a pentóz-foszfátból és az aromás útvonalakból kiválasztott gének konstitutív expressziója növeli a sikiminsav-hozamot a PTS-t és pykF-t nem tartalmazó Escherichia coli törzs magas glükóz-kötegelt kultúráiban

pb12 Arok-aroL-tartalmú törzsek építése szintetikus operon konstitutív expressziójára tervezett plazmid a sikimsav előállítása során

laboratóriumunk publikálatlan bizonyítékai azt mutatják, hogy az aromás vegyületek előállítása a laboratóriumban kialakult pb12 törzsben magasabb szintet érhet el, ha a fermentáció kezdetén a szénáram csatornázásában részt vevő gének transzkripciós indukciója megtörténik. Ezt a megfigyelést figyelembe véve új stratégiát dolgoztak ki az inaktív aroK és aroL géneket hordozó PB12 SA termelésének optimalizálására (1.ábra). Ez a stratégia magában foglalta egy plazmid tervezését és felépítését a hat kulcsgén erős és stabil expressziójához szintetikus operon formájában, amelyet kizárólag egyetlen Trc promoter irányít. A metabolikus terhelés csökkentése érdekében vektorként egyetlen pbr327-ből származó plazmidot használtunk , amely a par lókuszt hordozta a megnövekedett plazmidstabilitás érdekében, miután a promoter-t, a polilinkert és a ptrc99a transzkripciós terminátorait tartalmazó fragmentumot beépítettük (2.ábra).

az operon kezdeti részét szekvenciális amplifikációval és az első 4 kódoló szekvencia (aroB, tktA, aroGfbr és aroE) ligálásával állítottuk elő a pbrint-Ts Cm plazmid polilinker-jébe, amelyet klónozó állványként használtak (lásd a módszereket). Később a 4-génkonstrukció átkerült a pTrc327par hibrid plazmidba 2 további génnel (aroD és zwf) együtt, ami egy 8Kb-os operont eredményezett egy 12Kb-os plazmidban (2.ábra). A kapott plazmid, az úgynevezett pTrcAro6, átalakult a pb12 aroK-aroL – törzzsé, amely mentes a lacIq géntől, lehetővé téve az érdekes gének konstitutív expresszióját (1.táblázat). Az egyszerűség kedvéért a generált PB12 aroK-aroL-lacI-törzset AR2-nek nevezték. Miután a pykF gént inaktiváltuk az AR2-ben, a kapott törzset AR3-nak nevezték el. Az AR2-ből és ar3-ból származó, ptrcaro6 plazmidot hordozó törzseket AR26-nak, illetve AR36-nak nevezték el (1. táblázat).

a ptrcaro6-ban a szintetikus operont alkotó kódoló szekvenciák térbeli elrendezését, amelyet a TRC promoter és a transzkripciós terminátorok szegélyeznek,a 2. ábra mutatja. az aroB az első gén az operonban, mivel számos bizonyíték arra utal, hogy alacsony expressziója az aromás vegyületek előállításának egyik korlátozó lépése . A ptrcaro6 plazmid a tktA és az aroGfbr géneket is hordozza, amelyek termékei részt vesznek az E4P szintézisében és a PEP-vel való kondenzációjában, így DAHP-t, az első aromás vegyületet alkotják (1.ábra). aroD és aroE géneket is bevontak, hogy elősegítsék a DHQ SA-vá történő hatékony átalakulását. Ezenkívül ez a plazmid hordozza a ZWF gént, kódolva a PPP első enzimét (1.ábra). A gén felvételére vonatkozó döntés a következő megfigyeléseken alapult: 1) A ZWF túlexpressziója lényegében visszanyerte a plazmid metabolikus terhelés miatti növekedési sebességveszteséget a jm101 törzsben, amely csak a glükózra, mint szénforrásra növekszik ; 2) beszámoltak arról, hogy a PB12 törzs különösen alacsony szén-fluxus-partíciót mutat a glükóz 6-foszfát (G6P) csomópontnál a PPP felé (az elfogyasztott G6P 5% – a, szemben a szülői jm101 törzs 22% – ával). Ezért ennek a génnek a túlzott expressziója növeli a NADPH elérhetőségét, amelyet katalitikus mennyiségben igényel a sikimát-dehidrogenáz enzim (AroE), és enyhítheti a potenciális növekedési hatásokat azáltal, hogy több G6P-t irányít a nukleotid és az aminosav bioszintézis felé a pb12-ből származó törzsekben . Az ebben a jelentésben bemutatott kísérletek azonban nem a felhasznált gének specifikus hatásának boncolására irányultak, hanem arra törekedtek, hogy jellemezzék annak következményeit, ha mindegyiket operonként fejezik ki.

