a heterokromatin óránkénti stabilizálása elősegíti az őssejtek megújulását és a porc regenerálódását

antitestek

western blotting esetében: anti-óra (#5157, 1:1000), Anti-HP1a (#2616s, 1:1000) és anti-HP1y (#2619, 1:3,000) a sejtjelző technológiából; anti-kap1 (Ab22553, 1:2,000), anti-Lamin B1 (ab16048, 1:1,000) és anti-LBR (Ab32535, 1:1,000) az abcam-ból; anti-69879, 1:3,000) a Santa Cruz biotechnológiából.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) R&D rendszerekből.

áramlási citometriához: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) és anti-CD19 (555415, 1:200) a BD Biosciences-től; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) és anti-pDPN (17-9381-42, 1:200) az ebioscience-től (San Diego, Kalifornia, USA); anti-cd29 (303004, 1:200), anti-cd13 (301705, 1:200), anti-cd166 (343903, 1:200) és anti-CD164 (324805, 1:200) a biolegend-től (San Diego, Kalifornia, USA).

sejttenyészet

óra+/+ HESC-ket (hESCs, line H9, WiCell Kutatóintézet) és óra−/− HESC-ket tartottak fenn a hesc táptalajban mitomicin C-inaktivált egér embrionális fibroblasztokból (MEF-ek) álló feeder rétegeken. A hesc táptalaj DMEM/F12-et (Thermo Fisher Scientific), 20% – os kiütéses Szérumpótlást (Thermo Fisher Scientific) tartalmazott, 0.1 mM-es nem esszenciális aminosav (Neaas, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 mm-es merkaptoetanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/sztreptomicin (Thermo Fisher Scientific) és 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Alternatív megoldásként a hesc-ket Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) bevonatú lemezeken tenyésztették mTeSR közegben (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada).

mind a hESC-ből származó hmsc-ket, mind az elsődleges hmsc-ket MSC táptalajban tartották, amely MEMa-t (Thermo Fisher Scientific) tartalmazott, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/sztreptomicin (Thermo Fisher Scientific) és 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR/Cas9 által közvetített génszerkesztés a hESCs-ben

a CRISPR/Cas9 által közvetített génszerkesztést korábban leírt módszerekkel, néhány módosítással végeztük.33,34,65 röviden, egy útmutató RNS célzó exon 5 óra (óra-grns) klónoztuk egy grns klónozás vektor (#41824, Addgene) (kiegészítő információk, táblázat S1). Az Y-27632 (S1049, Selleck) kőzet-inhibitorral 24 órán át végzett kezelés után a hesc-ket (5 606!) reszuszpendáltuk 100 ~ ml Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) plazmid koktélba, amely a homológiai karokat, a CLOCK-grns-t és a hCas9-et (#41815, Addgene) tartalmazó donor plazmidból állt, és 4D-Nucleofector rendszerben (Lonza) elektroporáltuk. A sejteket ezután MEF feeder sejtekre vetettük. A G418-at (100 KB/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) adtuk hozzá a pozitív szelekció megindításához 2-4 nappal az elektroporáció után. 2 hetes szelekció után a G418-rezisztens klónokat leszedtük, és egy 96 lyukú lemezre helyeztük a további jellemzéshez és bővítéshez. A genomiális PCR-t és a western blot-ot használták a genomikai szerkesztés azonosításához. Ezenkívül eltávolítottuk a neomicin− rezisztencia kazettát óra−/ – hESCs-ben elektroporációval a pCAG-FLpo-2a-puro vektorral. Három nappal a transzfekció után 1 db 6G / mL puromicint (Thermo Fisher Scientific) használtunk a puromicin-rezisztens sejtek dúsítására 48 órán keresztül.8-12 napos szelekció után a kialakuló kolóniákat leszedtük és kibővítettük a későbbi vizsgálatokhoz.

