a Kolisztinrezisztencia prevalenciája és néhány lehetséges mechanizmusa a multirezisztens és nagymértékben gyógyszerrezisztens Pseudomonas aeruginosa között

Bevezetés

a Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) egy opportunista kórokozó, amely gyakran megtalálható olyan környezetben, mint a talaj, a víz, a növények és a kórházi környezet, számos antimikrobiális szerrel szemben ismert belső rezisztenciával és számos antimikrobiális szerrel szembeni ellenálló képességgel életveszélyes fertőzéseket okozhat. Az intenzív osztályokon (ICU-k) a szepszis második leggyakoribb okának tekintik, és lélegeztetőgéppel összefüggő tüdőgyulladást, sebfertőzéseket és húgyúti fertőzéseket (UTI) okozhat. Számos tanulmány számolt be a P. aeruginosa-val összefüggő fertőzések mortalitásának és morbiditásának növekedéséről, különösen azoknál, amelyek több gyógyszerrel szembeni rezisztenciát mutatnak.1-3

multirezisztens (MDR) vagy nagymértékben gyógyszerrezisztens (XDR) vagy pandrugrezisztens (PDR) p megjelenése. az aeruginosa jelentős közegészségügyi problémává válik, amely késleltetett antimikrobiális terápiához vagy annak kudarcához, valamint a halálozási arány növekedéséhez vezethet, különösen a karbapenem-rezisztens P. aeruginosa megjelenésével. Tehát figyelemre van szükség, mert ezek a rezisztens törzsek rezisztenciát mutathatnak az összes rendelkezésre álló antimikrobiális szerrel szemben, vagy csak a mérgezőkre, például a kolisztinra vagy a polimixinekre mutattak fogékonyságot, nem hagyva választási lehetőséget az egészségügyi csoport számára az MDR P. Aeruginosa-val kapcsolatos súlyos fertőzések kezelésében.4

a közelmúltban a polimixinekkel szembeni rezisztencia kialakulását figyelték meg bizonyos Enterobacteriaceae fajok, például a K. pneumoniae, az E. coli, az Enterobacter aerogenes és az Enterobacter cloacae között, mivel széles körben használják a fertőzések elleni védekezésben az állatgyógyászatban. A kolisztin-rezisztencia jelentős kihívássá vált az életveszélyes fertőzések kezelésében, különösen az mcr-1 gének együttélésével más többszörös gyógyszerrezisztencia génekkel, mint ESBL, MBL, NDM gének a pán-gyógyszer rezisztencia kialakulásának lehetőségével.5,6

a polimixin E néven ismert Kolisztin a polimixinek néven ismert kationos polipeptid család egyik tagja. Ezt az antibiotikum családot lipofil zsíros Acil oldallánc jelenléte jellemzi. Manapság a kolisztint újra bevezették az orvosi terápiába, és az MDR és XDR foltok által okozott súlyos fertőzések kezelésének utolsó lehetőségének tekintik. Általánosságban elmondható, hogy a polimixinek baktériumokra gyakorolt hatása elsősorban a pozitív töltésű antibiotikum és a lipid a negatív töltésű foszfátcsoport közötti elektrosztatikus kölcsönhatástól függ, amely a külső membránon lokalizálódik a kötődés után, diffundál a külső membránon, a periplazmikus térben és kölcsönhatásba lép a belső membránnal. A polimixinek destabilizációt okoznak a külső membránon, pórusképződést, növelik a permeabilitást, a citoplazmatikus tartalom szivárgását, majd a sejtlízist.7

a Kolisztinrezisztencia elsősorban a foszfoetanol – amin enzimatikus hozzáadásával történő kémiai módosulása miatt következik be a lipopoliszacharid lipid A-részének 4-nél a foszfátcsoportnál, csökkentve a külső membrán nettó negatív töltését, ami csökkenti a polimixin affinitást. A kolisztinnel szembeni rezisztencia származhat kromoszómálisan kódolt mutációból, amint azt a K. pneumoniae, vagy a rezisztencia horizontális átvitele kolisztin-rezisztens gént hordozó plazmid (mcr-1) segítségével.8-11

