a klotianidin magkezelésnek nincs kimutatható negatív hatása a mézelő méhkolóniákra és kórokozóikra

tanulmányterv

Dél-Svédországban 2013-ban összesen 16 szántóföldet (8,9 ~ 5,4 ha; átlag ~ sz.d.) szántak tavasszal elvetett olajrepcére (Brassica napus L.) földrajzi közelség (de >4 km) és földhasználat (ábra. 1, lásd fent). A környező tájat megvizsgálták a virágzó növények hiánya miatt. 2013-ban azonban két mező maradt a vizsgálatban, annak ellenére, hogy a közelben egy másik olajrepce-mező is jelen volt, hogy a lehető legtöbb gazdaságpár megmaradjon34. Mindegyik farmpárban az egyik mezőt véletlenszerűen jelölték ki klotianidinnel kezelt olajos repce magokkal, míg a másik mezőt klotianidinnel nem kezelt magokkal vetették be (kezelt: 8; kontroll: 8). Ugyanezeket a párosított gazdaságokat használták 2014-ben, de a kezelések megfordultak, azaz a kezelt mezőkkel rendelkező helyeken 2013-ban volt kontroll mező 2014-ben és fordítva (kezelt: 6; kontroll: 4). A vetésforgó miatt 2013-ban és 2014-ben az egyes gazdaságokon belül különböző területeket használtak (ábra. 1, lásd fent). Annak érdekében, hogy hozzon létre ábra. 1, letöltöttünk egy térképet a Világhatárok adatbázisából (letölthető itt: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

a különböző gazdaságok 2014-es Környezeti változóival kapcsolatos információkat a 7.kiegészítő táblázat tartalmazza. 2014-ben a fókuszmezők felében további tavasszal vetett olajrepce (1-13 ha) volt 2 km-es sugarú körben. A fókuszmezők klotianidinnel kezelt magjait eladóval vonták be, két hatóanyag védjeggyel ellátott keveréke: a klotianidin (400 g l-1) és a CA-ciflutrin (+80 g l−1) azért került kiválasztásra a vizsgálathoz, mert Svédországban és Európa más részein63 ez volt az olajos repcében a legelterjedtebb rovarirtó szer. A növény felveszi a klotianidint, és szisztémásan eloszlik minden részében a rovarok elleni védelem érdekében64. a 6-ciflutrin nem tekinthető szisztémás hatásúnak, és az ebben a vizsgálatban gyűjtött mintákban nem mutattak ki maradékanyagokat34. Mind a klotianidinnel kezelt, mind a kontroll magokat 2013-ban Tiram gombaölő szerrel vonták be.

a részt vevő gazdálkodókat arra utasították, hogy a vizsgálat során ne használjanak más neonikotinoidokat a mezőkön, bár más rovarirtó lombos spray-ket; elsősorban Plenumot (pimetrozint), Avaunt/Stewardot (indoxakarb) és Mavrikot (tau-fluvalinát; méhészetben varroacidként is használják) használtak kártevők elleni védekezésre (8.kiegészítő táblázat). A Biscaya-t, a neonikotinoid tiaklopridot tartalmazó spray-készítmény kereskedelmi nevét azonban 2013−ban egy kontrollmezőre, majd 1 héttel később egy Mavrik spray-re, 2014-ben pedig egy kezelt mezőre alkalmazták, mindkét alkalommal 0,3 L ha-1-en. A tiakloprid akut toxicitása lényegesen alacsonyabb a méhekre nézve, mint a klotianidin65, és csak nyomokban mutattak ki tiaklopridot a pollen -, nektár-és méhmintákban 2013-ban, 2014-ben pedig egyet sem. Míg Rundl Enterprises et al.34 nem tapasztaltunk változást az eredményekben, amikor azokat a mezőket, ahol a Biscaya-t alkalmazták, kizárták az elemzésekből, néhány minőségi változást észleltünk (9.kiegészítő táblázat). Ezek a változások a 2014-ben kimutatott magasabb tiakloprid-szermaradékok miatt következhetnek be, de ugyanúgy nem a Biscaya-ra, hanem a Biscaya/Mavrik és az alkalmazott alternatív rovarirtó spray-kombinációk közötti különbségre vonatkozhatnak34, vagy a statisztikai teljesítmény csökkenésére vezethetők vissza.

