a Gap junction protein Connexin-43 Az N-kadherin közvetlen transzkripciós szabályozója in vivo

embrió manipuláció

felnőtt X. A laevis-t 17 C-en tartották fenn, és a londoni University College biológiai szolgálati egységének előírásai szerint használták, megfelel az Egyesült Királyság otthoni irodájának az állatokról szóló törvényben meghatározott irányelveinek 1986 a leírtak szerint45. Az X. laevis embriókat a korábban leírtak szerint nyerték és állították színpadra 46, 47. Az idegi címer célzott megcélzásához embriókat injektáltunk az állati ventrális blasztomerekbe az egyik oldalon a nyolcsejtes szakaszban minden kísérlethez, kivéve, ha embrionális lizátumokat használtunk. Ebben az esetben embriókat injektáltunk a kétsejtű embriók mindkét állati oldalába. Az embrió mikroinjekcióit az alábbiak szerint végeztük48. Szükség esetén fluoreszcein-dextránt (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) vagy rodamin-dextránt (RDX; Invitrogen, D1824, 20 ng) használtunk nyomjelzőként. Oligomorfolinok X. laevis Cx43 ellen (Cx43MO1; 8-24 ng, 5′-TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTTTCTTGTGGGTCGA-3′) és BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′- Aacggaccgggtttttaaaggcttcct-3′) szintetizáltak és biztosítottak a Gene Tools LLC. A standard kontroll morfolino ekvimoláris koncentrációit (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5′) használtuk. A morfolinók mennyisége megegyezik a nyolcsejtű embriók egyik oldalán injektált mennyiségekkel, míg a másik oldalt belső kontrollként használták. Amikor embriókat használtak embrionális lizátumok gyűjtésére, kétsejtű stádiumban injektálták őket mind az állati blasztomerekbe, mind az említett dózisok kétszeresét alkalmazták. A cx43mos hatékonyságának tesztelésére az endogén cx43 mRNS-en western blot elemzést végeztünk. Mind a Cx43MOs hatékonyan csökkentette az endogén cx43fl és a Cx43iso fehérje szintjét (ábra. 3a, b). A btf3mo hatékonyságának validálása érdekében a neurális címersejtek immunfestésével teszteltük a btf3 fehérje expresszióját, amely csökkentette a BTF3 szintjét a BTF3MO sejtekben a CTLMO-hoz képest (kiegészítő ábra. 3a).

In situ hibridizációt végeztünk a korábban leírtak szerint49,50. Röviden, az embriókat MEMPFA-ban rögzítettük, majd egy éjszakán át digoxigeninnel jelölt próbákkal hibridizáltuk, AP antitesttel inkubáltuk, és AP aktivitást fejlesztettek ki NBT/BCP szubsztrátok felhasználásával. Digoxigeninnel jelölt RNS-próbákat készítettünk foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) és sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml), majd csavarja (0.7 µg/ml) volt értékelésére használt neurális címer indukciós, csavar (0.7 6G/ml) a neurális crest migrációhoz, az n-kadherin (1 0g/mL) az expressziós szintek és a btf3 (0,7 0g/mL) expressziós minta meghatározásához. A teljes körű immunfestést a korábban leírtak szerint végeztük55 cx43 antitest alkalmazásával (1:1000, Sigma, C6219). Röviden, az embriókat mepmfa-ban rögzítettük, és egy éjszakán át inkubáltuk az antitesttel a leírt hígítás mellett.

a Xenopus blastulákból (8.stádium) standard technikával (48,56) boncoltuk ki az Állatsapka-explantátumokat, és előkészítettük az in situ hibridizációra a fent leírtak szerint. Állati sapkás vizsgálatokhoz 500 pg mRNS-t injektáltunk a kétsejtű embriók két blasztomerjének állati oldalába. Az ISH elemzését feltételenként 20-25 embrión végeztük minden független kísérletnél.