a kolisztinrezisztencia kialakulása Ázsia, Európa és Afrika egyes országaiban az egyik globális problémává vált. Mint, a kolisztinrezisztencia terjesztése azt jelzi, hogy képes vízszintesen átjutni konjugatív plazmidokkal vagy függőlegesen kromoszómális mutációval.12,13 Továbbá, mivel a colistin a súlyos fertőzések kezelésének egyik utolsó sora, így a colistin rezisztencia izolátumok megjelenése fenyegeti a világot a kezelhetetlen fertőző betegségek megjelenésével.14 a kolisztinrezisztencia kimutatása Egyiptomban, amely egy olyan országban ismert, amely a fertőző betegségek magas terhéről, valamint az antimikrobiális szerek mind az állatgyógyászatban, mind az orvostudományban való alkalmazásának alacsony vagy semmilyen korlátozásáról ismert, ami azt jelzi, hogy térségünkben kezelhetetlen betegségek jelennek meg, mivel a kolisztinrezisztencia átvihető a rendkívül rezisztens baktériumokra.15

ebben a tanulmányban a kolisztinrezisztencia prevalenciáját vizsgáljuk az MDR és az XDR P között. aeruginosa izolált szenvedő betegek különböző fertőzések az intenzív osztályon (ICU) Minia Egyetemi Kórház Egyiptomban.

anyagok és módszerek

izolátumok gyűjtése

a fertőzések különböző forrásainak százhetvenöt klinikai mintáját gyűjtötték az intenzív osztályra felvett betegektől Minia Egyetemi Kórház, Minia, Egyiptom a rutin kórházi laboratóriumi eljárások részeként. Az összes klinikai mintát triptikáz szója-agaron (Lab M, UK) tenyésztettük 37-42-24 órán át. Az egyik kolóniát macconkey agar lemezeken és cetrimid agaron szubkultúrázták. Az izolált kolóniákat a kolóniamorfológia, a laktóz fermentáció, a biokémiai reakciók (beleértve a szulfid–indol motilitást, a katalázt, a tripla cukor vasat, az ureázt és az oxidázteszteket), a cetrimid agaron való növekedési képesség és a növekedés képessége szerint 42 Kb C. 16 P. az aeruginosa kolóniákat csíkozással tisztítottuk, a tiszta kolóniákat pedig 4 KB C.

antibiotikum-érzékenységi tesztek

antibiotikum-érzékenység Kirby-Bauer Lemezdiffúziós módszerrel

az antibiotikumok különböző osztályaival szembeni antibiotikum-érzékenységet a Kirby-Bauer lemezdiffúziós módszerrel teszteltük.17 Antibiotikum lemezek voltak amoxicillin/klavulánsav (AMC) (20/10 µg), ampicillin/sulbactam (SAM) (20 µg), meropenem (MEM) (10 µg), imipenem (IPM) (10 µg), cefepime (FEB) (30 µg), cefoperazone (CEP) (75 µg), polimixin B (PB) (300 mikrogramm), ciprofloxacint (CIP) (5 µg), levofloxacin (LEV) (5 µg), gentamicin (KN) (10µg), ceftazidime (CAZ) (30 µg), eliminálódik (TGC) (15 g), amikacin (AK) (30 µg), tobramycin (CF) (10 µg), aztreonam-ra (ATM) (30 µg), piperacillin (PRL) (30 µg), carbenicillin (AUTÓ) (100 µg) (Oxoid; Basingstoke, UK). Az izolátumokat érzékenyként, intermedierként és rezisztensként osztályozták a Clinical Laboratory standards Institute (CLSI) 2018.18 gátlási zónák értelmezési standardjai szerint

a kolisztin antibiotikum MIC meghatározása

a kolisztin minimális gátló koncentrációjának meghatározásához Muller-Hinton agaron végzett hígítási módszert alkalmaztak.19 A kolisztinnel szembeni rezisztenciát akkor vették figyelembe, ha a MIC a CLSI standard irányelvei szerint ~ 4 ~ g/mL.18

az antibiotikum-érzékenység eredményei szerint az izolátumokat MDR, XDR és PDR kategóriába sorolták a korábban jelentett kritériumok szerint.20

kombinált Lemezdiffúziós teszt (CDT)

