonlító készletben (Eisen et al., 2002). A metabolikus rekonstrukció vizuális összefoglalását a 4. ábra mutatja be. A teljes géninformációért, a dobozszámokért és a rövidítésekért lásd az S5 és S6 kiegészítő táblázatot.

A NICIL-2 rekonstruált metabolizmusa az újra összeállított genomból következik. A teljes géninformációért, a dobozszámokért és a rövidítésekért lásd az S5 és S6 kiegészítő táblázatot. A piros szöveg olyan enzimeket vagy bioszintetikus utakat jelöl, amelyek hiányoznak a genomból. A kék, zöld és lila nyilak az ATP, NADH és NADPH áramlást jelzik.

Szénmetabolizmus

A NICIL-2 Genom a glikolízis, a TCA ciklus és a glükoneogenezis teljes génkészletét kódolja (4.ábra). Az rTCA-ciklus génjei, amelyek a GSB-ben autotróf szénrögzítéshez vannak jelen és expresszálódnak, hiányoznak. Továbbá, a liponsavat tartalmazó kofaktorokat kódoló gének jelenléte a piruvát-dehidrogenáz és a kb-ketoglutarát-dehidrogenáz komplexekben arra utal, hogy a TCA ciklus oxidatív irányban működik. Az rTCA ciklus nagy részét rekonstruálták R. marinus és I. album, amely több piruvát-ferredoxin-oxidoreduktázt és kb-ketoglutarát-ferredoxin-oxidoreduktázt tartalmaz, két szükséges enzim az rTCA ciklushoz. Az I. album és az R. marinus genomokból hiányzik az ATP-függő citrát-liáz, amely kritikus enzim az rTCA ciklus befejezéséhez (Buchanan and Arnon, 1990). Javasolták, hogy az I. album ATP-független citrát-liázt használjon az rTCA-ciklusban való működéshez, bár ezt az állítást kísérletileg nem tesztelték, és sem az I. album, sem az R. marinus nem mutatott autotróf növekedést (Liu et al., 2012a).

annak ellenére, hogy a növényi biomasszán növekvő adaptált kultúrákban magas a relatív bősége, a NICIL-2 meglepően korlátozott enzimatikus képességgel rendelkezett a komplex biomassza dekonstruálására. A poliszacharid hidrolízis metabolikus potenciáljának összehasonlítása az előkezelt kapcsolófű dúsításából származó metagenomból kivont 20 tartály között azt mutatta, hogy a NICIL-2 viszonylag kevesebb génnel rendelkezik a cellulóz és a hemicellulóz dekonstrukciója szempontjából, mint a mikrobiális közösség többi tagja (S4 kiegészítő ábra). Különösen a NYFB törzs, a verrucomikrobiális populáció és a többszörös Gram-pozitív Firmicutes a poliszacharid-hidrolízis génjeinek szélesebb körű repertoárjával rendelkezik. A rekonstruált OPB56-kapcsolt genomok további vizsgálata magas hőmérsékletű természetes mintákból kimutatta, hogy a poliszacharid-hidrolízis génjeinek hiánya gyakori volt ebben a kládban. A Bacteroideteshez és a Chlorobihoz tartozó genomok közül R. marinus, M. roseus és Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, amely klaszterek a Ignavibacteria, rendelkezett kiterjedt repertoárját glikozid hidrolázok dekonstruálni növényi biomassza. Ezek az elemzések azt sugallják, hogy a NICIL – 2 és az OPB56 klád rokon tagjai valószínűleg nem vesznek részt a biomassza elsődleges dekonstrukciójában az adaptált közösségben és természetes környezetben. Elképzelhető, hogy a NICIL-2 növekedhet cukor monomereken vagy oligomereken; a genomban azonban csak egy előre jelzett diszacharid transzporter gént azonosítottak.