neurális címermanipuláció és képalkotás

a neurális címerátültetéseket a korábban bejelentetteknek megfelelően végezték57. Röviden, a 18. stádiumú, fluoreszcensen jelölt embriókból vett neurális címereket szemöldök késekkel boncolták fel, és jelöletlen gazdaembriókba oltották be. In vitro kísérletekhez a cranialis neurális crest explantokat a 18. stádiumban boncoltuk standard technikával58, 59 és bevonva fibronektin (Sigma, F1141) bevonatú edényekkel, ahogy azt korábban leírtuk53. Egysejtes vizsgálatokhoz a neurális címersejteket röviden disszociáltuk Ca-ban2+ / Mg2 + – mentes Danilchick közeg53. Mindegyik állapot esetében tíz embriót fluoreszcens jelölt NC-vel transzplantáltak kísérletenként elemeztük.

immunfestést végeztünk a neurális címer explantokon, amint azt korábban leírtuk54 anti-N-kadherin (1:50, patkány IgG, MNCD2 klón, DSHB), Anti-e-kadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Az in vitro neurális címer migrációjának képalkotását time-lapse operatőrrel végeztük a korábban leírtak szerint53, 60. Röviden, a neurális címersejteket fibronektinnel bevont műanyag vagy üveg petri-csészékben tenyésztették, és egy órás in vitro tenyésztés után megkezdték a time-lapse mikrokópiát. A sejtek mozgékonyságához és migrációjához összetett mikroszkópokat (Eclipse 80i Nikon mikroszkóp Hamamatsu digitális fényképezőgéppel vagy DMRXA2 Leica mikroszkóp Hamamatsu digitális fényképezőgéppel, egyszerű PCI programmal vezérelve) használtak motorizált fokozatokkal és 10 6,30 na száraz lencsével. Az NC tenyészeteket a fent leírtak szerint állítottuk elő. A képeket 5 percenként, 12 órán keresztül vettük fel. a sejtmorfológiai képalkotáshoz egy TCS SP8 mikroszkópot használtak 63 6,90 na vízimmerziós objektív lencsével, amelyet LAS–AF szoftver vezérelt. A rögzített cellák leképezése 63 6,4 na–os olajimmerziós objektívvel és LAS-AF szoftverrel vezérelt Leica TCS SPE konfokális mikroszkóppal történt.

a konstrukció lokalizációjához vagy az endogén IF szintekhez 10-15 NCC-t elemeztünk minden egyes feltételre kísérletenként.

Sejtmigráció és sejtmorfológiai analízis

a kemotaxis analízist standard eljárás61 szerint végeztük, heparin akrilgyöngyökkel (Sigma, H5263) bevonva, 1 (Sigma, SRP3276) tisztított humán stromasejtből származó faktor-1-gyel (Sigma, H526). A sejtek motilitását és kemotaxisát ImageJ (https://imagej.nih.gov) elemző eszközökkel elemeztük, a korábban leírtaknak53, 60. Röviden, minden egyes sejtet manuálisan nyomon követtünk az ImageJ kézi nyomkövető pluginjával, az adatokat összegyűjtöttük és elemeztük az ImageJ Chemotaxis pluginjával. A sejtmorfológiát a körkörösségi index (complete circle = 1) alkalmazásával értékelték, és az ImageJ analysis tools segítségével becsülték meg. A sejt diszperziót Delaunay háromszögelési algoritmussal (ImageJ Plugins) elemeztük, és a korábban leírtak szerint átlagos explant háromszög területként ábrázoltuk54. A sejtek kiálló területét idegi címersejtekben elemeztük egy explant szélén, amely két egymást követő időkeretből származik, 4 perces időintervallummal; ezt a két egymást követő keretet kivontuk az új terület létrehozásához12. A sejt kemotaxisának és a sejt diszperziójának elemzéséhez feltételenként 10-15 explantátumot elemeztünk minden független kísérletben. A sejtek motilitása, a sejtek morfológiája és a sejtek kiemelkedései 15-25 NCC-t elemeztek Állapotonként kísérletenként.