minden gén hatékony transzlációjának elősegítése érdekében minden kódoló szekvenciát kijelölt primerek segítségével amplifikáltunk, amelyek konszenzusos Shine-Dalgarno szekvenciát vezettek be, amely 8 bp-t helyez el a transzláció kezdő helyétől felfelé. A felépített operon nukleotidszekvenciáját az 1. kiegészítő fájlban mutatjuk be.

a Pykf inaktiváció által okozott hatások értékelése az aro6 operont

expresszáló törzsekben a pykF inaktiválásnak az SA termelésére gyakorolt hatásainak értékeléséhez az AR26 (pykF+) és az AR36 (pykF-) termelési törzsek teljesítményét hasonlították össze 15 g/L Glc-t és 5 g/L YE-t tartalmazó rázólombikokkal. Kontrollként ugyanazok a törzsek, amelyek üres pTrc327par plazmidot (Aro6 operon nélkül), AR2e-t és AR3e-t is tartalmaztak.

annak ellenére, hogy az SA minden esetben felhalmozódott, amint az az Arok és az aroL mutánsai esetében várható volt, a pTrcAro6-ot tartalmazó törzsek magasabb SA-koncentrációkat értek el, mint az üres plazmiddal rendelkezők (3b ábra). Sőt, az SA titer majdnem kétszer magasabb volt az AR36-ban, mint az AR26-ban (6,1 g/L vs.3,3 g/L). A Glc fogyasztás csökkenését figyelték meg az AR26 törzsben körülbelül 18 órás tenyésztés után, ami korrelál a magas acetátkoncentrációval és az SA termelésének leállásával. Ezzel szemben az AR36 törzs állandó Glc fogyasztást mutatott, és elhanyagolható mennyiségű acetátot termeltek (3C, 3D ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a mesterséges operonban jelen lévő gének funkcionálisak és elősegítik az SA termelését a kultúra kezdete óta. Konstitutív expressziójuk 25% – kal csökkentette a fajlagos növekedési rátát (Ft) a pykF+ háttérben, és kismértékben növelte azt a pykF-variánsban, de nem okozott jelentős változásokat a maximálisan előállított biomasszában (Xmax) az üres plazmiddal rendelkező törzsekhez képest (3a ábra). Figyelemre méltó, hogy az operon expresszáló törzsekben ilyen növekedési körülmények között a pykF gén inaktiválása növelte az SA termelését, megszüntette az acetát felhalmozódását, és lehetővé tette a folyamatos Glc fogyasztást.

az AR26, AR36 törzsek és üres plazmidszármazékaik, az AR2e ( pykF+) és az AR3e ( pykF -) viselkedése 15 g/L Glc-t és 5 g/L YE-t (a, b, c,d), valamint 1 liter 100 g/L Glc-t és 15 g/L YE (e) – t tartalmazó rázólombikok alkalmazásával. a) növekedés; b) SA termelés; c) Glc fogyasztás; d) acetát termelés; e) GLC fogyasztás és SA termelés ar26 és AR36 fermentorokban. A hibasávok a szórást jelentik.

annak megállapításához, hogy az AR26-ban az AR36-hoz képest magasabb acetát-termelés és alacsonyabb SA-termelés az eredendően alacsony oxigén-rendelkezésre állás és a táptalaj savasodása következménye-e a lombikbetét-tenyészetekben, mindkét törzset 1 L-es tételes fermentorokban tenyésztettük ellenőrzött pH-és oldott oxigénfeszültség (Dot) mellett. Az SA titer növelésének megközelítéseként ezekben a kísérletekben a Glc kezdeti koncentrációját 100 g/L-re emelték, az YE koncentrációt pedig egyidejűleg 15 g/L-re növelték a nagyobb biomassza-termelés lehetővé tétele érdekében.