a hMSC generálása és jellemzése

a hmsc-ket egy korábban közzétett protokoll alapján különböztették meg a hesc-ktől.25,86,87 röviden, a hesc-ket embrioid testekké (EBs) disszociálták,és differenciálódási közeggel kezelték (MEMa (Invitrogen), kiegészítve 10% FBS-sel (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm NEAAs (Thermofisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGF stb.és 1% penicillin/sztreptomicin (Gibco)) Matrigellel bevont lemezeken 10 napig, 95%-os összefolyásig. Ezután az összefolyó MSC-szerű sejteket megemésztettük és Matrigellel bevont lemezeken MSC táptalajjal kezeltük, amely 10% FBS-t, 0,1 mM NEAAs-t, 1 ng/mL bFGF-et és 1% penicillint/sztreptomicint (Gibco) tartalmazó mema-t (Invitrogen) tartalmazott. Ezután az összefolyó MSC-szerű sejteket zselatinnal bevont lemezekké továbbítottuk. A HMSC-ket különböző, a HMSC-specifikus markereknek megfelelő antitestekkel (CD73, CD90 és CD105) tisztítottuk a FACS-k által. A cd73, CD90 és CD105 hármas pozitív sejteket további felületi antigén markerek jellemezték, beleértve a pozitív markereket, mint például a CD44, CD166, CD29, HLA-ABC és CD13, valamint a negatív markereket, mint például a CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 és PDPN. A hmsc-k funkcionalitását tovább igazolták a chondrocyták, adipocyták és osteoblastok felé történő differenciálódással. A hmsc-kből származó oszteoblasztokat, kondrocitákat és adipocitákat von Kossa festéssel jellemezték (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) és osteocalcin festés (osteogenesis jelzésére), toluidin kék (T3260, Sigma) és aggrecan festés (chondrogenesis jelzésére), valamint Olajvörös o (O1391, Sigma) festés (adipogenesis jelzésére) a gyártó utasításait követve.

az elsődleges hmsc-K izolálása és tenyésztése

az elsődleges hmsc-ket különböző egyének ínyéből izolálták.23,33,34,65 a fogínytől elválasztott szöveteket apró (1 mm2) darabokra vágtuk ollóval a Tryple-I (1!) expressz enzimben és a Dispase IV-ben, majd tovább inkubáltuk 37! (30) C hőmérsékleten. Az emésztett szövetszuszpenziókat MSC táptalajjal semlegesítettük, majd 200 hektár g-on 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A kapott pelleteket 10% FBS-sel (Gibco), 1 ng/mL bFGF-sel és 1% penicillin/sztreptomicinnel (Gibco) kiegészített MEMA-t (Invitrogen) tartalmazó MSC táptalajba reszuszpendáltuk, és zselatinnal bevont lemezekre helyeztük a primer hmsc-k növekedéséhez.

Luciferase reporter assay

a PER2-dLuc plazmid E. E. Zhang kedves ajándéka volt.88 sejteket hordozó PER2-dLuc nőttünk összefolyása 24-kút tenyésztési lemezek és szinkronizált 20 ons Forskolin (s2449, Selleck) a 2 h. a közeg ezután helyébe MSC táptalaj, amely 0,25 mM luciferin (LUCK-1g, GoldBio). A sejteket lumicycle luminométerben monitoroztuk 37cc-n 5-7 napig; a generált adatokat LumiCycle elemző szoftverrel (Actimetrics) elemeztük. Az első 24 órás ciklus adatait kizártuk statisztikai elemzésünkből.

In vitro hmsc szinkronizálás és cirkadián analízis

a hmsc-ket zselatinnal bevont lemezeken MSC táptalajon 95% – os összefolyásig bevontuk. A szinkronizáláshoz a sejteket ezután 20 h-os forskolinnal kezeltük 2 h-ra, majd kétszer PBS-sel történő mosás után MSC táptalajban tároltuk. A sejteket a 24 órás utószinkronizálástól kezdve, 3 órás időközönként, 9 időpontban gyűjtöttük össze, majd RNS extrakcióval és RT-qPCR detektálással. A jtk_cycle nemparametrikus tesztet használtuk a cirkadián oszcillációk ellenőrzésére a korábban leírtak szerint.A hmsc-k 89 Időfolyam-szálát, amelyek mind p, mind q értéke < 0,05, ritmikusnak tekintették.