molekuláris biológia, plazmidok és reagensek

a cDNS szintézishez a teljes RNS-t 10-15 embrióból izoláltuk 23-24.vagy 10-15. állati caps 8. stádiumból X. laevis Állapotonként minden független kísérlethez, és minden kísérletben három technikai replikát használtunk25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) mint sablon. A teljes hosszúságú Cx43-at (Cx43FL, aa 1-379), Cx43-at (cx43trunc, aa 1-212) és Cx43-20k konstrukciót (Cx43Tail, aa 213-379) 5 ‘Bamhi/3’ Xhoi pCS2+ vagy pCS2-EGFP vektorokká klónozták. A pCS2-EGFP vektort Dr. Masa Tada kedvesen biztosította. A Cx43Tail indukálható konstrukcióját úgy állítottuk elő, hogy a Cx43-20ktail (aa 219-379) a humán GR ligandumkötő doménjéhez (aa 512-777). A Cx43-20K-t klónozták az 5 ‘Ecori/3’ Aci-ba, a GR-t pedig az 5 ‘Aci/3’ Xhoi-ba a pCS2+ és a pCS2-EGFP-be. A BTF3 konstrukciókat az X segítségével szintetizáltuk. laevis-szekvencia cDNS-klónból (UniGene ID XL.3536). A BTF3FL-t (aa 1-162) 5 ‘Ecori/3’ Xhoi-ba klónozták pCS2+ vagy pCS2-EGFP. A btf3 deléciós konstrukciót, amelyből hiányzik az NLS régió RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158), 5 ‘Bamhi/3’ clai-ba klónozták2+. A BiFC kísérletekhez (ábra. A 4b, c), Cx43Tail és Cx43Trunc-ot klónozták 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi-ba a pCS2-VC155-ből. A BTF3FL-t 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi pCS2-VN9m-be klónozták. a BiFC vektorokat kedvesen James C. Smith professzor szolgáltatta. Az összes konstrukciós szekvenciát automatizált DNS-szekvenálással ellenőrizzük (Source Biosciences, Egyesült Királyság). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); 613 CX43 (800 PG/embrió, 63).

a fluoreszcens konstrukciók összes elemzését a háttérfluoreszcenciára és szükség esetén a teljes sejtterület fluoreszcenciájára normalizálva értékeltük.

a következő reagenseket használtuk: flufenamic sav (50 µM az NC explant inkubációs −100µM az embrió kezelés, Sigma, F9005), meclofenamic sav (50 µM az NC explant inkubációs −100µM az embrió kezelés, Sigma, M4531), actinomycin-D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698), valamint etanolban oldott dexametazon (10 µM) volt, ki a táptalaj a szakaszában 14-15, illetve fenn kell tartani, amíg a neurális címer migrációs embrionális szakaszában (színpad, 23). Az indukálható kimérák lehetséges szivárgásának szabályozására egy testvér embriót tenyésztettünk dexametazon nélkül, és in situ hibridizációra dolgoztuk fel. A kapcsolási teszthez (a gap junction channel aktivitásának tesztelése) 10-15 NCC-t elemeztünk Állapotonként kísérletenként.

