a claudin-1 antitest-célzása mint potenciális colorectalis rákterápia

CRC minták

a génexpressziós profilozáshoz 143 tumormintát választottunk ki 143 betegből, akik három csoportba tartoztak kohorszok: a prospektív egyközpontú REGP vizsgálat (19 beteg) (GSE62322) , a retrospektív többközpontú vizsgálat, amely a cosival (68 beteg) és a biocolon prospektív multicentrikus vizsgálat (56 beteg) (Gse62080 és gse72970) . E három vizsgálat esetében a felvételi kritériumok a következők voltak: szövettanilag bizonyított vastagbél adenokarcinóma, előrehaladott és bidimenzionálisan mérhető tumor (IV.stádium), 18 és 75 év közötti életkor, valamint az Egészségügyi Világszervezet (WHO) teljesítménystátusza (6). Bármely kezelés előtt minden beteg műtéten esett át primer tumor reszekció vagy endoszkópos biopszia céljából.

a western blot elemzéshez 13 további tumormintát használtunk a prospektív egyközpontú REGP vizsgálatból, de nem szerepeltek a 143 mintában.

az immunhisztokémiai elemzéshez további 52 CRC-ben szenvedő beteg szövetmintáit retrospektív módon választották ki a Montpellier patológiai fájlok Rákkutató Intézetéből, csak akkor, ha ugyanazon beteg esetében normál mucosa, adenoma és adenocarcinoma minták álltak rendelkezésre.

az emberi szövetmintákat használó vizsgálatokat az illetékes etikai bizottságok jóváhagyták, és minden résztvevőt tájékoztattak a vizsgálat céljairól és módszereiről, és a beiratkozás előtt írásos beleegyezést írtak alá.

génexpressziós elemzés

Vastagbélmintákat (normál vastagbél, primer tumor és májmetasztázis minták a REG/P vizsgálathoz, de csak a COSIVAL és a BIOCOLON vizsgálatok elsődleges tumormintáit) gyűjtöttek a műtét idején egy standardizált eljárást követően, hogy kiváló minőségű RNS-t kapjanak . A mintákat ezután hibridizáltuk humán genom U133 plusz 2,0 tömbök (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

az antitest-alapú terápia új terápiás célpontjainak azonosításához mCRC-ben összehasonlítottuk a normál nyálkahártya (n = 17), az elsődleges tumor (n = 20) és a májmetasztázisok (n = 19) szövetminták génexpressziós profilját.

mivel a génexpressziós profilok összehasonlításakor figyelembe kell venni a CRC heterogenitását, az elsődleges tumormintákat (n = 143) A három független csoport által javasolt génexpressziós profilokon alapuló CRC molekuláris osztályozás, valamint a közelmúltbeli konszenzusos osztályozás alapján osztályozták . Röviden, de Sousa E. Melo et al. javasolt csoport tumorok három osztályba: CCS1 (CRC mikroszatellit instabilitás, MSI), CCS2 (rák kromoszóma instabilitás, CIN) és CCS3 (új altípus) . Sadanandam et al. öt molekuláris altípust azonosítottak a sejtfenotípus alapján: Serlegszerű, tranzit-amplifikáló (TA), enterocita, Szárszerű és gyulladásos . Marisa et al. hat molekuláris altípust (C1-C6) írtak le a következő főbb jellemzőkkel: C1 = CIN és az immunutak downregulációja, C2 = MSI, C3 = mutált KRAS, C4 = őssejt-fenotípus-szerű, C5 = CIN és a WNT útvonalak upregulációja, és C6 = CIN és normálszerű génexpressziós profil . Végül hat korábban közzétett aláírásból kiindulva egy nemzetközi konzorcium négy konszenzusos altípust mutatott be: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolikus (CMS3) és mesenchymal (CMS4) (felülvizsgálatra ). A CRC minta eloszlását a molekuláris altípus szerint az 1. kiegészítő fájl mutatja: S1 táblázat.

immunhisztokémiai elemzés

a mintákat szöveti mikro-tömbbe (TMA) állítottuk össze három szövetmag (egyenként 0,6 mm átmérőjű) felhasználásával, a korábban leírtak szerint . Röviden, a TMA 3-ons szakaszait paraffinmentesítettük és rehidráltuk Osztályozott alkoholokban. A hő által indukált antigén-visszakeresést TMA szakaszok inkubálásával végeztük EDTA pufferben (pH 9) 98cc-on vízfürdőben 20 percig. Az endogén peroxidáz aktivitás semlegesítése után a TMA szakaszokat poliklonális anti-CLDN1 antitesttel inkubáltuk (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) vagy antitest hígítóval (Dako, Glostrup, Dánia) önmagában 60 percig. Az elsődleges antitestkötést az Envision ons (envision) rendszer és a Dako Autostainer (Dako, Glostrup, Dánia) segítségével vizualizáltuk. A CLDN1-pozitív sejtek százalékos arányát és a festés intenzitását (0, nincs festés; 1, sárgás; 2, barna; és 3, sötétbarna) minden egyes TMA-folt esetében értékeltük.