az összes kolisztin-rezisztens izolátumot (mic 6) 100 mM-es EDTA-val (Sigma-Aldrich; St. 268 Louis, MO, USA) teszteltük az mcr-1 aktivitás gátlására, mivel ez a koncentráció nem mutatott antimikrobiális aktivitást. A baktériumtörzseket tenyésztettük Muller-Hinton agar (Lab M, UK), amelyen három korongot használtunk. Az egyik korongot 10 600 mm-es EDTA-val telítettük, hogy biztosítsuk, hogy az alkalmazott EDTA koncentráció ne gátolja a baktériumok szaporodását. A másik két korong 10 fő kolisztin korong és 10 fő kolisztin plusz 10 fő 100 mM EDTA korong volt. Az izolátumok esetében a kolisztin/EDTA korong gátlási zóna átmérőjének 3 mm-es növekedését figyelték meg a kolisztin koronghoz képest.21

a zéta-potenciál változása

az mcr gének foszfoetanol-amin transzferáz enzimeket kódolnak, amelyek enzimatikusan egy foszfoetanol-amin (PEtN) részt kötnek a gram-negatív baktériumok külső membránjának a lipidjéhez, ami a kolisztinrezisztenciát biztosító nettó negatív töltésének csökkenéséhez vezet.22

a baktériumsejtek növekedését 80 6G/mL EDTA jelenlétében és hiányában hagyták. Ezután a bakteriális szuszpenziót 5000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig 5 6CC-n, majd a pelleteket kétszer mostuk, ezt követően a pelleteket 2 mL steril 1 mM-es NaCl-oldatban szuszpendáltuk, 0,5 McFarland standard oldat zavarosságához igazítva. A mintákat 1:4 arányban hígítottuk 1 mm-es NaCl alkalmazásával. A zéta-potenciált 2 mL hígított mintában határoztuk meg. Az EDTA által indukált zéta-potenciál változásait a zéta-potenciál arányból (RZP=ZP+EDTA/ZP-EDTA) számították ki, ahol a ZP+EDTA és a ZP-EDTA megfelel a 80 6G/mL EDTA jelenlétében vagy hiányában termesztett bakteriális szuszpenziók zéta-potenciáljának. Az RZP értéke (RZP) 2.5 az mcr – 1 pozitív törzsek azonosításának kritériumai.21

DNS-extrakció

a DNS-sablont a P. aeruginosa egy éjszakán át tartó tenyészetéből extraháltuk a korábban leírtak szerint.23 bakteriális pellet szuszpenzióját 10 percig forraljuk, majd centrifugáljuk. A felülúszót közvetlenül használtuk a PCR vizsgálatban.

a vizsgált gének PCR-analízise

az Exotoxin a A P. aeruginosa fontos virulencia tényezője (citotoxikus szer) klinikai fertőzések esetén. Ez a faktor gátolja a fehérjék bioszintézisét, ami nagy szövet-és szervkárosodáshoz vezet. A toxA gént, a P. aeruginosa kromoszómán található inherens genetikai szekvenciát használják a P. aeruginosa PCR-rel történő megerősítéséhez.

PCR-t 25 db összesen 1x PCR-puffert, minden egyes primerből 1 ml-t, genomiális DNS-t (kb. 150 ng), 200 ml dntps-keveréket, 2 mmol/L MgCl2-t és 0,05 U/ml Taq DNS-polimerázt tartalmazó teljes térfogatban végeztük. PCR-amplifikációt végeztünk toxA FW:CTGCGCGGGTCTATGTGCC, RV:GATGCTGGACGGGTCGAG-ra egy automatizált termikus ciklerben (Eppendorf, Hamburg, Németország) a következő feltételek mellett: 30 ciklus 1 perc 94 db C-n, 1,5 perc 63 db C-n és 1 perc 72 db C-N. 24

az mcr-1 és mcr-2 géneket hagyományos PCR-technikával vizsgáltuk a következő alapozók: mcr-1 FW (5′-AGTCCGTTTGTTGCTGTGGC-3′), RV (5′-AGATCCTTGGTCTCGGGCTTG-3′) és mcr-2 Fw (5 6 fő-ATGACATCACATCACTCTTGG-3 fő), Rv (5 fő-TTACTGGATAAATGCCGCGC-3 fő).25,26 a technikai feltételek a következők voltak: 34 ciklus 95 C-vel 1 percig, 58 C-vel az mcr-1-hez és 52 C-vel a 30-as évekhez, 72 C-vel 1 percig, majd 72 C-vel a végső meghosszabbítás 5 percig.