Immunprecipitáció, frakcionálás és western blot

minden feltételhez 10-15 embriót használtunk az embrió lizátumainak elkészítéséhez kísérletenként. Teljes embriókat készítettünk western blot-ra a homogenizálás után lízis pufferben (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) hozzáadott proteáz inhibitorokkal (Roche, 11836153001) és foszfatáz inhibitorokkal (Roche, 04906837001)54,64. A western blotokhoz a következő antitesteket használtuk: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); röviden, a sejteket lízispufferben szuszpendáltuk, és 20 000 Ft-on 5 percig centrifugáltuk 4 ft-on, a felülúszót visszanyertük, és a térfogatot hígító pufferrel állítottuk be. A gyöngyöket hígító pufferben egyensúlyba hoztuk, majd összekeverjük a reszuszpendált sejtlizátummal. A keveréket mágnesesen tisztítottuk és western blot-ra készítettük. Az X. laevis embriók nukleáris frakciójának izolálását differenciális Centrifugálási protokollok alkalmazásával végeztük módosításokkal64, 65. Röviden, a 18. fázis X. laevis embrió lizátumai 22 G-os tűvel és 20 6L-es homogenizációs pufferrel (HB: 250 mM szacharóz, 20 mM Hepe, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, foszfatáz és proteáz inhibitorok) embriónként. Az összes mintát 250 g-on centrifugáltuk 5 percig az embrió törmelékének eltávolítására. Miután összegyűjtöttük a felülúszót, három különböző csőbe osztottuk, és három különböző sebességgel (400 600 g, 600 g) forgattuk 5 percig, hogy elkülönítsük a sejtmagokat. A posztnukleáris felülúszókat további feldolgozás céljából tartottuk. A nukleáris pelleteket még egyszer kimossuk HG pufferben, és centrifugáljuk a megfelelő sebességgel (400 600 g, 600 g). A nukleáris pelleteket ezután reszuszpendáltuk 40 Kb/l 10% glicerinben/0,1% SDS / 1% Triton-X-ben HB-ben. Minden mintához megfelelő mennyiségű mintapuffert adtunk, majd a mintákat akrilamid gélelektroforézishez és western blot analízishez dolgoztuk fel. A rakodási hibák elkerülése érdekében ugyanezt a membránt a rakodásszabályozóval szemben a korábban leírt sztrippelés után blotoltuk 54,64.

a Western blot adatait ImageJ elemző eszközökkel elemeztük. A képintenzitás normalizálódott, és a kérdéses fehérje aránya a terhelésszabályozáshoz (pl., MAPK vagy ons-tubulin) kiszámítottuk, az átlagos arányokat ábrázoltuk. A vágatlan blotok kiegészítő ábrákként szerepelnek (kiegészítő füge. 5–7).

Sejttenyészeteket

HeLa sejteket (Leibniz Institute Collections of mikroorganizmusok és sejttenyészet, DSMZ, Németország) tenyésztettünk DMEM-ben, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (Life Technologies, CA, USA) 37 Kb-os hőmérsékleten, 10% CO2-os párásított atmoszférában, és a Rotifect (Carl Roth, Németország) alkalmazásával a gyártó utasításainak megfelelően transzfektáltuk.

a Xenopus embrionális fibroblasztokat (XTC, az Ana Losada kedves ajándéka) 67% DMEM/H2O-ban tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal 25 ~ C hőmérsékleten, 5% CO2-os párásított atmoszférában, és a Viafect (Promega, USA) alkalmazásával a jelzett módon transzfektáltuk. A transzfekciós plazmidok a jelzett értékek szerint alakultak, és kísérletenként 10-20 Hela vagy XTC sejtet elemeztek minden egyes állapotra.

az siRNS kísérletekhez három btf3 elleni célzott siRNS kombinációját transzfektáltuk a fent leírtak szerint. A standard siRNA (kódolt siRNA tól től Sigma) kontrollként használták. Katalógusszám ezek kereskedelmi siRNA ellen BTF3 vannak: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. A sejteket 48 órával a transzfekció után gyűjtöttük össze, és feldolgoztuk qPCR, western blot vagy immunhisztokémiai kísérletekhez. A megfelelő szakaszokban leírtak szerint.

az összes sejtvonalat mycoplasma-fertőzésre tesztelték.

immunhisztokémiai és falloidin festés

a fehérje kimutatásához az emlőssejteket vagy a neurális crest explantokat 4% formaldehidben rögzítették 0,2% PBS-T-ben (PBS + 0,2% Triton X-100) 10 percig, és 10% NGS-vel blokkolták 1 órán keresztül. Az elsődleges antitesteket inkubáltuk a 4CC 10% NGS. A következő antitesteket használtuk: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 ~ g/ml Anti-n-kadherin (MNCD2 fejlődési vizsgálatok Hybridoma Bank), és 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) 10% NGS-ben, és inkubáltuk a 4 ~ C-nél.az Explantokat 3 alkalommal mossuk PBS + 0,2% Tween-20-val, és 4 ~ C-nél inkubáltuk másodlagos antitesttel, hígítva 1:350-nél 10% NGS-ben. A DAPI-t 1:1000 arányban hígítottuk és a másodlagos antitestekkel kevertük.

