Alpha Cetsa Tudásbázis

• cetsa-vizsgálat feltételei
• Cetsa-vizsgálat
• Alfa-CETSA-vizsgálat
• Cetsa-vizsgálat
• Cetsa-vizsgálat
• adatelemzés és-értelmezés

jogi nyilatkozat: kizárólag kutatási célokra. A cetsa (cetsa) a Pelago Bioscience AB bejegyzett védjegye. Kérjük, vegye figyelembe, hogy a készlet használatához érvényes cetsa 6 előfizetés szükséges.

maga a cetsa-módszer

K: Mi az a cetsa-ce (cetsa)?

A : A celluláris Hőeltolódási vizsgálat egy olyan módszer, amely lehetővé teszi egy vegyület Célelkötelezettségének (te) számszerűsítését élő sejtekben vagy megszakadt sejtekben. A cetsa (cetsa) vizsgálati elve a célfehérje termikus denaturációs profiljának változásán alapul, amely egy vegyület kötődését követően következik be. A cetsa (cetsa) (cetsa) vizsgálat a vizsgált vegyülettel a sejtek inkubálásával, majd a vegyülettel kezelt sejtek melegítésével, majd a maradék oldható célfehérje mérésével történik.

K: Mi a Hőeltolódás

A: Melegítéskor a fehérje olyan hőmérsékletre kerül, amelyen denaturálódik (néha olvadáspontnak is nevezik). Ez az olvadási hőmérséklet fizikai tulajdonság és állandó bármely adott feltételcsoportra (pH, nyomás, sók). A fehérjével kölcsönhatásba lépő vegyületek megváltoztatják az olvadási hőmérsékletet (hőeltolódás). Egy fehérjén belüli adott kötőhelyre a hőeltolódás nagysága különböző vegyületkoncentrációknál (dózis-válasz) mérhető, és az ilyen görbékből származó EC50 értékek felhasználhatók egy vegyületsorozat hatásossági rangsorának meghatározására, amely közvetlenül korrelál a vegyületek affinitásának rangsor-sorrendjével . Az in vitro Hőeltolódási vizsgálatnak számos változata van, de a kulcstechnikát először Semisotnov et al. (1991). Ebben a módszerben az olvadó és kibontakozó fehérje hidrofób felületeket tár fel, amelyek lehetővé teszik a SYPRO orange kötődését. Ez a festék fluoreszcenciája vízben megszűnik, így a hidrofób felületekhez való kötődés megfordítja ezt, és a fluoreszcencia csúcsát okozza, amikor a fehérje teljesen kibontakozik. Ez a fajta Hőeltolódási vizsgálat csak erősen tisztított fehérjékre alkalmazható, alacsony abundanciájú fajok esetében ez azt jelentheti, hogy túlzott expressziós rendszerre van szükség a megfelelő mennyiség előállításához.

Thermofluor-hőmérséklet-érzékeny festékrendszer (Sypro Orange alkalmazásával)

differenciális letapogató fluorimetria (DSF) – alternatív festékalapú módszerek

kvantitatív PCR rendszerek (pl. Roche Light cycler) : ezeket a fűtési esemény leadására használják, és mérhetik a fluoreszcencia változásait

a Nanotemper egy olyan cég, amely dedikált műszert gyárt, amely felmelegíti a mintát és méri a fluoreszcenciát. Jobb teljesítményt nyújt, mint az adaptált PCR rendszerek.

K: Miért fontos a Célelérés mérése?