mézelő méhcsaládok

egy hivatásos méhész 2013.május végén száztizenhat mézelő méhcsaládot készített egyetlen teljes méretű Langstroth kaptárban, amely két fésűt tartalmaz, főleg lezárt fiasítással (méhekkel), két teljes méhsejtet (méhekkel), egy kihúzott üres fésűt, öt fésűt viaszalapozással, két fésűből Megrázott méheket és vagy egy 1 éves (84 kísérleti kolónia), vagy egy 2 éves méhcsaládot (méhekkel) tartalmaz 12 kísérleti kolónia plusz 20 tartalék kolónia) ismert származású királynő, hogy viszonylag kicsi, azonos méretű méheket hozzon létre (3418 623 kifejlett méh; átlagos s.e.m.; n = 96 kolónia) olyan kolóniák, amelyeknek bőven van helyük a növekedésre, amelyek elég erősek lehetnek ahhoz, hogy túléljék a következő telet, de nyáron nem nőnek ki helyükön. Hat kísérleti telepeket helyeztünk a mező szélén mind a 16 olajrepce mezők (96 telepek összesen) között 14 és 28 június 2013 kezdetén olajrepce virágzás (kiegészítő ábra. 1). A királynő származása és kora megegyezett a farmpárok között, de a kolóniák egyébként véletlenszerűen oszlottak el. A telepeket egy 60 ha-os, szervesen kezelt téli olajrepce-mezőn tartották teljes virágzásban, mielőtt a 16 kísérleti mezőre helyezték volna (kiegészítő ábra. 1) annak biztosítása érdekében, hogy a kísérlet előtti kolónia növekedése a lehető legnagyobb mértékben peszticid-mentes takarmányozáson alapuljon.

amikor az olajrepce virágzása a kísérleti területen megszűnt, a kolóniákat július 2.és 31. között áthelyezték (kiegészítő ábra. 1)egy közös méhészethez, hogy teleljen. Augusztus 10-én a kolóniákat hangyasavgőzzel kezelték a Varroa atkák ellen, amely 20 ml 60% hangyasavból állt, amelyet egy lapos háztartási szivacsba áztattak, amelyet a keretek tetején lévő belső burkolat alá helyeztek. A telepeket kolóniánként összesen 20 kg cukorral etettük 55-60% v/v szacharóz oldat formájában, amelyet egy etetődobozban szállítottak három alkalommal 2013.augusztus–szeptember folyamán. További könnyű Varroa kezelést végeztünk December 4-én 30 ml 2,6% oxálsav 60% szacharózban történő szórásával a keretek között, közvetlenül a méhcsoportra. 2014 tavaszán a telepeket egy organikusan kezelt olajrepce mezőre költöztették, mielőtt a 10 tavasszal vetett olajrepce mezőre helyezték volna (kiegészítő ábra. 1). A kolóniákat fontolóra vették a vizsgálat 2014-es részébe való felvétel céljából, ha 2 éves, tojásrakó királynőjük volt 2014 áprilisában (kivéve azokat a kolóniákat, amelyek elpusztultak, újból királynővé váltak vagy 3 éves királynők voltak 2014 áprilisában), és 2014.június elejére nem nyüzsögtek. Ezek a korlátozások azon követelmény mellett, hogy a kolóniákat a kísérlet mindkét évében klotianidinnek kell kitenni/kitenni, azt jelentették, hogy 2014-ben csak négy kolóniát lehetett kiosztani az egyes mezőkhöz. A kezelt mezők által 2013-ban elhelyezett kolóniákat 2014-ben ismét a kezelt mezők helyezték el, hogy felmérjék a többéves klotianidin-expozíció kumulatív hatásait, de az elhelyezés előtt egyébként újra randomizálták őket a nem szándékos elfogultságok minimalizálása érdekében. Ennek ellenére 2013-tól két kontroll kolóniát egy klotianidinnel kezelt mezőnek kellett elhelyeznie 2014-ben, mivel a hat klotianidinnel kezelt mezőre nem volt elegendő minősített kitett kolónia. Elegendő kolónia állt rendelkezésre a négy vezérlőmező számára. A telepek erejét a 2013-ra leírtak szerint egyenlítettük ki, de csak az egyes kezelési csoportokon belül. A kolóniák csökkentették és kiegyenlítették a második alkalommal (8 június 2014), miután néhány közülük nőtt túl nagy, és megpróbálta Raj (kiegészítő ábra. 1). Minden redukált kolónia tartalmazott 1 teljes mézes fésűt (méhekkel), 3 fésűt főleg lezárt fiasítással (méhekkel), valamint az eredeti királynőt 2013-ból és 6 fésűt viasz alapozással. Kolóniák költöztek a tavaszi repce mezők között 16 és 25 június 2014 és hozta vissza a közös telelőhely között 14 és 22 július 2014 (kiegészítő ábra. 1).