Western blot

a sejteket 4% SDS-t és 100 mm-es Tris-HCl-t tartalmazó SDS pufferben lizáltuk. A fehérjekoncentrációt egy BCA kvantifikációs készlet (Thermo Fisher Scientific) segítségével számszerűsítettük, és mintánként ~20 GB fehérjét SDS-PAGE-nek vetettünk alá, és elektrotranszferáltunk PVDF membránokra (Millipore). Ezután a membránokat 5% tejjel blokkoltuk, majd primer antitestekkel, majd torma-peroxidázzal (HRP) – konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk. Az immunreaktív sávokat egy ChemiDoc XRS+ rendszerben (Bio-Rad) vizualizáltuk. A statisztikai elemzéseket az Image J software (NIH) számszerűsítette. Minden csoportnak három független kísérlete volt. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

transzmissziós elektronmikroszkópos

késői (P9) óra+/+ és óra-/− hmsc− ket enzimatikusan betakarítottuk TrypLE-vel (Thermo Fisher Scientific), és 500 hektáronként 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A kapott pelleteket 4% paraformaldehiddel (PFA) PBS-ben (pH 7,4) rögzítettük jégen egy éjszakán át. A sejteket ezután etanolok Osztályozott sorozatában dehidratáltuk, permeabilizáltuk és beágyaztuk a Hm20 Lowicryl gyantába. A metszeteket (200 nm) 100 kV-on működő szeszes transzmissziós elektronmikroszkóppal (Fei Company) vettük fel és képeztük.

immunfluoreszcens festés

a fedőlapokon (Thermo Fisher Scientific) beültetett sejteket kétszer mossuk PBS-sel. Ezután a sejteket 4% PFA-val rögzítettük 30 percig, 0,4% Triton X-100-mal permeabilizáltuk PBS-ben 30 percig, majd 10% szamárszérummal blokkoltuk PBS-ben (Jackson Immuno Research) 1 órán át szobahőmérsékleten. Blokkolás után a sejteket primer antitestekkel inkubáltuk 4CC éjszakán át. Ezt követően a sejteket háromszor mossuk PBS-sel, másodlagos antitestekkel inkubáljuk szobahőmérsékleten 1 órán át, majd háromszor PBS-sel mossuk. A magokat a Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). A képalkotást Leica SP5 konfokális rendszerrel végezték. A fluoreszcencia jelek számának, intenzitásának és területének statisztikai elemzését az Image J software (NIH) segítségével számszerűsítettük. A sejteket három biológiai replikátumból gyűjtöttük össze. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük. A h3k9me3 festés 3D rekonstrukciója az ábrán látható módon. A 2F-et soros z-stack metszéssel hajtottuk végre 50 nm-es intervallumokkal hagyományos üzemmódban, legfeljebb 50 képhez Leica SP5 konfokális rendszerrel, majd 3D rekonstrukcióhoz tovább dolgoztuk fel Imaris szoftver (7.4.2 verzió), amint azt korábban leírtuk.90

SA-ons-Gal festési vizsgálat

SA-Gal festést a korábbi vizsgálatok szerint végeztünk.33,34 röviden, a sejteket fixáló pufferrel rögzítettük (2% formaldehid és 0.2% glutáraldehid) 5 percig szobahőmérsékleten. Azután, a rögzített sejteket friss festőoldattal festettük 37 Kb egyik napról a másikra. A látómezőket véletlenszerűen választottuk ki az egyes kutakban, és az SA-ons-Gal-pozitív sejtek százalékos arányát az ImageJ szoftver segítségével határoztuk meg. Minden csoportnak három biológiai replikációja volt. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

klonális expanziós vizsgálat

klonális expanziós vizsgálatot végeztek, amint azt korábban jelentették.34,65 röviden: 6000 sejtet vetettek be kútonként 6 kútlemezbe, és 9-12 napig tenyésztették. A sejteket kétszer PBS-sel mostuk, 4% PFA-val rögzítettük, majd 0,2% kristály ibolyával festettük 1 órán át szobahőmérsékleten. A látómezőket szkennerrel szkennelték, majd az ImageJ software (NIH) segítségével tovább mérték. Minden csoportnak három biológiai replikációja volt. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

Co-IP

Hek293t a Flag-Luc vagy Flag-CLOCK és hmsc-ket expresszáló plazmidokkal transzfektált sejteket CHAPS lízis pufferben lizáltuk (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5), és a teljes proteáz inhibitor koktél (Roche)) a 4 6 h, majd centrifugáljuk 14 500 g 4 4 40 min. Az exogén fehérjékkel való Co-IP esetében a felülúszókat Anti-Flag antitest-kapcsolt gyöngyökkel (A2220, Sigma) kevertük, és egy éjszakán át forgattuk 4 ~ C-nél.az endogén fehérjékkel való Co-IP esetében a felülúszókat egy éjszakán át 4 ~ C-nél forgatással kevertük a jelzett antitestekkel, majd a/G Protein plusz agaróz gyöngyökkel (sc-2003, Santa Cruz) inkubáltuk további 4 órán át 4 ~ C-nél forgatással. A gyöngyöket hatszor mostuk CHAPS pufferrel, majd zászló peptidekkel eluáltuk, vagy forralva 1 KB SDS betöltő puffer 10 percig a western blotoláshoz.