az Efflux szivattyúk gátlásának meghatározása Mic redukcióval Efflux pumpa Inhibitor (CCCP) alkalmazásával

az agar hígítási módszert alkalmaztuk a Mic-k meghatározására a kationhoz igazított Mueller-Hinton húsleves alkalmazásával (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). A vizsgált izolátumok esetében meghatározták a CCCP (EPI) és a kolisztin Mic-jét. A CCCP Sub-MIC-jét használtuk a kolisztin MIC-re gyakorolt hatásának meghatározásához; a CCCP koncentrációját (0,5 ~ MIC) folyamatosan a fent említett Mic-koncentrációban tartottuk, miközben az antibiotikumét sorozatosan növeltük. A kolisztin izolátumok MIC-jét CCCP hiányában és jelenlétében a CCCP szubmik-jével határoztuk meg (végső koncentráció 10 mg/L), amint azt már leírtuk.27 a CCCP hozzáadása után a kapott MIC-hajtás változását a CCCP-mentes antibiotikum MIC-szintjének a hozzáadott CCCP-antibiotikuméhoz viszonyított arányaként számítottuk ki. Amint azt az Osei Sekyere korábban leírta, az Amoako28 who arról számolt be, hogy az izolátumokban az efflux szivattyúk jelenlétének pozitív kritériuma a colistin MIC 8-szoros csökkenése volt CCCP hozzáadása után.

külső membránfehérje Minta

a vizsgált P. aeruginosa izolátumok egyetlen kolóniáját tenyésztettük 5 mL LB táptalajban 37 db C hőmérsékleten 2 napon át, 200 fordulat / perc sebességgel rázva. A sejteket 8000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig. A bakteriális pelleteket 1 mL lízis pufferben (0,05 M Tris HCL, 2% SDS, 10% glicerin) szuszpendáltuk, 95 Kb-on hevítettük 10 percig. Ezután a mintákat 10 000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 30 percig. Körülbelül 50 ml extrahált fehérjét keverünk a mintapufferrel (4 mL ionmentesített víz, 1 mL 0,5 M trisz HCL, 1,6 mL 10%-os SDS, 0,4 mL 2-merkaptoetanol, 0,2 mL 1% (m/v) Brómfenol kék) (1:1), majd 12%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid géllel (SDS-PAGE) elválasztjuk.29

lipopoliszacharid SDS-poliakrilamid Gélprofil Kolisztinérzékeny és Kolisztinrezisztens Izolátumokhoz

a vizsgált izolátumok LP-jét Westphal, Jann30 alkalmazásával forró vizes fenol módszerrel extraháltuk és tisztítottuk, majd a tisztított anyagot SDS-PAGE alkalmazásával elemeztük, majd szénhidrát-specifikus ezüstfestéssel.31

eredmények

Pseudomonas aeruginosa izoláció és antibiotikum-érzékenység

a különböző fertőzésekben szenvedő betegektől gyűjtött 175 minta közül 75 (42,8%) fenotípusosan pozitív volt a P-re. aeruginosa és pozitív toxA génre.

az antimikrobiális érzékenységi vizsgálatok azt mutatták, hogy az izolált P. aeruginosa teljes mértékben rezisztens volt az amoxicillin/klavulánsavval szemben, és nagy rezisztenciát figyeltek meg az ampicillin/szulbaktám (68%), ceftazidim (63%) és azetreonam (60%) ellen. Mérsékelt rezisztenciát figyeltek meg mind a tobramicin, mind a tigeciklin ellen (mindegyik 50%). Továbbá alacsony rezisztenciát mutattak az imipenemmel (6%) és a meropenemmel (5,3%) szemben (1.ábra). Az antibiotikum-érzékenységi eredmények szerint a rezisztens izolátumokat MDR-be (96%), XDR-be (87%) osztályozták, és egyetlen izolátumot sem soroltak PDR-be. Ezenkívül azt találták, hogy a 75 izolátum közül 16 izolátum (21,3%) mutatott rezisztenciát a kolisztin antibiotikummal szemben mic-vel (4 ~ g/mL) (8-256 ~ g/mL).

1. ábra az összes izolált P. aeruginosa izolátum antibiotikum-rezisztencia mintázata.

az Mcr-1 és Mcr-2 gének meghatározása

Mcr-1 gént fenotípusosan detektáltuk a kolisztin-rezisztens izolátumokban CDT-vel, ahol a kolisztin/EDTA és a kolisztin korongok gátlási zónáinak átmérője közötti különbségeket 3 mm-nek mértük. az eredmények azt mutatták, hogy 6 izolátum (37,5%) a kolisztin/EDTA korong átmérőjének 3-10 mm-rel történő növekedését mutatta a kolisztin / EDTA korong átmérőjéhez képest (2.ábra).