szermaradék-elemzések

a klotianidin-expozíció megerősítéséhez a kaptár bejáratánál szántóföldenként 24 kifejlett mézelő méht, az olajrepce-mezőkön takarmányozó 5 mézelő méhből gyűjtött pollenpelletet, valamint az olajrepce-mezőkön 5 nektárt gyűjtő mézelő méh gyomrából eltávolított nektárt elemeztek klotianidin-maradványok szempontjából. A pollent (> 25 ml) pollencsapdák segítségével gyűjtötték össze, amelyeket telepenként három kolónián 1 napig telepítettek, és elemezték a növényfajok eredetét. A mintákat úgy kezeltük és elemeztük, mint a Rundl 6f et al.34 és gyűjtött során a csúcs virágzás értékelések mindkét évben (kiegészítő ábra. 1), A Svédországban használt klotianidin és négy másik neonikotinoid koncentrációját (2.Kiegészítő táblázat) folyadékkromatográfiával, tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) párosítva, valamint a pollent fénymikroszkóppal és pollen referencia könyvtárral azonosítva olajrepce típusúra (a kimutatási és mennyiségi határértékeket lásd a 2. Kiegészítő táblázatban). A méhek neonikotinoid expozíciójának variációjának további elemzéséhez a különböző helyeken, gyűjtöttünk 12 méheket helyenként a kaptár bejáratától. Ezt a mintavételt három klotianidinnel kezelt helyszínen végezték 2013-ban. A nektárt az összegyűjtött méhek mézes gyomrából nyerték ki. Ezt követően a klotianidin koncentrációját mind a nektárban, mind a méhszövetben minden egyes méhegységre vonatkozóan számszerűsítettük. A különböző mátrixok mintakezeléséről, az LC-MS/MS módszerről és a minőségellenőrzésről További részletek találhatók a kiegészítő módszerekben.