LC-MS/MS analízis és fehérje azonosítás

az immunprecipitációval nyert eluált fehérjéket 10% SDS-PAGE-nek vetettük alá, és coomassie brilliant blue-val festettük (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Kft). A fehérjemintákat tartalmazó gélszalagokat kimetszettük, kis dugókra vágtuk, dehidratáltuk (100% acetonitril), redukáltuk (10 mM DTT 25 mM NH4HCO3-ban 45 percig 56 6CC-n) és alkileztük (40 mM jódacetamid 25 mM NH4HCO3-ban 45 percig szobahőmérsékleten sötétben). Ezután a géldugókat szárítottuk és szekvenálási fokozatú módosított tripszinnel (40 ng / sáv) emésztettük 25 mM NH4HCO3-ban egy éjszakán át 37cc-n. végül hangyasavat alkalmaztunk 1% – os végső koncentrációra az enzimatikus reakció befejezéséhez. A kapott oldatot ezután egy mintaüvegbe helyeztük LC-MS / MS analízis céljából.

a nanoLC-MS/MS kísérleteket Q Exactive tömegspektrométeren (Thermo Scientific) hajtottuk végre adatfüggő módban, amely lehetővé tette az MS adatgyűjtést 70 000 (m/z 200) nagy felbontásban,300-1600 m/z tartományban. A Q Exactive analysis nyers adatait proteom Discoveryvel (1.4-es verzió) elemeztük a sequest ht Search engine for protein identification és a perkolator for false discovery rate (FDR) analízis segítségével. Az adatokat a UniProt humán fehérje adatbázis (frissítve 06-2013). Az FDR analízist Perkolátorral végezték, és az FDR < 1% volt a fehérje azonosításának küszöbértéke. A peptid megbízhatóságát magasra állították a peptidszűréshez.

RT-qPCR és RNS-Seq

a teljes RNS-t tenyésztett emberi sejtekből vagy egérízületekből extraháltuk TRIzol (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával, és a genomi DNS-t DNS-mentes kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével távolítottuk el. a cDNS-t a Go szkript fordított transzkripciós rendszer (Promega). Az RT-qPCR-t qPCR Mix (Toyobo) alkalmazásával végeztük CFX384 valós idejű rendszerben (Bio-Rad). Minden csoportnak négy jól replikált példánya volt. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük. Minden RT-qPCR kísérletet legalább három kísérleti ismétléssel végeztünk, és egymástól függetlenül legalább két alkalommal megismételtük. Egérízületi RNS-seq esetében az idősebb egerek ugyanazon kezelési csoportjából származó térdízületi RNS-mintákat, amelyeket Luc-t expresszáló lentivírusokkal (n = 12 egér) vagy CLOCK-ot (n = 12 egér) injektáltak, egyenlő tömegben keverték össze, és az RNS-seq-t két technikai ismétléssel végezték. A hMSC RNS-seq esetében két biológiai replikációt vizsgáltunk. A szekvenáló könyvtárat egy Nebnext Ultra RNS Library Prep készlet felhasználásával készítették az Illumina számára a gyártó protokollját követve. A létrehozott könyvtárakat Illumina HiSeq X-Ten platformon szekvenáltuk, párosított végű szekvenálással, 150 bp olvasási hosszúsággal. A minőségellenőrzést és a szekvenálást a NoVo gene bioinformatikai technológia végezte. A qPCR-hez használt primereket a kiegészítő információk, az S2 táblázat tartalmazza.