Western blot analízis

a betegekből származó tumorszövet-mintákat közvetlenül őröltük lízis pufferben (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM nátrium-ortovanadát, egy koktél proteáz inhibitor tabletta 10 ml) keverő Malom alkalmazásával 300 mm-es egység (QIAGEN, Valencia, ca). A fehérjekoncentrációt a Bradford-teszttel (Pierce Coomassie Plus Protein Assay) határoztuk meg. Ezután az összes fehérje 50 6G-ját 12% – os SDS-PAGE-vel oldottuk fel, és a nitrocellulóz membránokra helyeztük át (Whatman 0,45 / m pórusméret). A nem specifikus kötőhelyeket 5% (wt/vol) zsírmentes tejjel blokkoltuk PBS-ben, 0,1% (vol/vol) Tween 20-mal (PBS-T) szobahőmérsékleten 1 órán át, majd a membránokat inkubáltuk 4CC-n egy poliklonális anti-CLDN1 antitesttel (JAY-8) egy éjszakán át. A membránokat ezután mossuk és inkubáljuk a megfelelő torma peroxidáz-konjugált szekunder antitesttel 1 órán át. a kinyilatkoztatást kemilumineszcencia rendszerrel (Amersham Biosciences)végeztük; a normalizáláshoz a tubulin-expressziót használtuk.

szubcelluláris fehérje extrakciót

a fehérje extrakciót a korábban leírtak szerint végeztük . Mindegyik mintához 20-6m vastag metszeteket vágtunk egy kriotómával, folyékony nitrogénbe kevertük, majd mikrotörővel finoman őröltük. A szubcelluláris fehérje extrakcióhoz a ProteoExtract szubcelluláris proteom extrakciós készletet a gyártó utasításainak megfelelően (Calbiochem) használtuk. A szubcelluláris frakciókat (egyenként 10 db) 12%-os SDS-oldalas gélekre töltöttük. Az immunoblotálást a fent leírtak szerint végeztük a következő primer antitestekkel: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogén), -hiszton H3 (Pierce) és-ons-tubulin (Sigma T4026).

sejtvonalak

a következő humán CRC sejtvonalakat használtuk: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (ajándék C. Montagut-tól, Orvosi Onkológiai Osztály, Hospital del Mar, Barcelona, Spanyolország), HCT116 (CCL-247) és LS174T (ATCC cl-188). A CLDN1-pozitív SW480 sejtvonal (SW480-CLDN1) megszerzéséhez az SW480 sejteket stabilan transzfektáltuk az emberi CLDN1 cDNS klónnal (Invitrogen MGC gyűjtemény) vagy üres vektorral (pcdns) a jetPRIME (Polyplus-transfection Inc., Franciaország). A CLDN1-pozitív klónokat úgy választottuk ki, hogy transzfektált sejteket növesztettünk 500 jelenléte mellett 6G/ml genetin. A CLDN1 hangtompításhoz az SW620-AT az shRNS-t tartalmazó pSIREN vektorral transzdukáltuk CLDN1 (SW620shCLDN1) vagy luciferáz (shluc, negatív kontroll) ellen. 24 óra elteltével a sejteket 1 ~ g/mL puromicinnel választottuk ki, és stabil klónokat gyűjtöttünk össze. Az összes tranziens transzfekciót a jetPRIME adapt reagens alkalmazásával végeztük.

anti-CLDN1 előállítása mAb 6 F6

az ellenanyag-termeléshez 6-8 hetes nőstény balb / c egereket (Harlan, Gannat, Franciaország) kéthetente 4 millió egér NIH-sejtjének intrapitoneális (IP) injekciójával próbáltak ki átmenetileg transzfektálva CLDN1 cDNS-sel (NIH-CLDN1 sejtek) (összesen öt injekció). Az NIH-CLDN1 sejteket az első injekcióhoz teljes Freund adjuvánssal (Sigma), a másik négy injekcióhoz pedig hiányos Freund adjuvánssal (Sigma) kevertük. Az NIH-CLDN1 sejtek intravénás emlékeztető injekcióját három hónappal az ötödik immunizálás után adták be. Három nappal később az immunizált egerek lépsejtjeit összeolvasztották az egér myeloma sejtvonalával P3-X63-Ag.8.653 egér hibridomák előállításához. Az újonnan létrehozott klónok felülúszóit fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással (FACS) szűrtük SW480-CLDN1 és SW480 sejtekkel (negatív kontroll). A szűrési eredményeket SW620 és SW620-shCLDN1 sejtekkel végzett és kiegészítő szűréssel igazolták. Az anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 klónt a hígítás korlátozásával választottuk ki és klónoztuk. Az antitest-izotipizálás azt mutatta, hogy a 6 F6 IgG3k.