Kolóniafejlesztést, királynéválasztást és méztermelést

a Méhcsaládfejlődést ugyanaz a képzett megfigyelő és egy asszisztens értékelte. Megállapították a tojó királynő jelenlétét, valamint a királynő sejtek jelenlétét. Ha az újbóli queening eseményt a kifejlett méhek nagy vesztesége kísérte, úgy ítélték meg, hogy rajzott. Ha nem észlelték a kifejlett méhek elvesztését, akkor úgy ítélték meg, hogy a kolónia újból királyné lett. A kolóniaméztermelést és-fejlődést a kolóniák mérlegelésével és a kolóniaszilárdság Liebefeld-módszer66 alkalmazásával történő felmérésével határozták meg, a kifejlett méhek teljes száma és a fedettfiasítás területe alapján. A kifejlett méhek számát úgy becsülték meg, hogy a 10 keret mindkét oldalán megszámolták a méheket. A lezárt fiasítássejtek számát (a fiasítás mennyiségét) úgy határoztuk meg, hogy a zárt fiasítás lefedettségének arányát megszoroztuk 2700-mal, amely a felhasznált keretek egyik oldalán lévő sejtek száma. A kolóniákat az expozíció előtti és az expozíció utáni értékelések során lemértük (a METTLER Toledo asztali skála segítségével, amely akár 32 kg-ot is képes mérni 1 g pontossággal), hogy megbecsüljük a méztermelést. A teljes mézkereteket üres keretekre cserélték az olajos repce virágzása során, hogy lehetővé tegyék a kolónia növekedését és csökkentsék a rajzást. Mind a teljes, mind az üres kereteket lemérték, hogy bekerüljenek a méztermelés kiszámításába. Az expozíció utáni értékelés során a lehető legtöbb mézkeretet eltávolították (a fedett fiasítással borított terület legfeljebb 10% – át), hogy szimulálják a méhészek méztermését. Pre-expozíciós értékeléseket végeztek a szervesen kezelt téli vetésű olajrepce területen 6-17 június 2013 és 9-11 június 2014, és az expozíció utáni értékelések a közös telelő méhészet 29 július 9 augusztus 2013 és 28-31 július 2014 (kiegészítő ábra. 1). Ezenkívül 2014 áprilisában elvégezték a tavaszi kolónia erősségének felmérését a kifejlett méhek teljes számának és a felső határú fiókák számának becslésével (kiegészítő ábra. 1). A telepértékelőt és az asszisztenseket elvakították az adatgyűjtés során a mezők kezelési rendjével kapcsolatban.

kórokozó-és parazitaminták gyűjtése és feldolgozása

minden kolóniából körülbelül 100 kifejlett méhből vettek mintákat az expozíció előtti és utáni értékelések során a klotianidinnel kezelt és kontroll kísérleti olajrepce mezőkön 2013-ban és 2014-ben (kiegészítő ábra. 1). A méheket az egyes kolóniák külső fésűjéből vették, és ezért háziméhek és takarmányozó méhek keverékéből álltak67. Az összes méhmintát a laboratóriumi munka elvégzéséig -20cc-n tároltuk. A V. az egyes kolóniák destruktor fertőzöttségi arányát úgy határozták meg, hogy a kifejlett méhmintákat szappanos vízzel mosták ki, hogy eltávolítsák és megszámolják a méheket68. Kolóniánként 60 kifejlett méh hasát (az egyes kolóniák elemzéséhez) vagy méhészetenként (a 2013-as összevont kolóniák elemzéséhez 10 méh kolóniánként) eltávolítottuk, és egy belső hálóval ellátott polietilén zsákba (BioReba) helyeztük. A hasüreget egy mozsártörő segítségével őrölték a zsákban, és 30 ml nukleázmentes (Milli-Q) vizet (méhenként 0,5 ml) alaposan összekevertek a mintával, hogy homogén szuszpenziót hozzanak létre. Ebből a szuszpenzióból több 1 ml alikvotot eltávolítottunk, és -80 ft-on azonnal lefagyasztottunk DNS és RNS extrakció céljából, valamint későbbi referenciaanyagként.