RNS-seq adatfeldolgozás

az RNS-seq adatfeldolgozási folyamatról korábban már beszámoltak.34 nyers párosított végű olvasatot vágtak le a Trim Galore szoftverben (0.4.5 verzió) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). A tiszta olvasásokat az UCSC humán hg19 genomjához vagy egér mm10 genomjához térképeztük fel a hisat2 (2.0.4 verzió) segítségével.91 A sam fájlokat a SAMtools “-S-b-q 10″paraméterrel konvertálta bam fájlokká.92 ezután a HTSeq (0.11.0 verzió) kiszámította az olvasások számát, és csak a kiváló minőségű leképezett olvasások maradtak meg (leképezési minőség > 20).93 Az egyes génekre vonatkozó Kilobázis / millió (Fpkm) fragmenseket StringTie (1.2.3 verzió) segítségével számítottuk ki.94 Differenciálisan expresszált gént (DEGs) számítottunk ki a DESeq2 csomag (1.22.2 verzió) alkalmazásával, a “q érték (korrigált p érték, padj) < 0,05 és |log2 (hajtásváltás)| > 1 a hmsc-k esetében vagy |log2 (hajtásváltozás)| > 0,5 az egér ízületeihez”határértékkel. A gén ontológiai (GO) dúsítási analízist ToppGene-nel végeztük.A GSEA 95 génkészlet-dúsítási elemzést végzett (2.2.4 verzió). A SASP génkészletet egy korábbi vizsgálatból nyertük.42

DamID-seq

a pLgw V5-EcoDam és a pLgw EcoDam-V5-EMD Prof. Bas van Steensel (a Holland Rákkutató Intézet (nki)) ajándéka volt. A DamID-seq-t a leírtak szerint hajtottuk végre,58 módosításokkal. Röviden, a HEK293T sejtekből előállított Dam és Dam-EMD lentivírusokat ultracentrifugációval koncentráltuk 19 400 g-on 2,5 órán keresztül. A CLOCK+/+ és CLOCK−/− hmsc-ket hat kútból álló edényekbe vetettük be, kútonként 2 605 sejtben. Minden csoportnak három biológiai replikációja volt. Másnap a táptalajt 2 mL Dam vagy Dam-EMD lentivírust tartalmazó friss táptalajjal helyettesítettük. A transzdukció után 72 órával a sejteket begyűjtöttük, és a genomi DNS-t egy DNeasy vér & szövetkészlet (69504, Qiagen) segítségével izoláltuk. A DpnI (R0176S, New England Biolabs) emésztést, adapter ligálást, DpnII (R0543S, New England Biolabs) emésztést, PCR amplifikációt és tisztítást a korábban leírtak szerint végeztük.58 Az adapter vágásához az amplifikált DNS-t szonikáltuk és Alwi-val emésztettük (R0513S, New England Biolabs). A DNS-könyvtárat egy Nebnext Ultra DNS-könyvtár előkészítő készlet felhasználásával építették az Illumina számára (E7370S, New England Biolabs). A könyvtárakat összevonták, és párosított végű szekvenálásnak vetették alá 150 bp olvasási hosszúságú Illumina NovaSeq szekvencereken.

DamID-seq adatfeldolgozás

a CLOCK+/+ és CLOCK-/− hmsc− k Dam és Dam-EMD adatainak nyers olvasását a Trim Galore szoftverrel (0.4.5 verzió) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) vágtuk le. A vágott olvasmányokat az UCSC humán hg19 genomjára térképeztük fel Bowtie 2 (2.2.9 verzió).96 PCR duplikátumot távolítottunk el a Markduplikátumokkal.jar program Picard eszközök. Ezután az olvasásokat a SAMtools (1.6 verzió) segítségével rendezték. A szekvenálási torzítás és mélység hatásának minimalizálása érdekében az egyes minták három ismétléséből származó feldolgozott leolvasásokat egyesítettük. Ezután ugyanazt a számot (110 millió) kiváló minőségű olvasás minden sejttípusra véletlenszerűen választottuk ki a downstream elemzéshez. A DamID jelek vizualizálásához kiszámoltuk a Dam-EMD és Dam jelek (log2 (Dam-EMD/Dam)) olvasásának kilobázis/ millió leképezett olvasásának log2 arányát a CLOCK+/+ és CLOCK− / − hmsc-kben minden 10-bp bin-re a deepTools (2.5.4-2-5ee467f verzió) szoftver bamCompare programjával.