2. ábra fenotípusos kimutatás mcr pozitív izolátumok esetében kombinált lemezdiffúziós teszttel (CDT). (A): az mcr-1 pozitív törzs a kolisztinnel és EDTA-val rendelkező korongok zónaátmérőjének 3 mm-es növekedését mutatta az önmagában alkalmazott kolisztinnel összehasonlítva. (B): az mcr-1 negatív izolátum enyhe változást (1 mm) mutatott a kolisztin és az EDTA lemez gátlási zónájának átmérőjében az önmagában alkalmazott kolisztinhoz képest.

a zéta-potenciál változása

másrészt a zéta-potenciál változását az MCR gének fenotípusos kimutatásaként tartották, de az eredmények nem mutattak szignifikáns változást a zéta-potenciálban, kivéve 2 izolátumot.

rezisztencia gének kimutatása

az mcr gének genetikai kimutatása hagyományos PCR technikával kimutatta, hogy 8 (50%) izolátum pozitív volt az mcr-1-re, 6 közülük pozitív volt a CDT-re, míg 100% (16 izolátum) negatív volt az mcr-2-re.

Kolisztinrezisztens izolátumok antibiotikum-érzékenysége

a kolisztinrezisztens izolátum más antibiotikumokkal szembeni érzékenységét Kirby-Bauer lemezdiffúziós módszerrel határozták meg, az eredmények azt mutatták, hogy az izolátumok 100%-a rezisztens volt az Amoxicillin/klavulánsavval szemben, míg az Ampicillin/szulbaktám, cefepim és tobramicin rezisztencia 78,12%, 71,87% és 68,75% volt. A leghatékonyabb gyógyszerek a meropenem, az imipenem és a ciprofloxacin (ábra 3)

3. ábra a kolisztin-rezisztens izolátumok antibiotikum-rezisztencia mintázata.

.

az Efflux szivattyúk gátlásának meghatározása MIC redukcióval CCCP alkalmazásával

0,5 MIC CCCP Mic kolisztinra gyakorolt hatásának tanulmányozásával azt találták, hogy csak 3/16 izolátum (P6, P8 & P16) (18,75%) mutatta a kolisztin Mic-jének csökkenését 8-szorosára (1.táblázat) CCCP jelenlétében. A korábbi eredmények, az izolátum nem. A 16-oson efflux mechanizmus és mcr-1 gén található.

1. táblázat Kolisztin-rezisztens izolátumok, a Kolisztinnel szembeni rezisztencia néhány lehetséges mechanizmusa és más antibiotikumokkal szembeni érzékenységük

külső membrán SDS-OLDALPROFIL

a 2. táblázat és a 4.ábra azt mutatja, hogy öt sáv molekulatömege 66,7, 56,06, 47,8, 40,18 és 23.6 KDa stabil volt az érzékeny és rezisztens izolátumokban, míg egy 21 KDa molekulatömegű sávot csak a P1 (mcr-1 pozitív) és a P12 (mcr-1 negatív) kolisztin-rezisztens törzsekben találtak.

2. táblázat a Kolisztinrezisztens és Kolisztinérzékeny P. Aeruginosa extrahált külső Membránfehérjéinek molekulatömege és mennyisége % – ban

4. ábra külső membrán SDS-oldal kolisztin rezisztens és érzékeny törzsek. Sáv 1: Fehérjemarker, 2.és 3. sáv: kolisztin-rezisztens törzsek (P1 & P12), 4-6. sáv: kolisztin-érzékeny törzsek.

lipopoliszacharid (LPS) SDS-Page

lipopoliszacharid ezüstfoltos SDS-PAGE azt mutatta, hogy a kolisztin-rezisztens mcr-1 negatív izolátumok (P3, P6 és P10) nem mutattak LPS sávmintát (O-antigén ismétlődés vagy LPS mag), amely feltárta a veszteségük lehetőségét és ezen izolátumok kolisztinnel szembeni rezisztenciáját. Másrészt a kolisztin-rezisztens mcr-1 pozitív törzs O-antigén ismétlődést mutatott (5.ábra, 5. sáv), amely különbözik a kolisztin-érzékeny törzs O-antigén ismétlődési mintájától (5. ábra, 4. sáv), míg mindkettő LPS magot mutatott. Ezek az eredmények jelezhetik a módosított LPS jelenlétét az mcr – 1 pozitív törzsben.