ilyen körülmények között az AR36 törzs 42 g/L SA-t termelt 60 óra alatt, elfogyasztva az összes Glc-t, és 12 g/L acetátot felhalmozva. Ezzel szemben 47 óra elteltével az AR26 törzs legfeljebb 13 g/L SA-t termelt, nem merítette ki a Glc-t, és 29 g/L acetátot halmozott fel (3e Ábra és 2.táblázat). Függetlenül a fermentorok ellenőrzött körülményeitől, ahol a pH-t 7-en tartották, és a pont mindenkor magasabb volt, mint 20%, mindkét törzs termelési profilja hasonlított a rázólombikokban megfigyelt viselkedésre, az AR26 több acetátot és kevesebb SA-t termelt. Még akkor is, ha a globális volumetrikus GLC fogyasztási ráta (Qsglobal), a mindkét törzs által elért 6xmax és a 6xmax hasonló volt, a termelékenység, a hozam és a titer több mint kétszerese volt az AR36-nak, mint az AR26-nak (3e Ábra és 2.táblázat).

figyelemre méltó, hogy ilyen nagy különbségeket figyeltek meg az acetát és az SA termelésében, mivel csak egy gént bontottak le, ami bizonyítja a PTS és a pykF kombinált inaktiválásának előnyeit, amikor konstitutív expressziós rendszert alkalmaznak egy kifejlődött E. coli törzsben. Az SA termelésben megfigyelt javulások figyelembevétele érdekében azt javasoljuk, hogy az operonban kódolt enzimek korai és állandó expressziója fenntarthatja a glikolitikus intermedierek folyamatos fogyasztását az egész tenyészetben, megakadályozva az intracelluláris koncentrációk nagy ingadozását. Feltételezzük, hogy ennek az egyensúlyi metabolikus állapotnak a kombinációja a PEP inaktiválása által okozott csökkentett fluxussal piruvát a pykF gén növelheti a PEP és más glikolitikus prekurzorok elérhetőségét az SA termeléséhez anélkül, hogy csökkentené a Glc fogyasztási arányát. Elismerjük azonban, hogy mért intracelluláris metabolitkoncentrációk hiányában ezek a Megjegyzések spekulatívak.

az AR36 fermentációs profiljai szakaszos tenyészetekben

a korábbi eredményeket figyelembe véve az AR36-ot kiválasztottuk kinetikus és sztöchiometrikus teljesítményének további jellemzésére 1 L fermentorokban. E cél elérése érdekében az SA előállítását három különböző magas szubsztrátú tenyésztési körülmények között tesztelték. A növekedést, a Glc-t és a melléktermékeket minden esetben mértük, ami lehetővé tette a termelékenység és a hozamok összehasonlítását.

először 50 g/L Glc-t és 15 g/L YE-t használtunk (4a.ábra). A növekedés az első 10 óra alatt következett be, 6,3 g/L Száraz sejttömeget generálva, 0,53 h-1-es OC-val. Ilyen körülmények között 24 g/L SA-t állítottak elő 32 óra alatt. a GLC-fogyasztás és az SA-termelés az erjedés kezdete óta történt, és a Glc-kimerülésig tartott, bár a specifikus Glc-fogyasztási ráta (qs) és a specifikus SA-termelékenység (qp) az exponenciális fázisban magasabb volt (3.táblázat). A kapott SA hozam Glc – n (YSA/Glc) 0,47 mol/mol, a globális volumetrikus SA termelékenység (Qpglobal) pedig 0 volt.74 gSA/L * h (3.táblázat). A melléktermékek SA útvonalon történő felhalmozódását tekintve a fermentáció végén a felülúszóban 2,4 g/L DAHP, 2,1 g/L DHS, 1,4 g/L QA, 0,4 g/L GA és 0,3 g/L DHQ koncentráció volt jelen (5a.ábra). Ilyen körülmények között az erjedés során gyakorlatilag nem termelődött acetát, így a maximális koncentráció 1,5 g/L volt 32 óra után (4a.ábra).

az AR36 törzs fermentációs profilja 1 liter bioreaktorokban, három különböző szubsztrátkoncentrációval. a) 50 g/L Glc és 15 g/L Ti; b) 100 g/L Glc és 15 g/L ti; c) 100 g/L Glc és 30 g/L Ti. Glc: körök; SA: négyzetek; acetát: nyitott háromszögek; biomassza koncentráció: fordított háromszögek. A hibasávok a szórást jelentik.

az SA útvonal aromás melléktermékei 1 L-ben detektálva fermentor az AR36 törzs kultúrái három különböző szubsztrátkoncentráció alkalmazásával. a) 50 g/L Glc és 15 g/L Ti; b) 100 g/L Glc és 15 g/L ti; c) 100 g/L Glc és 30 g/L Ti. Gyémántok: DAHP (3-dezoxi-D-arabinoheptulozonát 7-foszfát); négyzetek: DHQ (3-dehidrokinsav); körök: DHS (3-dehidroshikiminsav); háromszögek: QA (kininsav); fordított háromszögek: GA (galluszsav). A hibasávok a szórást jelentik.