A Lad régiók azonosításához a CLOCK+/+ és CLOCK−/− hmsc-kben először kiszámítottuk a DamID jeleket (a Dam-EMD és a Dam jelek rpkm− jének log2 aránya (log2 (Dam− EMD/Dam)) CLOCK+/+ és CLOCK-/-hmsc-kben minden 2 kb-os bin esetében a bamcompare program segítségével a deepTools-ban (2.5.4-2-5ee467f verzió) szoftver. Ezután megvalósítottuk az R csomagot a rejtett Markov modellekhez t-kibocsátással (HMMt) (0.1 verzió), a legények azonosítására (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

a Clock+/+ és a CLOCK−/− hmsc− k közötti Lad− jelek összehasonlításához egyesítettük a CLOCK+/+ és CLOCK−/− hmsc-kben azonosított LAD-régiókat az egyes union lad-régiókra, és kiszámítottuk a relatív DamID-jelet (DamID-jel az CLOCK – / – hmsc-kben mínusz DamID-jel az CLOCK+/+ hmsc-kben). Ezután a LAD régiók relatív DamID jeleit ábrázoltuk R csomag RIdeogram (0.2.2 verzió), amint azt a kiegészítő információk, ábra. S4d.97

ChIP-qPCR és ChIP-seq

röviden, 1 606 óra+/+ és óra – / – hmsc-ket térhálósítottunk 1 térfogat / térfogat% – os formaldehidben PBS-ben 8 percig szobahőmérsékleten, és a reakciót 125 mM-es glicinnel 5 percig szobahőmérsékleten történő inkubálással fejeztük be. A mintákat ezután további 10 percig jégen lizáltuk. Miután szonikáció Covaris S220 fókuszált ultrasonicator (Covaris) és centrifugálás 10 percig 12,000 XNUMX XNUMX XNUMX XNUMX g-nál 4 6CC-nél, felülúszókat inkubáltunk egy éjszakán át 4 6CC-nél a fehérje a Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004d) konjugált egy anti-óra antitest, egy anti-H3K9me3 antitest vagy nyúl IgG. Ezt követően elúciót és fordított térhálósítást végeztünk 68 6CC-on 2 órán át egy termomixerben. Ezután a DNS-t izoláltuk fenol-kloroform-izoamil-alkohol extrakcióval és etanol kicsapással. A tisztított DNS-t qPCR-nek vetettük alá az óra vagy a H3K9me3 foglalkozás értékelésére ismétlődő szekvenciákon. A dúsított töredékeket könyvtárakba építették be anélkül, hogy a kapa Hyper Prep készleteken keresztül beépítették volna a beépített vezérlőket PCR Könyvtárerősítéssel/Illumina sorozattal (KK8504, New England Biolabs) a gyártó utasításait követve. Az összes kísérletet legalább kétszer elvégeztük hasonló eredményekkel. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

ChIP-seq adatfeldolgozás

a H3k9me3 ChIP-seq adatok feldolgozásához a nyers olvasásokat Trim Galore szoftverrel (0.4.5 verzió) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) vágták le. A vágott olvasmányokat az UCSC humán hg19 genomjára térképeztük fel Bowtie 2 (2.2.9 verzió).96 duplikált olvasást távolítottunk el a Jelölésselduplikátumok.jar program Picard eszközök. Ezután az olvasásokat a SAMtools (1.6 verzió) segítségével rendezték. A szekvenálási torzítás és mélység hatásának minimalizálása érdekében az egyes minták három ismétléséből származó feldolgozott leolvasásokat egyesítettük. Ezután ugyanazt a számot (130 millió) kiváló minőségű olvasás minden sejttípusra véletlenszerűen választottuk ki a downstream elemzéshez. A ChIP-seq jelek megjelenítéséhez kiszámítottuk a normalizált olvasási számokat az egyes 10 bp-os bin RPKM értékeinek meghatározásával. A H3K9me3 csúcshíváshoz a SICERT (v1.1 verzió) a “-w 200-g 3″paraméterrel használtuk.98 csak az úgynevezett H3K9me3 csúcsok, amelyek FDR határértéke 1% vagy magasabb, megmaradtak.

a “H3K9me3 hegyek” azonosításához kiszámítottuk a h3k9me3 jelet milliószámban (CPM) az egyes H3K9me3 csúcsokban. Ezután rangsoroltuk a H3K9me3 csúcsokat a növekvő h3k9me3 jel sorrendjében, és ábrázoltuk a H3K9me3 ChIP-seq foglaltságot óra+/+ és óra−/− hmsc-kben, amint az a kiegészítő információk ábrán látható. S4f. ezek a telkek egyértelmű pontot mutattak, ahol a H3K9me3 kihasználtsági jel gyorsan növekedni kezdett. Ezután meghatároztuk ezeknek a görbéknek az inflexiós pontjait. Az inflexiós pontok feletti H3K9me3 csúcsokat “H3K9me3 hegységekként”, az ezen pontok alatti H3K9me3 csúcsokat pedig tipikus H3K9me3 csúcsokként határoztuk meg.