minden állatkísérletet a francia kormány kísérleti állatkísérletekre vonatkozó iránymutatásainak (ceea-LR-12052 megállapodás) megfelelően végeztek.

radioizotópos jelölés és SPECT-CT képalkotás

Női atimikus meztelen egereket (6-8 hetes) vásároltak a Harlan-tól. A 6 F6 mAb-ot radioizotóppal jelöltük 125i (Perkin Elmer) 370 MBq/mg specifikus aktivitással egyfoton emissziós számítógépes tomográfia (SPECT) képalkotás, a JÓDGEN (Pierce Chemical Co.) módszer. A farokvénás injekció után 16 MBq / 50 6G 125i-vel jelölt 6 F6, egész test egyetlen foton emissziós tomográfia/számítógépes tomográfia (SPECT/CT) képeket 4 fejű multiplexelő, több lyukú NanoSPECT kamerával (Bioscan Inc., Washington, USA) különböző időpontokban (48, 72 és 96 óra). Ezzel egyidejűleg az egész test mikro-CT képeit megszerezték anatómiai együttregisztráció SPECT adatokkal. A rekonstruált SPECT és CT adatokat Vizualizáltuk és együtt regisztráltuk Invivoscope segítségével.

Klonogén vizsgálat

a colorectalis rákos sejteket egy 6-lyukú lemezbe (150, 250 vagy 400 sejt/kút) vetettük be, és hagyjuk, hogy egy éjszakán át 37cc-n tapadjanak. Ezután 1 ml RPMI-t adtunk hozzá 6 F6 mAb-mal vagy anélkül (végső koncentráció: 100 6G/ml), és a sejteket hat napon át tenyésztettük. További hat nap után antitest nélküli táptalajon a lemezeket egy celigo (!)) segítségével olvastuk le a citométerről és az “egy kolónia-ellenőrzés” alkalmazásról. A Celigo GmbH citométer egy asztali in situ celluláris elemző rendszer, amely képeket nyújt a kutakról fényes mező megvilágítással (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

háromdimenziós (3D) szferoid kultúrák létrehozása

rendkívül alacsony rögzítésű, kerek fenekű 96 lyukú lemezeket (Corning Costar) használtunk a szferoid képződéshez. Az SW480, SW480-CLDN1 vagy SW620 sejteket 5 604-es sűrűséggel vetettük be. A sejtek 3D-s szferoidokban aggregálódtak és egyesültek 24-72 órán belül. A kutak képeit fáziskontrasztos mikroszkóppal készítettük a 5 db-os objektív, vagy a Celigo kb képalkotó citométerrel rögzítettük a “Tumorosphere” alkalmazás segítségével. A sejtek életképességét a CellTiter-Glo lumineszcens sejt életképességi vizsgálattal (Promega, Madison, WI, USA) értékelték. Miután 100 ml celltiter Glo reagenst adtak minden kúthoz 10 percig, a lumineszcenciát 1450-en mértük MicroBeta TriLux lumineszcencia mikrolemez olvasó (Perkin Elmer).

sejtciklus és proliferációs analízis szferoidokban

a Szferoidokat úgy állítottuk elő, hogy kútonként 1000 DiFi sejtet vittünk be ultra-alacsony kötődésű 96 lyukú lemezekbe, és 100 6 F6 MAB vagy irreleváns MAB (retuximab) jelenlétében növesztettük őket 5 napon keresztül. A sejtciklus-analízishez a sejteket pelletáltuk, tripszinizáltuk, PBS−sel mostuk, 75% – os etanolban rögzítettük, és 40 ~ g/ml propidium-jodiddal festettük 100 ~ g ml-1 RNáz (Qiagen) jelenlétében. A sejtciklus eloszlását FC500 Beckman csoroszlya áramlási Citométerrel határoztuk meg az FL-3 csatorna alkalmazásával. A sejteket egy ponttáblán kapuztuk, amely a DNS-impulzus-csúcsot a DNS-impulzus területével szemben mutatta, hogy kizárja a dubletteket. A sejtciklus eloszlásokat a Flow Jo elemző szoftver (Treestar, FLOWJO, Ashland, vagy, USA).