figyelembe véve, hogy 50 g/L Glc-t teljesen elfogyasztottak, egy második tételes kísérletet indítottak 100 g/L Glc-vel és 15 g/L YE-vel. Amint az előző szakaszban az AR26-tal való összehasonlításban szerepel, az ilyen körülmények között termesztett AR36 körülbelül 42 g/L SA-t termelt 60 óra alatt (4b ábra). Ebben az esetben körülbelül 100 g/L glükóz elfogyasztása és az SA maximális koncentrációjának elérése után a törzs 12 g/L acetátot termelt. Az YSA/Glc, a Qpglobal, a Qsglobal, az Xmax és a ons, valamint a 60 g/L Glc és a 15 g/L ye értékei hasonlóak voltak (3.táblázat). Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy ugyanazon YE koncentráció használatakor a Glc mennyiségének kétszeresét fogyasztják majdnem kétszer annyi idő alatt, ami azt jelzi, hogy az átlagos glükózfogyasztási arány mindkét tenyésztési körülmény között fennmarad. 4,8 g/L dahp, 2,8 g/L DHS, 3,4 g/L QA, 0 koncentráció.7 g/L GA és 0,9 g / L DHQ volt jelen a felülúszóban 60 óra után (5b ábra). Érdekes módon a Glc-koncentráció megduplázásakor az AAA-út köztes termékei meglehetősen arányosan növekedtek az SA-val, jelezve, hogy a 100 g/L Glc-fogyasztás nyilvánvalóan nem okozott új szén-fluxus szűk keresztmetszeteket. Ennek eredményeként az összes előállított aromás vegyülethez viszonyítva képződött SA mennyisége mindkét kísérletben közel 80% volt (6.ábra).

az AR36 törzsben előállított egyes aromás vegyületek móltartalma a tételes tenyészetek összértékéhez viszonyítva, a következőkkel kezdve: a) 50 g/L Glc és 15 g/L YE; b) 100 g/L Glc és 15 g/L YE; c) 100 g/L Glc és 30 g/L YE. Az előállított aromás vegyületek számított hozama és mólaránya az egyes sávok alatt látható. Az összehasonlításokat a fermentáció végén a felülúszóban mért koncentrációkkal végeztük. YSA / Glc = a GLC-ből származó SA hozama; YTAC / Glc = a GLC összes aromás vegyületének hozama; Ymax = az aromás vegyületek maximális elméleti hozama.

az YE növelésének az SA termelékenységére gyakorolt hatását egy harmadik kísérletsorozattal vizsgálták, 100 g/L Glc és 30 g/L YE felhasználásával. Bár a biomassza kétszeresére nőtt az YE-koncentráció kétszeresének alkalmazása esetén, az SA titer, a 6 g/L és az YSA/Glc nagyon hasonló volt a tenyészetben 100 g/L Glc-vel és 15 g / L YE-vel (4B.és 4c. ábra). A másik két feltételből nyert adatokkal együtt, ezek az eredmények arra utalnak, hogy az YE mennyisége elsősorban az elérhető maximális biomasszát határozza meg. Ezenkívül a kezdeti YE-koncentráció növekedése nem változtatta meg az SA-titert, és alátámasztja azt a megfigyelést, hogy az SA-t főként glükózból állítják elő. A kezdeti YE-koncentráció és a termelt maximális biomassza közötti közvetlen kapcsolat, függetlenül az ilyen növekedési körülmények között vizsgált kezdeti Glc-koncentrációtól, arra utal, hogy az YE egy vagy több korlátozó tápanyagot biztosít. Úgy tűnik továbbá, hogy az ilyen tápanyagok nem szintetizálhatók a Glc-ből, ezért az YE-ből való kimerülésük jóval a Glc kimerülése előtt korlátozza a növekedést. Várható, hogy az AR36 auxotrófia ellensúlyozásához szükséges aromás aminosavak és vitaminok korlátozóvá válnak; azonban ebben a komplex közegben más vegyületek is szerepet játszhatnak a növekedés korlátozásában idővel.