ábra 5 LPS sávok minta. 1., 2. sáv & 3: kolisztin-rezisztens mcr-1 negatív törzsek (P3, P6 & P10), 4. sáv: Kolisztin-érzékeny törzsek és 5. sáv: Kolisztin-rezisztens mcr-1 pozitív törzs (P1). Az O-antigén ismétlések dobozosak, a nyíl pedig az LPS magra utal.

Vita

a közelmúltban multirezisztens patogén baktériumtörzsek jelennek meg, ahol a rendelkezésre álló antibiotikumok többsége nem hatékony ellenük.6,32-36 a polimixinek a multirezisztens bakteriális fertőzések kezelésének utolsó lehetőségét tekintették, ezért a kolisztin-rezisztens kialakulásának tanulmányozása kötelező volt. A polimixinek a közöttük és a gram-negatív baktériumok lipid A-Ján lévő negatív töltésű részek közötti elektrosztatikus kölcsönhatás révén mutatták ki aktivitásukat, ami a külső membrán destabilizációját, valamint a citoplazmatikus tartalom és a lízis szivárgását eredményezte.37,38

megállapítást nyert, hogy a polimixin rezisztencia leggyakoribb oka az LPS módosítása 4-amino – 4-dezoxi-l-arabinóz (Lara4N) és foszfoetanol-amin (mcr-típusú gének által kódolt) vagy galaktozamin hozzáadásával az LPS mag lipid A-jához. Ennek eredményeként a foszfátmaradványok nettó negatív töltésének csökkenése befolyásolja a polimixin membránhoz való affinitását, vagy a kétkomponensű szabályozó rendszerek (TCSs) pmrA/pmrB és phoP/phoQ hatása miatt.39

vizsgálatunkban kolisztinrezisztenciát mutattunk ki a mic-k eredményei alapján, majd fenotípusos módszerekkel mcr-1 foszfoetanol-amin transzferáz jelenlétének vizsgálatát, valamint mcr-1gén kimutatását. A fenotípusos módszerek attól függnek, hogy az mcr-1 foszfoetanol-amin cink-metalloprotein. Tehát a cink bármilyen csökkenése csökkenti a kolisztin Mic-jét az mcr-1 szempontjából pozitív izolátumokban. Mivel mcr-1 kódoló enzim, a cink-metalloprotein lehetővé teszi az EDTA használatát fém kelátképzőként a cink csökkentésére a közegben, és befolyásolja a kolisztin mikrofonokat és az mcr-1 pozitív izolátumok zéta potenciálját.40

Vizsgálatunk a P. aeruginosa magas prevalenciáját mutatta (42,8%). Az MDR P. aeruginosa az összes izolátum 96% – ának felelt meg, 87% – a pedig XDR volt. A kolisztin-rezisztens P. aeruginosa magas prevalenciája (21.3%) volt kimutatható, ami az elégtelen fertőzéscsökkentő intézkedések és a baktericid antibiotikumok helytelen használatának következménye lehet hazánk kórházainak intenzív osztályain. Ezenkívül a kolisztint széles körben használják országainkban az élelmiszer-termelő állatok növekedésösztönzésében, különösen a baromfiiparban, míg a karbapenemeket vészhelyzetben használják.15 tehát a karbapenemek megfigyelhető aktivitást mutattak a vizsgált organizmusokkal szemben a kolisztinnel összehasonlítva. Másrészt az eredményeink magasabbak voltak, mint a Liassine et al25, akik arról számoltak be, hogy a különböző baktériumfajok 300 izolátumának egy izolátumát p aeruginosa-ként azonosították, amely kolisztinnel szembeni rezisztenciát mutat, és mcr-1 gént hordoz.