bár a nicil-2 kiválasztása aerob körülmények között történt, erjedési képességgel rendelkezhet. Az etanol fermentációs termelésére szolgáló gének jelen vannak (alkohol-dehidrogenáz, EC 1.1.1.1.), míg a formiát (piruvát-formiát-liáz, EC 2.3.1.54.), a laktát (laktát-dehidrogenáz, EC 1.1.1.27.) és a propionát (metilmalonil-CoA-karboxil-transzferáz, 2.1.3.1.) génjei hiányoznak. A NICIL-2 Genom a foszfotranszacetiláz (EC 2.3.1.8) génjét kódolja, de nem acetát-kináz (EC 2.7.2.1), mindkettő szükséges a fermentatív acetát előállításához. Mind az I. album, mind az M. roseus tartalmaz géneket a laktát és az acetát előállításához, míg a C. tepidum nem.

nitrogén és kén metabolizmus

az ammónium asszimiláció, a glutamin-szintáz (EC 6.3.1.2) és a glutamát-szintáz (EC 1.4.1.13) génjeit detektálták a NICIL-2 genomban. Azonban nem azonosítottak géneket a különböző nitrát redukcióra, az asszimilációs nitrát redukcióra, a denitrifikációra, a nitrogénkötésre és a nitrifikációra. A C. tepidum az N2 rögzítéshez szükséges nif géneket kódolja, míg M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012A) és R. marinus (Nolan et al., 2009) nem. A C. tepidum kötelező kén-oxidálószer, ezért oxidálhatja a szulfidot, a tioszulfátot, a szulfitot és az elemi ként. A C. tepidum előnyösen oxidálja a szulfidot elemi kénné, majd elemi ként és tioszulfátot szulfáttá (Chan et al., 2008). Ezenkívül a szulfit oxidálható, ha a tápközegben szállítják, de nem képes fenntartani C. tepidum mint egyetlen elektrondonor (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus és R. marinus hiányzik a redukált kénvegyületek oxidációjához szükséges összes gén.

aminosav bioszintézis

A NICIL-2 genomból hiányzik számos kulcsfontosságú gén az aminosavak bioszintéziséhez. A teljes útvonal kódolva van alanin, arginin, aszparagin, aszpartát, ons-alanin, glutamát, glicin, lizin és metionin számára. A NICIL-2 nem rendelkezik ilvC-vel és leuABCD-vel, ezért a valin, leucin és izoleucin bioszintézisének hiányos útvonalai vannak. Hasonlóképpen, az I. az album genome-ból hiányzott a piruvátból származó valin, leucin és izoleucin bioszintézishez szükséges összes gén, kivéve az elágazó láncú amino-transzferázt (ilvE), míg az M. roseus és a C. tepidum teljes útvonalakat tartalmaz. Sem a NICIL-2, sem az I. album nem kódolja a glutamátból (proBAC) származó prolin bioszintézishez szükséges géneket, míg mind a C. tepidum, mind az M. roseus. A szerin bioszintézisére szolgáló szerb gén hiányzik a NICIL-2, I. album, M. roseus, és megtalálható néhány GSB-ben, beleértve a C. tepidumot is. A NICIL – 2 aminosavakat is használhat növekedési szubsztrátként. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). Ehelyett a gének többsége egymástól függetlenül helyezkedik el a legnagyobb NICIL-2 állványon (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE és nuoMN), a fennmaradó gének pedig három kisebb állványon (nuoAB, nuoL és nuoC) találhatók, jelezve, hogy az operonszerkezet hiánya nem az összeszerelés tárgya. A C. tepidum egy, a NADH-t kódoló génkészletet tartalmaz: ubiquinon-oxidoreduktáz, amelyből hiányzik a nuoEFG (11 alegység). Az I. album és az M. roseus két nuoabcdhijklmn-készletet és egy-egy nuoefg-készletet tartalmaz (S6 kiegészítő ábra). Érdekes módon a NICIL-2-ből származó I komplex a legszorosabb rokonságban áll a Rhodothermus marinus és a Bacteroidetes Salinibacter ruber génjeivel, mindkettő a NADH teljes génkészletét tartalmazza:az ubiquinon-oxidoreduktázt (5a.ábra). A 11 komplex I alegység homológjait a Yellowstone-ból és a Great Boiling Spring-ből kinyert mind a hat NICIL-2-vel rokon kukában azonosították, valamint ezeknek a fehérje szekvenciáknak a NICIL-2 szekvenciáival összekapcsolt összeállítását.

a szomszéd az i (a) komplex és a III (b) komplex nem gyökeres összefűzött fehérjefáihoz csatlakozik. A zárójelben lévő számok a fa felépítéséhez használt alegységek számát jelölik. Scale bar jelöli x változások per aminosav helyén.