paraziták, kórokozók, szimbiotikus mikrobák és immungének

az összegyűjtött méhmintákat különböző patogén és nem patogén paraziták és mikrobák szempontjából értékelték annak érdekében, hogy tanulmányozzák a kolóniák klotianidinnel kezelt területeken való elhelyezkedésének hatását azok előfordulására és bőségére. Az organizmusok közé tartozott a mindenütt jelenlévő ektoparazita Varroa destructor, 13 vírus: akut méhbénulás vírus (abpv), levéltetű halálos bénulás vírus (ALPV), Big Sioux River vírus (BSRV), Fekete Királynő sejt vírus (BQCV), krónikus méhbénulás vírus (CBPV), deformált szárnyvírus a típusú (DWV-A), deformált szárnyvírus B típusú (DWV-B), izraeli akut bénulás vírus (IAPV), Kasmír méhvírus (KBV), Sínai-tó vírustörzs 1 (LSV-1) és 2-es törzs (LSV-2), Sacbrood vírus (SBV), lassú MÉHPARALÍZIS vírus (sbpv); két közös mézelő méh mikroszporidiális Bélparazita (Nosema APIs és Nosema ceranae) és két szimbiotikus bélbaktérium (gammaproteobacterium: gilliamella apicola és BETAPROTEOBACTERIUM: Snodgrassella alvi). A 2013-as minták esetében méhészeti szinten elemeztük nyolc olyan háziméh gén (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, dorsalis-1a, evő-szerű, NimC2, PGRP-S2 és SPH51) mRNS-szintjét is, amelyek expressziója korábban összefüggésbe hozható a peszticid -, kórokozó-és/vagy parazita expozícióval19, 44 és a méhek (szociális) immunitásával45.

nukleinsav extrakció

a DNS-t a méhek homogenizátumaiból kivontuk a DNS kivonására szolgáló protokoll alkalmazásával a Nosema spores-ből69, amely kellően robusztus ahhoz, hogy baktériumokból és más mikroorganizmusokból is kivonja a DNS-t. Összesen 500 db primer méh homogenizátumot centrifugáltunk 5 percig mikrofugában 13 000 fordulat / perc sebességgel. A pelletet ismételten lefagyasztottuk-folyékony nitrogénnel felolvasztottuk, majd steril Teflon mikropestle-vel őröltük, amíg porrá nem porlasztottuk. A porított pelletet reszuszpendáltuk 400 6 ml QIAGEN növényi szövetben DNeasy AP1 lízis pufferben, amely 4 ml RNáz-A−T (10 mg ml-1) tartalmazott, majd inkubáltuk és 10 percig ráztuk 65 oC-on, majd 130 ml P3 semlegesítő puffert (3,0 m kálium-acetát pH 5.5) adunk hozzá, majd 5 percig inkubáljuk jégen, majd centrifugáljuk 5 percig 14 000 fordulat / perc sebességgel, hogy eltávolítsuk a lízis törmeléket. A DNS-t a felülúszóból 500 ml-ből a QIAGEN automatizált Qiacube extrakciós robot tisztította, a növényi DNeasy protokollt követve, és a DNS-t 100 ml nukleázmentes vízbe eluálta. Az RNS-t a Qiacube robot extrahálta közvetlenül a 100 MHz-es elsődleges házi méh homogenizátumból a Qiagen növényi RNeasy protokoll alkalmazásával (beleértve a Qia-shredder-t a további homogenizációhoz70), és az RNS-t 50 ml nukleázmentes vízbe eluálták. A hozzávetőleges nukleinsavkoncentrációt NanoDrop-pal határoztuk meg, majd a mintákat nukleázmentes vízzel egyenletes 10 ng−os (DNS és LSV-1(RNS)) vagy 20 ng−os (minden más RNS-minta esetében) 60 ng-os (60 ng) / ng-os (minden más RNS-minta esetében) / ng-os (RT-qPCR és qPCR