kombinált lemezdiffúziós tesztet (CDT) és az EDTA által indukált zéta-potenciál megváltoztatását alkalmazták fenotípusos módszerekként 41,42 az mcr-1 gén kimutatására. Az eredmények azt mutatták, hogy egyetlen izolátum sem volt pozitív az mcr-2 szempontjából, és a kolisztin-rezisztens izolátumok 8 (50%) izolátuma mcr-1 pozitív volt, míg ezen izolátumok 2 izolátuma RZP > 2, 5 értéket mutatott. A 8 mcr-1 pozitív izolátum közül 6 izolátum pozitív volt a CDT szempontjából, míg két mcr-1 pozitív (no. P15 és P16) negatívak voltak a CDT szempontjából, ami az EDTA hatását befolyásoló kolisztinrezisztencia további mechanizmusának koprodukciója miatt következhetett be.21 mint, azt találtuk, hogy izolátum nem. A P16 (mcr-1 pozitív és CDT negatív) pozitív volt az efflux szempontjából.21,43-45 ezenkívül az mcr-1 szempontjából negatív kolisztin-rezisztens izolátumok mutációkat mutathatnak az antimikrobiális szerek hosszú távú alkalmazása miatt.

továbbá teszteltük a kolisztin-rezisztens izolátumokat az efflux mechanizmusok jelenlétére CCCP (egy efflux pumpa inhibitor) alkalmazásával, valamint a külső membránfehérje és az LPS SDS-PAGE profil különbségét az érzékeny és rezisztens izolátumok között. Eredményeink feltárták az efflux mechanizmus jelenlétét 3 izolátum között, míg egyikük mcr-1 pozitív volt. A külső membránfehérje profil egy 21 KDa molekulatömegű sávot mutatott a rezisztens P1 (mcr-1 pozitív) és P12 (kolisztin-rezisztens mcr-1 negatív) izolátumokban. Ezenkívül azt találták, hogy a kolisztin-rezisztens mcr-1 negatív törzsek nem mutattak LPS sávmintát (O-antigén ismétlődés vagy LPS mag), de az mcr-1 pozitív (P1) és a kolisztin-érzékeny izolátumok LPS magot mutattak, de eltérő O-antigén ismétlődési mintát mutattak. Machado és mtsai20 tanulmányozta az efflux pumpa szerepét a colistin rezisztenciában az Acinetobacter baumanni-ban, és megállapította, hogy az efflux aktivitás hozzájárul az a heterorezisztenciájához. baumanni mutáció nélkül. Marjani és munkatársai 43 azt mutatták, hogy az izolált P. aeruginosa 22,5%-a volt rezisztens a kolisztinnel szemben, ami közel áll az eredményeinkhez, és a kolisztin-rezisztens izolátumok több mint 50% – a volt pozitív az efflux pumpákra.

bár a baktériumok kolisztin vagy polimixinek általi elpusztításának pontos mechanizmusa nem egyértelműen ismert, ismert, hogy a pozitív töltésű peptidekhez és a negatív töltésű Lipid A-hoz való kötődésük kritikus lépés. Tehát teszteltük az LPS SDS-oldal profiljukat, és szignifikáns különbséget figyeltünk meg a vizsgált törzsek között. Egy Moffatt által végzett tanulmányban et al, 46 arról számoltak be, hogy az LPS elvesztése az A. baumanii colistin rezisztens megjelenését eredményezte, amely a lipid a bioszintézis gének (lpxA, lpxC vagy lpxD) inaktiválása miatt következik be. A külső membránfehérje-minták 21 KDa molekulatömegű sáv jelenlétét mutatták a kolisztin-rezisztens izolátumokban, amelyek megfelelhetnek az OprH-nak a Nicas és a Hancock47 jelentése szerint, akik arról számoltak be, hogy az OprH expresszió szerepet játszik a Pseudomonas polimixinekkel és EDTA-val szembeni rezisztenciájában, mivel az OprH helyettesíti a kétértékű kationokat a külső membránban, ami a polikationos antibiotikum felvételének blokkolását eredményezi. Az előző megállapítás megmagyarázhatja, hogy miért törzs nem. A P1 (mcr-1 pozitív) negatív volt a CDT szempontjából.

következtetések

ez a vizsgálat az MDR és az XDR P. aeruginosa magas prevalenciáját mutatta, amely kolisztinrezisztenciát mutatott az intenzív osztályra felvett, különböző fertőzésekben szenvedő betegek körében. Ezenkívül különböző mechanizmusok jelenlétét mutatta, amelyek kolisztin-rezisztenciát eredményezhetnek. Ez azt jelzi, hogy sürgősen meg kell változtatni az antibiotikum-kezelési stratégiákat mind az emberek, mind az állatok számára.