ATAC-seq

az ATAC-seq-t a korábban leírtak szerint hajtották végre.99 röviden, összesen 50 000 sejtet mostunk kétszer PBS-sel, és reszuszpendáltunk 50 db (10 mM-es trisz-HCl (pH 7,4), 10 mM-es NaCl, 3 mM-es MgCl2, 0,1% (v/v) Nonidet P40 szubsztitúció) lízis pufferben. A felfüggesztés a magok volt, akkor centrifugált 500 × g, 10 perc, 4 °C-on, majd a kiegészítéssel, 50 µL átültetés reakció mix (10 µL 5 × TTBL puffer, 4 µL TTE mix 36 µL nuclease-ingyenes H2O) a TruePrep DNS Könyvtár Előkészítő Kit V2 az Illumina (Vazyme Biotech). A mintákat ezután inkubáltuk 37 kb 30 min. A könyvtárakat ezután felerősítettük és megtisztítottuk a Trueprep DNS Library Prep Kit V2 for Illumina (Vazyme Biotech) segítségével. A könyvtár minőségét egy fragmentumanalizátor segítségével értékeltük. Végül a könyvtárakat Illumina HiSeq X-Ten platformon szekvenálták, párosított végű szekvenálással, 150 bp olvasási hosszúsággal.

ATAC-seq adatfeldolgozás

az ATAC-seq adatok feldolgozásához a nyers olvasásokat Trim Galore szoftverrel (0.4.5 verzió) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) vágták le. A levágott olvasmányokat az UCSC humán hg19 genomjára térképeztük fel Bowtie 2 (2.2 verzió.9) A “-X 2000-N 1-L 25 –nem kevert-nem –diszkordáns-t”paraméterrel.96 ismétlődő olvasást távolítottunk el a Jelölésselduplicates.jar program Picard eszközök. Ezután az olvasásokat a SAMtools (1.6-os verzió) szoftverrel rendezték. Ezután az egyes minták három ismétléséből származó feldolgozott olvasatokat egyesítettük. Az ATAC jelek megjelenítéséhez minden olvasást 250 bp-vel meghosszabbítottunk, és minden 10 bp-os bin rpkm értékével normalizáltuk az olvasási számot. Az ATAC csúcshíváshoz a MACS2–t (2.1.1.20160309 verzió) a “–nomodel –shift 0 –extsize 250-call-summits”paraméterrel használtuk.100 csak az ATAC csúcsokat hívta meg, amelyek q értéke < 0,01 volt megtartva. ATAC csúcsok azonosított óra+ / + de nem óra – / – hmsc definiáltuk “zárt” ATAC csúcsok; ATAC csúcsok azonosított óra−/− de nem óra+/+ hmsc definiáltuk “nyitott” ATAC csúcsok. Az alkalmazott ATAC csúcsok genomiális eloszlásának becslése annotatePeaks.pl program a homer szoftverben.101

a szekvenálási adatok reprodukálhatóságának értékelése

a H3k9me3 ChIP-seq és ATAC-seq adatok reprodukálhatóságának értékeléséhez a replikációk közötti euklideszi távolságot a következőképpen számítottuk ki: az olvasásokat az RPKM 2 kb-os bin méretben számolta és normalizálta. Ezután az euklideszi távolságot R-ben (3.5.1 verzió) számítottuk ki a reprodukálhatóság értékeléséhez. Az alacsonyabb euklideszi távolságok magasabb összefüggéseket jelentenek. A DamID-seq adatok reprodukálhatóságának értékeléséhez a főkomponens-elemzést (PCA) R-ben végezték (3.5.1 verzió). Az RNS-seq adatok reprodukálhatóságának értékeléséhez szórási diagramokat rajzoltunk a regularizált logaritmus (rlog)-normalizált olvasási szám alapján DESeq2-vel, és kiszámítottuk a replikációk közötti Pearson-korrelációs együtthatót.