adatkonverzió és normalizálás

az egyes reakciók olvadási görbéit vizuálisan értékeltük annak érdekében, hogy elkülönítsük a nem specifikus amplifikációkat, amelyek olvadási hőmérsékleti profiljukban különböznek a valódi cél cDNS/DNS amplikonoktól. A nem specifikus amplifikációkat törölték az adatkészletből. Az összes vizsgálatot két példányban futtattuk, e két másolat átlagértékét a további számításokban használtuk. Mindkét másolatnak pozitív kvantitatív értéket kellett adnia, és át kellett adnia az olvadási görbe elemzését az adatkészletbe felveendő adatokhoz. Az összes megerősített amplifikáció nyers RT-qPCR adatait ezt követően átalakítottuk az egyes cél RNS becsült kópiaszámává, a vizsgálat megfelelő kalibrációs görbéjének felhasználásával. Ezeket az adatokat megszoroztuk a különböző hígítási tényezőkkel az eljárás során, hogy kiszámítsuk az egyes célpontok becsült példányait Bee-nként69. Mivel az RNS könnyen lebomlik, fennáll annak a veszélye, hogy az egyes minták közötti különbségek az RNS minőségében (azaz a lebomlás) befolyásolhatják az eredményeket70. Ennek kijavításához RT-qPCR vizsgálatokat végeztünk egy közös mézelő méh mRNS-jére belső referencia gén (RP49) minden mintán lefuttattuk. Az érdekes RNS-célpontok adatait ezután az rp49 mRNS átlagos értékére normalizáltuk, ezáltal korrigálva az adatokat az RNS-minőség MINTASPECIFIKUS különbségeire az RT-qPCR teljesítményhez viszonyítva70.

statisztikai elemzések

az olajrepce típusú növényekből származó mézelő méhek által gyűjtött pollen arányait összehasonlították a kezelések között (klotianidin magkezelés/kezeletlen) egy általánosított lineáris modell alkalmazásával, amely feltételezi a binominális eloszlást és korrigálja a túlzott diszperziót. A klotianidin koncentrációját a méhek által gyűjtött nektárban és pollenben, valamint a méhszövetben Wilcoxon–Mann–Whitney tesztekkel hasonlították össze a kezelések között. Ahhoz, hogy összehasonlítsuk a klotianidin koncentrációját a méhszövetben és a nektárt az egyes méhekben a mezők között, varianciaanalíziseket (ANOVA) használtunk, a mezőazonosság előrejelzőjeként. Továbbá a klotianidin koncentrációját a szövetben és az egyes méhek nektár-gyomortartalmát többszörös lineáris regresszióval kapcsolták össze a mező azonosságával és magyarázó változóként a klotianidin nektárban való koncentrációjával, válaszváltozóként pedig a klotianidin koncentrációja a méhszövetben.

a vizsgálat általában egy kontroll-hatás előtti (BACI) kialakítást követett, páros mezőszerkezettel, amelyet két egymást követő évben kolónia szinten megismételtek a kolónia fejlődésére, valamint a paraziták, kórokozók és bélbaktériumok előfordulására és bőségére vonatkozó adatok céljából. A 2013-as és a 2014-es éveket egy teljes modellben elemezték, rögzített tényezőként a magkezelés, a virágzás, az év és ezek kölcsönhatásai. A klotianidin-kezelés hatását a virágzás és a vetőmagkezelés közötti kölcsönhatás alapján értékelték, mivel ez a kifejezés tükrözi a kezelések közötti változás különbségét az olajos repcevirág(ok) felett. Ha a háromutas kölcsönhatás (bloom (Bloom)) (bloom (bloom), ha a változó eltérő módon reagált a klotianidin (klotianidin) kezelésre egyik évről a másikra, akkor az adatkészletet évről évre felosztották, az évet pedig fix tényezőként elvetették. Ezenkívül az adatkészletet csak 1 évre elemezték, ha az adatok egy év alatt 10 mintaméretből álltak, mind a mikrobiota prevalenciája, mind az abundancia tekintetében (1.Kiegészítő táblázat). A rajzó kolóniákat (8 a kontrollmezőkön és 10 a klotianidinnel kezelt mezőkön 2013-ban; egy a kontrollmezőkön és kettő a klotianidinnel kezelt mezőkön 2014-ben) kizárták az elemzésből, mivel a rajzás nagy hatással van a kolóniák fejlődésére. Szintén kizárt az egyetlen kolónia, amely a szállítás során elvesztette királynőjét a 2013-as terepi elhelyezés előtt (kezelt mező). Az elemzésből áradó kolóniák kizárása minőségileg megváltoztatott néhány eredményt (lásd a 13.kiegészítő táblázatot). A szignifikancia szintjének változása a csökkent statisztikai teljesítmény, a véletlenszerű esély vagy a biológiai hatások következménye lehet.