tömegspektrometria

a zászlóval jelölt cx43tail tömegspektrometriás analízishez szükséges együttimmunprecipitációjához a sejteket lizáltuk, és a lizátumokat egy éjszakán át inkubáltuk anti-HA-val és egyensúlyban lévő nagy affinitású gyöngyökkel 4CC-n, az immunprecipitátumokat ezután megmossuk és elutáltuk27. Ezt követően a savas elúciót 0,1 M glicin pH-jával 2,5, az eluátok pH-ját 8,0 pH-ra állítottuk be 0,5 M Tris mellett. A fehérje emésztéséhez a mintákat egy éjszakán át inkubáltuk 2-vel 6G tripszin (tripszin arany, Promega, USA), majd 0 hozzáadásával.1 6 h. a peptideket sótalanítottuk a C-18 fordított fázisú szakaszokon (Nest Group, USA), vákuumban szárítottuk és -20 C-on tároltuk az elemzésig. A szárított peptidkeverékeket 3 db 30% – os hangyasavban nyerjük ki, majd vízzel 23 db 6L-ra hígítjuk. A digest öt darabját injektáltuk Nano-LC rendszerre (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA), és a peptideket fordított fázisú kromatográfiával választottuk el a házon belül elkészített C-18 oszlopokon (Reprosil-Pur C18-AQ, 1,9 6m, Dr. Maisch, Németország, PicoFrit oszlopok, 75 ~ m i.d., Új Obejctive, USA) lineáris gradiensben 100% a eluens (0,1% hangyasav) 55% B eluens (60% aktenitril, 0,1% hangyasav) 120 perc alatt. Az LC-rendszert szellőztetett oszlopként állították be, a mintát 400 nl/perc áramlási sebességgel töltötték be és sótalanították, az elválasztást pedig 200 nl/perc áramlási sebességgel hajtották végre. A nano-LC rendszert elválasztották a tömegspektrométerhez (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Németország), amelyet adatfüggő módban működtettek. Az adatok értelmezését Mascot V2.2 (Matrixscience, Egyesült Királyság) és Progenesis LC–MS V4.1 (nemlineáris dinamika, Egyesült Királyság) alkalmazásával végeztük. Az adatok értelmezését a MaxQuant V1.6.1.0 és a Perseus V1.6.1.3 (MPI of Biochemistry, Németország) alkalmazásával végeztük.

kapcsolási vizsgálat

a Gap junction intracelluláris kommunikációját festékcsatlakozási vizsgálattal teszteltük. Itt a calcein-AM (Sigma, 17783) fluoreszcens festéket használtuk. A Be nem injektált embriókból boncolt idegi címerpopulációt inkubáltuk a festékkel Calcein-AM körülbelül 10 percig, vagy amíg a festék be nem töltődött az összes sejtbe. A nukleáris markerrel injektált embriók egy másik idegi címerpopulációját (nRFP mRNS injekciók, lásd fent)külön boncoltuk. Miután a két populációt kalcium és magnézium hiányában disszociálták, összekeverjük őket, és 1 órán át inkubáljuk 14 oc-on egy kémcsőben. Enyhe centrifugálás után a neurális címer explantokat hasonló méretű darabokra vágták, a fent leírtak szerint tenyésztették, majd filmre vették. A réscsatlakozások csatorna aktivitásának tesztelésére réscsatlakozási blokkolókat, meklofenaminsavat (Sigma, M4531) és flufenaminsavat (Sigma, F9005) használtunk. A sejtkommunikációt úgy értékeltük, hogy megbecsültük azon sejtek számának arányát, amelyek mind a nyomjelzőket, mind a nukleáris markert, mind a Kalceint megjelenítik a nukleáris markerrel rendelkező sejtek teljes számához képest.

