A III-as típusú kollagén döntő fontosságú a kollagén I fibrillogenezis és a normális kardiovaszkuláris fejlődés szempontjából

eredmények és megbeszélések

az ES (J-1) sejteket (22) egy col3a1 gén genomiális DNS-fragmenst tartalmazó célzóvektorral transzfektáltuk, amelyben a gén promoter régióját és a szignálpeptidet kódoló első exont törölték (ábra. 1A). A célzott ES-sejt klónokat Southern blot analízissel azonosították és blastocysta injekcióhoz használták (ábra. 1b felső). A mutáns egereket két egymástól függetlenül célzott ES sejtklónból származtatták, és Southern blot analízissel azonosították (ábra. 1b alsó). A farok és a bőr kollagénjének fehérje analízise azt mutatta, hogy a heterozigóta mutáns egerekben körülbelül 50% – kal csökkent a III-as típusú kollagén, míg homozigóta mutáns állatokban nem mutattak ki III-as típusú kollagént (ábra. 1C).

a mutáns állatok termékenyek voltak, de csak a heterozigóta egerek voltak fenotípusosan normálisak. A homozigóta mutáns egerek átlagos túlélési aránya 5% volt az elválasztási korban, a legtöbb haláleset a születés utáni első 48 órán belül következett be (1.táblázat). Az újszülöttkori halálozás pontos oka nem egyértelmű, mivel az elhalt kölyköket még a vizsgálat előtt kibelezték, és az élő újszülött homozigóta mutánsok könnyű mikroszkópos szövettani elemzése nem mutatott ki súlyos rendellenességet. A felnőtt homozigóta mutáns egerek normálisnak tűntek, azzal a különbséggel, hogy körülbelül 15%-kal kisebbek voltak, mint az azonos nemű vad típusú alomtársaik (az adatok nem láthatók). A homozigóta mutáns egerek átlagos élettartama azonban körülbelül 6 hónap volt, vagy a normál élettartam egyötöde. A boncolás kimutatta, hogy ezeknek az egereknek a rövidített életének fő oka az erek repedése volt (2.táblázat). A szakadás helyei szórványosak voltak, és többnyire nagy véredényekhez kapcsolódtak. Hisztokémiai elemzést végeztünk, hogy megtaláljuk azt a hibát, amely a véredény falának törékenységét okozta. Fig. A 2 A és B a normál hasi aorta keresztmetszetét mutatja. A fal az aorta áll intima és a Média (ábra. 2A, nyíl) és adventitia (ábra. 2 A és B, nyílhegyek). A közeg rugalmas szálakból áll (ábra. 2B, nagy nyilak)és simaizomsejtek (ábra. 2B, kis nyilak), és biztosítja az aorta rugalmasságát, míg az adventitia többnyire I. típusú kollagén rostokat tartalmaz, és korlátozza az aorta dilatációját. Fig. A 2C a hasi aorta boncoló aneurysma keresztmetszetét mutatja egy homozigóta mutáns egérből. A repedés áthaladt a médián (nyíl), ami vérrel töltött csatornához (csillaghoz) vezetett a média és az adventitia (nyílhegyek) között, és részben összeomlott az aorta lumenje. Az adventitia végül máshol megrepedt, és a vér kiszivárgott a peritoneális üregbe, mint a halálos aorta aneurysmában szenvedő embereknél (20). A rugalmas szálak és a simaizomsejtek általános elrendezése (ábra. 2D) hasonló volt a vezérlőkéhez (ábra. 2B). Az extracelluláris mátrix anyagának intenzitása és eloszlása, valamint a sötétebb festés az adventitia-ban, valamint a rugalmas rostok és a simaizomsejtek között a mutáns egerek intima-jában (ábra. 2D) összehasonlíthatók voltak a vad típusú vezérlőkével (ábra. 2B). Fénymikroszkóp alatt mutáns állatokban nem figyeltek meg nyilvánvaló szív -, közép-és kisartériahibákat (az adatok nem kerültek bemutatásra).