lineáris vegyes effektusú modelleket (LMM) alkalmaztak a klotianidin-kezelésnek a kolónia fejlődésére gyakorolt hatásának tesztelésére, amelyet a felső határú fiasított sejtek száma (a fiasítás mennyisége) és a kifejlett méhek száma alapján mértek. A vetőmagkezelés (klotianidin vagy kontroll), a virágzás (az olajos repce virágzása előtt vagy után), az Év (2013 vagy 2014) és kölcsönhatásuk rögzített tényezők voltak. A farmpár-identitás, a farm-identitás és a kolónia-identitás véletlenszerű tényezőként szerepelt. A méztermelést összehasonlították az LMM-et használó kezelések között, a farm pár identitásával és a farm identitásával, mint véletlenszerű tényezőkkel. Általánosított lineáris vegyes modelleket (GLMMs) alkalmaztak a klotianidin-kezelés hatásának tesztelésére a telepek újbóli queeningjére és mortalitására, véletlenszerű tényezőként a farm identitása mellett.

a klotianidin-kezelésnek a tavaszi kolónia fejlődésére gyakorolt hatását-a kifejlett méhek számaként és a fiókák mennyiségeként mérve-LMM-Mel, illetve GLMM-Mel vizsgálták, a vetőmagkezelést rögzített tényezőként, a farmpár-azonosítást pedig véletlenszerű tényezőként. A maximált brood sejtek számához negatív binomiális hibaeloszlást és logaritmikus link függvényt használtunk.

a mikrobiom és Varroa atkák adatait mind binomiális (jelenlét/hiány), mind kvantitatív (abundancia) karakterük alapján elemeztük, glmms (binomiális hibaeloszlásokkal és logit link funkcióval) és LMMs (normál hibaeloszlásokkal), illetve magkezelés, virágzás, év és kölcsönhatásaik rögzített tényezőként. A mikroorganizmusra vagy Varroa atka prevalenciájára vonatkozó GLMMs csak a kolónia identitását tartalmazta véletlenszerű tényezőként, mivel a hatékony mintaméret (azaz a jelenlét/hiány adatok ritkább kimenetele) nem tette lehetővé több véletlenszerű tényező felvételét. Csak a >10 (hatékony) mintaméretű organizmusokat és éveket elemezték mind az előfordulási, mind az abundancia adatok szempontjából. Ezenkívül azokat a kolóniákat, amelyek legalább egyszer nem mutattak pozitív eredményt egy adott mikroorganizmusra, kizárták a bőség elemzéséből. A méhek kórokozói és a baktériumok bősége logaritmikusan (log10) átalakult, mivel általában exponenciálisan oszlanak el. A célszervezetek bőségére vonatkozó LMMs véletlenszerű tényezőként tartalmazta a farmpár identitását, a farm identitását és a kolónia identitását. A Varroa atkák számát 100 méhre és a kolónia tömegére vetítve négyzetgyök alakította át, hogy elkerülje a nem normálisan elosztott maradványokat. A konfidencia intervallumokat a profil valószínűsége alapján számítottuk ki. A négyzetgyökű transzformált adatokhoz, a becsléseket visszaalakítottuk az eredeti skálára a grafikus illusztrációkhoz.

az immungén-átiratok csak 2013-ban és méhészeti szinten voltak elérhetők, de a BACI-tervet is követték. A génexpresszióval kapcsolatos LMMs a vetőmagkezelést és a virágzást rögzített tényezőként, a gazdaság identitását pedig véletlenszerű tényezőként tartalmazta.