a tenyésztés 4. napján a sejtproliferációt úgy mértük, hogy a sejteket 5-etinil-2′-dezoxiuridinnel (EdU) inkubáltuk 24 órán keresztül. Ezután a sejtek tripszinizálása és rögzítése / permeabilizálása után 75% etanolban / PBS-ben a beépített EdU-t címkéztük és detektáltuk a Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) segítségével. A sejteket ezután inkubáltuk 1 6G/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) PBS/0,1% Triton X100-ban 37 kb 30 percig. A celigo “Expression Analysis” (cél 1 + maszk) alkalmazást használták a fluoreszcens jel számszerűsítésére és az adatok elemzésére. A sejteket a dapi nukleáris folt segítségével azonosítottuk, a DNS-szintézist pedig az EdU beépülésének mérésével számszerűsítettük.

egér xenograft modellek

1,5 606 sw620 sejtet vagy 3 606 difi sejtet szuszpendáltunk táptalajban, és subcutan (s.c.) injektáltunk a harlanból származó 6-8 hetes nőstény atimikus meztelen egerek jobb szárnyába. Amikor a tumor térfogata elérte a 100 mm3-t, az egereket különböző csoportokba randomizálták, és hetente kétszer 0,9% NaCl vagy 6F6 mAb (15 mg/Kg / injekció) i.p. injekcióval kezelték három egymást követő héten keresztül az első kísérletben és háromszor hetente a második kísérletben. A daganatokat kéthetente mértük féknyereggel, a térfogatokat pedig a következő képlettel számítottuk ki: D1 x D2 x D3/2.

Intraszplenikus máj kolonizációs modell

minden kísérletben 2 millió luciferáz-expresszáló SW620 sejtet (SW620-LUC sejteket) injektáltunk 6-8 hetes nőstény atimikus meztelen egerek lépébe. A lépet 2 perccel a sejtinjekció után távolítottuk el. Az injekció beadását követő 1. napon az egereket véletlenszerűen két, 10 egérből álló csoportra osztottuk, amelyeket vagy 15 mg/kg 6 F6 mAb vagy 0,9% NaCl-lal kezeltünk i.p. injekcióval, hetente háromszor. A metasztatikus képződés és disszemináció értékeléséhez a luciferáz expresszióját lumineszcencia képalkotással monitorozták luciferin (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer) injekció beadása után hetente egyszer. A műtét utáni 5. héten egereket áldoztak fel, a májat eltávolították, fényképezték és makroszkóposan látható metasztázisokat számoltak a máj felületén.

statisztikai elemzés

a statisztikai elemzést a STATA 13.0 szoftver (StataCorp) segítségével végeztük. Génexpressziós vagy immunhisztokémiai kísérletekhez a csoportok közötti különbségeket a Kruskall Wallis/Dunn teszt segítségével elemeztük. A CLDN1 génexpresszió és a progressziómentes túlélés (PFS) és a teljes túlélés (os) közötti összefüggéseket a teljes csoportban (n = 143 beteg) és a tumor molekuláris altípusa szerint értékelték. Ebből a célból a 143 beteget két csoportra osztottuk a medián CLDN1 génexpresszió alapján (azaz 9,75 ). A PFS és az OS értékeket Kaplan-Meier módszerrel hasonlították össze, és a túlélési eloszlások közötti különbségeket a log-rank teszttel értékelték.

a párosított t-tesztet használták az inkubáció hatásának összehasonlítására a 6 F6 mAb in vitro kísérletekben.

in vivo kísérletekben lineáris vegyes regressziós modellt alkalmaztak a tumor növekedése és az injekció utáni napok száma közötti kapcsolat meghatározására. A modell rögzített része a graft utáni napok számának és a különböző kezelési csoportoknak megfelelő változókat tartalmazott. Az interakciós kifejezéseket beépítették a modellbe; véletlenszerű elfogásokat és véletlenszerű lejtőket tartalmaztak az időhatás figyelembevétele érdekében. A modell együtthatóit a maximális valószínűség alapján becsülték meg. A túlélési arányokat az injekció beadásától a Kaplan–Meier módszer alkalmazásával a daganat 1500 mm3 térfogatának eléréséig becsülték. A túlélési görbéket a log-rank teszt segítségével hasonlítottuk össze. A máj kolonizációs kísérletekhez a csoportok közötti különbségeket a Mann-Whitney U teszttel értékeltük. Minden kísérlet esetében szignifikánsnak tekintették a különbségeket, ha P < 0,05.