az aneurysma mellett a mutáns egerek gyakori bélnagyobbodást és alkalmi bélszakadást mutattak, ami halált okozott (2.táblázat). A homozigóta mutáns egerek kb. 60% – ánál bőrelváltozások jelentkeztek, melyek közül a legsúlyosabb egy 1 cm hosszú, nyílt seb volt a váll területén, amely teljesen behatolt a bőrbe és a bőr alatti szövetbe (ábra. 3). A sebeket nem az állatok közötti harc okozta, mivel külön ketrecbe zárt állatokban figyelték meg őket. A bőr, a belek és más belső szervek, köztük a máj és a tüdő fénymikroszkópos analízise nem mutatott semmilyen nyilvánvaló rendellenességet mutáns állatokban (az adatok nem szerepelnek).

a mutáns állatok szerkezeti hibáinak meghatározásához az aorta és a szív elektronmikroszkópos analízisét végezték. Fig. 4 azt mutatja,hogy a kollagén fibrillák között található simaizomsejtek között vagy simaizomsejtek és rugalmas rostok (ábra. 4A, nyilak) hiányoztak vagy súlyosan csökkentek a mutáns aorta közegében (ábra. 4B, nyilak). Legszembetűnőbb, hogy az adventitiában, ahol a kollagén többsége I. típusú, a mutáns aorta kollagén rostjainak átmérője nagyon változó volt(vö. 4 D-C). Amikor a fibrillákat megszámoltuk, és ezeknek a rostoknak az átmérőjét az adventitia adott területén mértük, azt találtuk, hogy a mutánsokban a fibrillák száma a vad típusú fibrillák körülbelül egyharmadára csökkent, míg a mutánsokban a fibrillák átlagos átmérője körülbelül kétszerese volt a vad típusú egereknek (ábra. 5). Az aortához hasonlóan az epicardium és a myocardium közötti kollagén fibrillák csökkentek vagy hiányoztak, és az epicardium mikrovillái fejletlenek voltak a mutáns egerek szívében (az adatok nem szerepelnek).

a kardiovaszkuláris rendszer mellett a mutáns egerek bőrét, bélét, máját, tüdejét elektronmikroszkóppal vizsgálták. Mint az adventitia az aorta, a kollagén I fibrillák mutáns bőr (ábra. 4F, nyilak és nyílhegyek) szervezetlenek voltak, és átmérőjük nagyon változó volt a vad típusú egerekéhez képest (ábra. 4E, nyilak). Ezt a változást mutáns egerek májában és tüdejében is megfigyelték (az adatok nem szerepelnek). Ezenkívül a mutáns belek submucosájában és serosájában hiányzott vagy erősen csökkent a kollagén fibrillák (az adatok nem jelennek meg), ami arra utal, hogy ezeken a területeken a kollagén fibrillák többnyire III-as típusú kollagén fibrillák.

korábbi tanulmányok, amelyek célzott mutációkat vezettek be a Col1a1, Col2a1, Col5a2 és Col9a1 génekbe, fontos betekintést nyújtottak ezeknek a kollagéneknek a működésébe (24-27). Itt megmutatjuk, hogy a III típusú kollagén kritikus szerepet játszik a fibrillogenezisben, amely fontos része az olyan szervek fejlődésének, mint a szív-érrendszer, a belek és a bőr. A III-as típusú kollagén hiánya zavarta a fibrillogenezist, és ezeknek a szerveknek a hibás fejlődését és funkcionális elégtelenségét eredményezte. Fiziológiai körülmények között a III. típusú kollagén nemcsak a szövetekben lévő fibrillák, például az aorta közegének lényeges alkotóeleme, hanem az I. típusú kollagén fibrillogenezisének fontos szabályozó eleme is. Eredményeink azt sugallják, hogy a III típusú kollagén szabályozza az I. típusú kollagén fibrillák átmérőjét, amely mechanizmusként szolgál a különböző szövetek vagy a különböző fejlődési stádiumú szövetek fiziológiai igényeinek kielégítésére. Típusú kollagénhiányos egerek fenotípusa nagyon hasonlít az Ehlers–Danlos szindróma IV típusú betegek klinikai megnyilvánulásaira, akiknél a halál erek vagy bélrepedés következtében alakul ki (20). Ezeknek a mutáns egereknek ezért jó állatmodelleknek kell lenniük a betegség megértéséhez és esetleg a terápiás megközelítések teszteléséhez.