állatkísérletek

teratoma képződési elemzéshez NOD / SCID egerek (6-8 hetes, a Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. – tól vásárolva. Ltd) 3 db 106 órás+/+ vagy óra−/− hESCs-t injektáltunk Matrigel:mTeSR (1: 4) oldatban. A teratómákat az injekció beadása után 8-12 héttel betakarítottuk további elemzés céljából.

a hmsc transzplantációs vizsgálatokhoz 1 606 óra+/+ vagy luc− t expresszáló lentivírusokkal transzdukált óra−/ – hmsc-t injektáltunk meztelen (6-8 hetes) egerek TA izomzatába. Az egereket ezután D-luciferinnel (LUCK-1g, GoldBio) kezelték, és Ivis spektrum képalkotó rendszerrel (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA) képezték. A biolumineszcencia képeket “auto” módban szereztük be. Minden csoportnak hat biológiai replikációja volt. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

az öregedéssel összefüggő Óraszint-kimutatáshoz különböző korú egereket (fiatal, 1 hónapos, n = 5 egér; öreg, 15 hónapos, n = 10 egér) eutanizáltak, és az ízületeket összegyűjtötték RT-qPCR elemzés céljából. A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

annak értékelésére, hogy a CLOCK lentivirális beadása enyhítheti-e az öregedéssel kapcsolatos szindrómákat, a Luc-t (n = 14 egér) vagy a CLOCK-ot (n = 13 egér) expresszáló lentivírusokat 18 hónapos egerek ízületi üregébe injektálták (az SPF (Beijing) Biotechnology-tól vásárolták), és 8 hét injekció után pótolták. Futópad kísérletet végeztünk idején 15 héttel az első injekció után lentivírusok expresszáló Luc vagy óra. Részletesen az egereket egy futópadon (SA101, SANS) képeztük 5 nap alatt 3 nap alatt 20 percig, a sebesség 0-ról 20 m/percre gyorsult. A teszt napján az egerek 0 m/perc kezdeti sebességgel futottak a futópadon, majd a sebességet 2 m/perc-rel 20 m/percre növelték. A teljes futási idő 20 perc volt. Az enyhe áramütés-inger gyakoriságát rögzítették és elemezték (Luc, n = 14 egér; óra, n = 13 egér). A mikro-CT szkennelést az első injekció beadása után 16 héttel végeztük (Luc, n = 14 egér; óra, n = 13 egér). Ezután egereket eutanizáltunk, és az ízületeket összegyűjtöttük szövettani vizsgálat céljából (Luc, n = 14 egér; óra, n = 13 egér) és mRNS számszerűsítés céljából (Luc, n = 12 egér; óra, n = 12 egér). A statisztikai szignifikanciákat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel értékeltük.

szövettan és immunhisztokémia

a szövettani elemzéshez a betakarított egérízületeket 4% PFA-val rögzítették 2 napig, majd a Vízkőmentesítés után 14-21 napig paraffinba ágyazták. A szakaszokat (5 km) fast green FCF (0,02%) és safranin O (0) festették.1%) a gyártó utasításai szerint.

az immunhisztokémiai festést a korábban leírt DAB festési módszerrel végeztük, néhány módosítással.33,34,102 először a diákat depardiaffinizálták és rehidratálták xilol és különböző koncentrációjú alkohol felhasználásával. Az antigén visszakeresését tripszin (ZLI-9010, ZSGGB-BIO) emésztéssel végeztük 20 percig szobahőmérsékleten. Hidrogén-peroxidot (3%) használtunk az endogén peroxidáz aktivitás blokkolására 10 percig szobahőmérsékleten inkubálva. A diákat ezután 10% – os szamárszérummal 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk, és egy anti-P16 antitesttel (Ab54210, Abcam, 1:200) inkubáltuk 4 oc-n egy éjszakán át, majd egy másodlagos antitesttel (PV-6002, ZSGGB-BIO) 1 órán át szobahőmérsékleten a DAB festés előtt (ZLI-9017, ZSGG-BIO) inkubáltuk.

etikai nyilatkozatok

a vizsgálatban részt vevő kísérletek az állatokon végzett kutatások etikai jóváhagyására vonatkozó pályázati formátum elveit követték, és előzetesen jóváhagyták az Állattani Intézet (Kínai Tudományos Akadémia) intézményi állatgondozási és Felhasználási Bizottsága. Az egerek érzéstelenítését izofluránnal, az EUTANIZÁCIÓT CO2-vel végeztük, majd nyaki diszlokációt.

statisztikai elemzés

a statisztikai elemzéseket Graph-Pad Prism szoftverrel végeztük. Az adatokat úgy mutatjuk be, mint azt jelenti, sem vagy SD. Az összehasonlításokat Kétfarkú párosítatlan hallgatói t-teszttel végeztük. A (p) < 0, 05 értéket statisztikailag szignifikánsnak határozták meg.