a 30 g/L kiindulási YE-koncentráció esetében összesen 106 g/L Glc-t és 43 g/L SA-t fogyasztottak el és állítottak elő körülbelül fele annyi idő alatt, mint a 15 g/L YE-vel történő erjesztés. 30 g/L YE esetén a Qsglobal és a Qpglobal kétszeresére nőtt a 15 g/L YE fermentációval összehasonlítva, annak ellenére, hogy az SA titer változatlan maradt (3.táblázat). Mivel a biomassza is kétszeresére nőtt, a számított qp és qs hasonló volt a három kísérlet között, mind exponenciális, mind álló fázisban, megmutatva a módosított törzs metabolikus robusztusságát a vizsgált körülmények között.

ezenkívül az eredmények azt mutatták, hogy az YE koncentráció növekedése nem növelte jelentősen az SA útvonal intermedierek koncentrációját (5c ábra). E tekintetben elismerték, hogy az útvonal köztitermékeinek nagy mennyisége negatívan befolyásolhatja az SA kinyerését a fermentációs táptalajból . Ez az aggodalom bizonyos erőfeszítéseket irányított a témára, ami a tenyésztési feltételek teszteléséhez vezetett, genetikai háttér, valamint a nem metabolizálható glükóz analógok használata, mint a melléktermékek előállításának minimalizálására tett kísérletek .

ezekben a kísérletekben az SA-nak a melléktermékekhez viszonyított magas arányát detektálták anélkül, hogy a törzsre vagy a folyamatra bármilyen további módosítást alkalmaztak volna. Az egyes útközi intermedierek koncentrációját összehasonlítottuk az összes aromás intermedier összegével, és ezek százalékos arányát használtuk az SA mólarányának kiszámításához az egyes melléktermékekhez a fermentáció végén (6.ábra). Az SA aránya DHS, QA vagy DAHP esetében 10-nél nagyobbnak, GA vagy DHQ esetében pedig 40-nél nagyobbnak bizonyult az összes vizsgált szubsztrátkoncentráció esetében. Figyelemre méltó, hogy a kapott SA hozamok minden körülmények között megközelítették az elméleti maximum 50% – át, az összes aromás vegyület (Tac) hozama pedig meghaladta az elméleti maximum 60% – át, becslések szerint 0.86 molTAC/molllc (lásd a módszereket és a 6. ábrát). Ez tükrözi a glükóz hatékony átirányítását az AAA útvonal felé az AR36 törzsben, még akkor is, ha magas glükóz kötegelt tenyészeteket alkalmaznak. Az SA és a melléktermékek aránya, valamint a kapott SA és TAC hozamok meglehetősen állandóak az összes értékelt feltételnél, és tudomásunk szerint az SA termelési fermentációs folyamat legmagasabb jelentett értékei. Ezek a fejlesztések igazolhatók, figyelembe véve, hogy a módosított törzsben lévő platform lehetővé teszi a szükséges enzimek homogénebb expresszióját hatékony genetikai háttéren. Ez ellentétben más expressziós rendszerekkel, ahol a szükséges géneket külön plazmidokból, különböző promoterek alatt vagy olyan törzsekben fejezik ki, amelyek nem optimalizáltak a magas Glc-szint hatékony felhasználására. A génexpresszió dinamikájával kapcsolatos előnyök mellett az a tény, hogy az ARO6 operon indukálásához nincs szükség IPTG-re, fontos gazdasági előnyt jelent a gyártási folyamat számára, mivel az IPTG magas ára korlátozza annak használatát nagyüzemi fermentációkban.

Betekintés az AR36 törzs rt-qPCR általi glikolitikus és acetát metabolizmusába

az aro6 szintetikus operon konstitutív expressziója által kiváltott metabolikus változások mélyebb megismerése érdekében az AR36 törzsben több gén transzkriptumszintjét mértük három különböző növekedési szakaszban 50 g/l Glc-vel és 15 g/L YE-vel rendelkező tenyészetekben. A módszerekben részletezett módon a korai exponenciális fázisból (EE), a késői exponenciális fázisból (LE) és az állófázisból (ST) nyert adatokat normalizáltuk az AR3e törzsből az EE-ben mért értékekkel szemben, azonos tenyésztési körülmények között termesztve.