statisztikai elemzés

a minta méretének becslését korábban publikált munka alapján végezték el, és nem alkalmaztak specifikus statisztikai módszert. A kísérleteket nem randomizálták, és a kísérletek jellege miatt a szerzők nem voltak vakok az elosztásra mind a kísérletek, mind az eredmények elemzése során. Csak életképes embriókat és explantátumokat vizsgáltak. A rosszul injektált embriókat nem vették figyelembe az in situ hibridizációs kísérletekben. A helyes injekciót lineáris nyomjelzők injekciójával határoztuk meg. Kísérleti paramétereinket véletlenszerűen mértük, Miután kiválasztottuk az életképes és megfelelően injektált embriókat.

a százalékok összehasonlítását készenléti táblázatokkal végeztük66. Az adathalmazok normalitását Kolmogorov–Smirnov tesztjével, D ‘ Agostino és Pearson tesztjével, Shapiro–Wilk tesztjét pedig Prism6 (GraphPad) segítségével tesztelték. A normál eloszlást követő adatkészleteket összehasonlítottuk a Student t-tesztjével (Kétfarkú, egyenlőtlen eltérések) vagy az ANOVA-val egy Dunnett többszörös összehasonlításával az Excel vagy a Prism6 (GraphPad) használatával. A normál eloszlást nem követő adatkészleteket összehasonlítottuk Mann Whitney tesztjével vagy egy nem paraméteres ANOVA-val (Kruskal Wallis Dunn többszörös összehasonlításával a teszt után) Excel vagy Prism6 használatával. Kereszt-összehasonlításokat csak akkor végeztek, ha az ANOVA teljes p értéke kisebb volt, mint 0,05. Minden ábra legendák N = száma független kísérletek; n = teljes minta mérete.

X. laevis n-cadherin részleges promoter azonosítás

a Xenopus n-cad alapvető promoterének azonosításához a következő stratégiát alkalmaztuk. A chick és az emlősök n-kadherin génjeiből származó alapvető promoter régiót az 5′-UTR régiókban írták le, a -3000 és -1 bp pozíción belül tiszteletben tartják a transzlációs iniciációs helyet41, 67. Az X. laevis Genome Project erőforrás (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) felhasználásával 2800 bp régiót azonosítottunk az X. laevis n-cadherin gén 5′-UTR-jében (kiegészítő ábra. 4). Mivel adataink azt mutatják, hogy a Cx43Tail, a BTF-3 és a Pol II egy komplexet alkotnak, az ElemeNT tool68 segítségével potenciálisan aktív Tata dobozokat keresünk az izolált régióban. In silico elemzésünk egy Tata box gazdag régiót tárt fel a pozíciók között -166 nak nek -618 bp, a fordítás kezdő helyéhez viszonyítva (kiegészítő ábra. 4). Végül átfedő primereket tervezünk a 200 bp fragmentumok erősítésére ebben a régióban. A primerek szekvenciáit a ChIP szakasz sorolja fel, kötési régióikat pedig a kiegészítő ábra emeli ki. 4.

kromatin immunprecipitáció (ChIP)

a kromatin immunprecipitáció (ChiP) esetében az X. laevis embryos69, 70 standard eljárását követtük. Minden független kísérlethez két technikai replikát és Állapotonként 250-300 Xenopus embriót használtunk. Röviden, a neurula stádiumú X. laevis embriókat 15 percig rögzítettük, és 3 6G Pol II antitestet (Diagenode, C15100055) vagy GFP ChIP minőségű antitestet (Abcam, ab290) használtunk. A DNS-kivonáshoz egy szabványos protokollt követtünk 69,70. Az Elemelemzési erőforrás segítségével feltételezett Tata dobozokat kerestünk az X-ben. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5′-AGTCTGCTTTTAGGAGACAACG-3 ‘

és relatív kötőhelyeiket a kiegészítő ábra mutatja. 4b. a ChIP kísérleteket az alábbiak szerint számszerűsítettük: a sáv intenzitásának normalizált arányát az egyes állapotokra átlagoltuk, és kiszámítottuk az IgG kontrollra vonatkozó hajtásnövekedést, és a hajtás dúsítását ábrázoltuk. A sáv intenzitását az ImageJ Gels analysis plugin segítségével regisztrálták. A vágatlan géleket a kiegészítő ábra mutatja. 7c, d.