Az ACIII a bakteriális membrán oxidoreduktázok új osztálya, amely olyan szervezetekben található, amelyekből gyakran hiányzik a bc1 komplex (Yanyushin et al., 2005). Az ACIII tól től R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) és fonalas anoxigén fototróf baktérium Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) megtisztították és tanulmányozták. A közelmúltban nagyszámú, az aciii alegységeket kódoló génklasztert találtak a baktériumgenomok egy sorában (Refojo et al., 2013). Például az R. marinus tartalmazza az actABCDEF géneket egy operonban, amely hat aciii alegységet kódol; ennek a géncsoportnak a homológjait a Bacteroidetes több tagjában azonosították (Thiel et al., 2014). A filogenetikai fa az ACIII kapcsolatát ábrázolja a NICIL-2-től a legközelebbi rokonaihoz (5b ábra). A GSB nem rendelkezik ACIII-vel, ezért nem képviseltetik magukat ebben a fában. A ‘ Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, amely nem tagja a GSB-nek, olyan aciii-t kódol, amely valószínűleg az aerob légzésben működik (Liu et al., 2012b). Fontos megjegyezni, hogy mind az I. album, mind az M. roseus egyedülálló az ACIII ezen halmaza között, mivel öt alegységet tartalmaznak, az actDE alegységeket fúziós fehérjeként azonosítják. Az összes ACIII alegységet kódoló gének teljes komplementere, amelyeket a Yellowstone metagenomokból származó két NICIL-2-vel rokon genomtartályból nyertek ki, az actDE fúziót tartalmazta, és I. album és M. roseus csoportosultak. A NICIL – 2 nem tartalmazza ezt a fúziót, és az ACIII komplex génjei szorosabban kapcsolódnak az R. marinushoz és az S. ruberhez.

A NICIL-2 terminális elektron akceptorok közé tartozik az AA3 típusú citokróm C-oxidáz (komplex IV) és a lehetséges alternatív citokróm c-oxidázok, amelyeket coxmop-ként jegyeznek fel. A NICIL-2 valószínűleg nem mikroaerofil, mivel a genomban nem mutattak ki cbb3 típusú oxidázokat. Ezenkívül a citokróm bd nem volt kimutatható. Összehasonlításképpen, mind az I. album, mind az M. roseus genomok tartalmazzák a cbb3 típusú citokróm C-oxidáz és a citokróm bd komplex génjeit.

A NICIL-2 Genom hiányos men génkészletet tartalmaz a menakinon szintéziséhez. A teljes menakinon bioszintetikus útvonal tartalmazza menFDHCEBAG (Bentley and Meganathan, 1982) és a NICIL-2 Genom csak menbag. Összehasonlításképpen: C. tepidum és I. az album teljes men pathways-t tartalmaz, míg az M. roseus és az R. marinus genomok a MenB és a menH kivételével minden szükséges génre tartalmaznak megjegyzéseket. Az alternatív menakinon bioszintetikus út enzimjeit kódoló gének homológjai, a futalozin út (Arakawa et al., 2011), a NICIL-2-ben nem fedezték fel. Az ubiquinon bioszintetikus gének szintén hiányoznak. Lehet, hogy a NICIL-2 Genom hiányos lefedettséggel rendelkezik ezen a területen, és további men gének találhatók egy teljesen összeállított genommal. Alternatív megoldásként a NICIL-2 részt vehet kinon csere más közösség tagjaival, amint azt a ‘Chlorochromatium aggregatum’ fototróf konzorcium megfigyelte (Liu et al., 2013).

Flagella és chemotaxis

az alaptest, a horog és a filament egységét kódoló gének jelen vannak a NICIL-2 genomban. A NICIL-2-ből azonban hiányoznak a kemotaxis gépeket kódoló gének, egy szabályozó fehérjétől, a CheY-től eltekintve. A GSB-t nem mozgékonynak tekintik, hiányzik a kemotaxis és a flagella, míg az I. album, az M. roseus és az R. marinus flagelláris és kemotaxis géppel rendelkezik.