az eredmények azt mutatják, hogy az operon jelenléte és expressziója az AR36 törzsben növeli a glikolitikus enzimeket kódoló gének transzkripciós szintjét az EE és LE fázisokban (1.és 7a. ábra). A galP és a glk gének expressziójának növekedése különösen érdekes, mert beszámoltak arról, hogy termékeik szabályozzák a pb12 glükóz importját és foszforilációját, az AR36 szülői törzsét . Emellett jelentősen nőtt az OFJ és az eno transzkripciós szintje, de a pykA nem. Ezek a változások a Pep és a fruktóz 6-P nagyobb hozzáférhetőségét eredményezhetik (amelyek plazmid kódolású transzketolázzal közvetlenül átalakíthatók E4P-vé), növelve az aromás vegyületek hozamát. Elméletünk szerint az AR36 törzsben a glikolitikus gének megfigyelt feljavulása lehet az egyik következménye egyes glikolitikus intermedierek (glükóz-6-foszfát, fruktóz-6-foszfát és PEP) alacsony szintjének, amelyet az ezeket a metabolitokat fogyasztó operon-kódolt enzimek erős és konstitutív expressziója okoz.

az aro6 szintetikus operon expressziójából származó transzkripciós változások az AR36 törzsben. Összehasonlításképpen, az egyes gének transzkripciós szintjét az AR36 törzs növekedési görbéjének három különböző pontján határoztuk meg, 50 g/L Glc-vel és 15 g/L YE-vel (lásd 4a.ábra). Minden adatot normalizáltunk az AR3e törzsből kapott értékekkel szemben a korai exponenciális növekedési szakaszban. a) glikolitikus enzimeket kódoló gének; b) az acetát asszimilációjában és bioszintézisében részt vevő gének; c) a szintetikus Aro6 operonban lévő gének (lásd 1.és 2. ábra). Fekete sávok: korai exponenciális fázis; szürke sávok: késői exponenciális fázis; fehér sávok: állófázis. A hibasávok a szórást jelentik.

másrészt az acetát bioszintézisben részt vevő enzimeket kódoló gének (poxB, ackA és pta) transzkripciós szintjét a szintetikus operon jelenléte nem módosította, míg az acetát asszimilációban részt vevő enzimeket kódoló actP és acs erősen szabályozódott az EE és LE fázisokban (7b ábra). Az actP és acs gének upregulációját az exponenciális növekedési fázisban is kimutatták a pb12 szülői törzsben, amely képes a GLC és az acetát minimális közegben történő együttes felhasználására . Ezek az eredmények korrelálnak az acetát alacsony szintjével a vizsgált növekedési állapotban (4a ábra). Fontos, hogy ezeknek az acetát asszimilációban részt vevő géneknek a transzkripciós értékei alacsonyak voltak az ST fázisban (7b ábra). Ha ez a válasz reprezentatív a többi alkalmazott növekedési körülményre, részben megmagyarázhatja a 100 g/L Glc-vel történő fermentáció során megfigyelt acetát felhalmozódást, amely nagyobb mennyiségű Glc-t fogyaszt az állófázisban (4B.és 4c. ábra). Ezek az eredmények kiemelik az actP-t és az ACS-t, mint potenciális géncélokat, hogy mesterségesen növeljék expressziójukat a késői tenyésztési szakaszokban, kihasználva az AR36 törzs várható képességeit, hogy egyidejűleg felhasználja a szülői pb12 törzsben jelen lévő Glc-t és acetátot .

a szintetikus operonban jelen lévő gének nagyon erős expressziós szintet mutattak (még álló fázisban is), ami tükrözi a promoter konstitutív jellegét és a plazmid magas kópiaszám (7c ábra). Ezek az eredmények korrelálnak a teljes fermentáció során megfigyelt megszakítás nélküli Glc-fogyasztással és SA-termeléssel (4a ábra), ami arra utal, hogy az operonban lévő gének által kódolt enzimek a termesztési idő alatt jelen vannak. A 7c ábrán látható, hogy az aroD és a zwf transzkriptumszintje viszonylag magasabb, illetve alacsonyabb, mint az operon másik négy génje. Ezt a megfigyelést óvatosan kell figyelembe venni, mivel az operonban lévő hat gént összehasonlítják az AR3e referenciatörzs kromoszómájában található génekkel. Mivel a hat génre kapott értékek nem normalizálódnak közöttük, az ar3e törzs kromoszómális expressziójának variációi megváltoztathatják az AR36 törzzsel való relatív összehasonlítást. Mindazonáltal a transzkriptomikus adatok összhangban vannak a vizsgált körülmények között kapott SA és aromás intermedierek magas arányával, ami akkor várható, ha az operonban lévő összes gén megfelelően expresszálódik. A kinetikai és sztöchiometriai adatokkal együtt ezek az eredmények rávilágítanak a konstitutívan expresszált szintetikus operon alkalmazásának előnyeire, mint alternatív stratégiára a GLC SA hozamának növelésére egy olyan fejlett törzsben, amelyben nincs PTS és pykF.