statisztikai adatelemzéseket végeztek az R használatával, kivéve a klotianidin-expozíció és a földhasználat igazolására irányuló elemzéseket, amelyek esetében a Windows SAS 9.4 (SAS Institute Inc.) használták. Az LMM-ek alkalmasak voltak az lme4 csomag lmer funkciójának felhasználásával, a Glmm-ek pedig a glmmTMB csomag glmmTMB függvényének felhasználásával R-ben. Az LMMs-ből származó P értékeket a car csomag Anova függvényével számítottuk ki, amelynek során a kölcsönhatásokat tartalmazó modelleknél III.típusú F-teszteket, a kölcsönhatások nélküli modelleknél pedig II. típusú F-teszteket (azaz rugóértékelést és méztermelést) használtunk. A rögzített tényezők hatásait a neonikotinoid maradványok kivételével minden modellben összeg-nulla kontrasztok felhasználásával becsülték meg. Az összeg-nulla kontrasztok lehetővé teszik a fő hatások/kölcsönhatások meghatározását (azaz a többi független változótól függetlenül történő becslést), és a tényezők hatásait a nagy átlagtól való eltérésként mutatják be (elfogás). A kétszintű tényezők esetében az egyes szintek eltérésének nagysága a nagy átlagtól megegyezik, de az irány eltér. A tényezők hatását (magkezelés, virágzás, év) a második szint (klotianidin, utána, 2014) eltéréseként ábrázoljuk a nagy átlagtól. Ez volt a helyzet az interakciók esetében is, így például a magkezelés során a gmbh virágzási kölcsönhatása jelzi, hogy a klotianidin-expozíciós kolóniák milyen mértékben különböztek az olajrepce virágzásához viszonyított változásban a két kezelés átlagos változásától.

teljesítményelemzés

teljesítményelemzéseket végeztünk a kifejlett méhek számára, valamint a fedezett fiasítássejtek és a méztermelés számára, hogy megvizsgáljuk azt a hatásméretet, amelyet potenciálisan észlelhetünk a tervezés, a replikáció és a modellválasztás alapján. A teljesítményt az effektusméretek tartományára határoztuk meg névleges konfidenciaszinten (0,05 = 1000 Monte Carlo szimuláció hatásméretenként) a simr csomag powerSim függvényével. A teljesítményt a hatásméretek tartományára számították ki, a kifejlett méhek számának változásaként kifejezve, a sapkás sejtek száma vagy a méztermelés. A hatásméretet elosztva a méhek átlagos számával, az összes kontroll kolónia átlagos fiókasejtszámával vagy méztermelésével, megkaptuk a hatásméretet ezen mátrixok százalékos változásában kifejezve (kiegészítő ábra. 3). Ez a teljesítményelemzés lehetővé tette a hatásméretünk összehasonlítását a rundl által bemutatott hatásmérettel.34. A teljes modell segítségével észlelhettük az 5% alatti felnőtt méhek számának hatásméretét, 80% – os teljesítménnyel, összehasonlítva a Rundl által bemutatott 20% alatti hatásmérettel.34. Ez még alacsonyabb, mint az EFSA32 által meghatározott 636>7% – os hatásméretre vonatkozó követelmények. A vetőmagkezelés, a virágzás és az év közötti jelentős kölcsönhatás eredményeként a maximált fiasejtszámra vonatkozó adatkészletet minden évben külön-külön elemezték. Ezért itt bemutatjuk az egyes évek teljesítményelemzését. Az a hatásméret, amelyen az 80% – ot elérték, az 10% alatti 2013% – ról kissé az 11% alá az 2014-ban (kiegészítő ábra. 3), valószínűleg a 2014-es csökkent replikáció miatt. A méztermelés teljesítményelemzését is elvégeztük (a méz mennyisége kolóniánként kg-ban) mindkét év adatkészletének felhasználásával, megmutatva, hogy 20% alatti hatásméret kimutatható 80% – os teljesítménnyel (kiegészítő ábra. 3).

jelentés összefoglaló

a kísérleti tervezéssel kapcsolatos további információk a Nature Research Reporting Summary című cikkben találhatók.