A : ha nincs megerősítés arról, hogy egy vegyület valóban kölcsönhatásba lép a kívánt célponttal, a gyógyszerfejlesztők értékes időt és erőforrásokat veszíthetnek a rossz irányba haladva. Emiatt a vegyület Célkötelezettségének megerősítését régóta elengedhetetlennek tekintik a gyógyszer felfedezésében. Az ilyen vizsgálatok lehetővé teszik a vegyület célhoz való affinitásának közvetlen összehasonlítását, mivel ilyen alapvető intézkedés annak kiválasztása, hogy mely vegyületek haladjanak előre az ólomtermelés és-optimalizálás minden szakaszában. Mivel a cél elkötelezettsége korrelálható az affinitással, lehetővé teszi a kutatók számára, hogy kiválasszák azokat a vegyületeket, amelyek a legmagasabb affinitási értékekkel rendelkeznek. Mint ilyen, rendkívül hasznos intézkedés a vegyületek helyes rangsorolásának biztosítására a gyógyszerfelfedezési folyamat minden szakaszában.

K: miben különbözik a cetsa a többi Hőeltolódási vizsgálati technológiától?

A: a cetsa-n kívül számos módszer létezik a Célhatás értékelésére (pl. felületi Plazmonrezonancia, fluoreszcencia polarizáció és Hőeltolódás). Mindezek a módszerek azonban arra támaszkodnak, hogy a tisztított fehérje rendelkezésre áll, és csak in vitro alkalmazható, vagyis a származtatott affinitási értékek nem feltétlenül jelzik előre az élő sejtek tényleges affinitását vagy kötési potenciálját. Az, hogy képesek vagyunk termikus eltolódási vizsgálatokat végezni egy releváns sejtkörnyezetben, ahol a fehérje natív környezetében van, természetes partnerfehérjék jelenlétében, kofaktorainak és szubsztrátjainak fiziológiai koncentrációival, sokkal relevánsabb adatokat eredményez, amelyek jobban lefordíthatók állati modellekbe és klinikai vizsgálatokba.

míg a celluláris Hőeltolódási vizsgálat ugyanazon a biofizikai elven alapuló módszer, mint a standard Hőeltolódási vizsgálatok (azaz hogy a specifikus fehérjék meghatározott hőmérsékleten denaturálódnak), nem közvetlenül méri a kibontakozás fajlagos hőmérsékletét, hanem arra a tényre támaszkodik, hogy egy vegyület jelenléte a fehérjén befolyásolja a beállított hőmérsékletre történő melegítés után jelen lévő oldható fehérje mennyiségét. Mint ilyen, a cetsa (cetsa) lényegében egy teljes fehérjeteszt, amelyet egy adott hevítési esemény után végeznek. Az eltérő célelkötelezettségi potenciállal rendelkező vegyületek megváltoztatják a fűtési eseményt túlélő fehérje relatív mennyiségét. Mivel a vizsgálat ezt a maradék fehérjét méri, nem pedig a tényleges olvadási eseményt, összetettebb in vivo rendszerekre, például sejtekre és lizátumokra (és egyes cetsa-formátumokban még szilárd szövetekre is) alkalmazható. Ezenkívül a cetsa! képes azonosítani azokat a vegyületeket, amelyek destabilizálják a fehérjét (azaz csökkentik annak olvadási hőmérsékletét), ez kevésbé egyenes a többi hőeltolódási módszerrel.

Q: Miben különbözik az Alpha cetsa (cetsa) a többi celluláris Hőeltolódási vizsgálati technológiától vagy más celluláris Célelkötelezettségi vizsgálatoktól?

A: Mint fentebb említettük, a cetsa (cetsa) alapvetően egy teljes fehérjeteszt, amelyet hősokk után végeznek. Az Alpha cetsa (cetsa) egy kettős antitest közelségen alapuló detektáló rendszert használ. Más módszerek elkerülik az antitest alapú rendszer alkalmazását a célfehérje módosításával:

• Promega nanoluciferáz thermal shift assay (naltsa): Nanoluk luciferáz a célfehérjéhez fuzionálva (rekombinánsan expresszált fehérje); Amikor a fehérje célpontja a Nanoluc enzim tag aggregátumokkal, a luciferáz jel csökken.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay : luciferáz fúziós címke jelölt nyomjelző vegyületekkel kombinálva, amelyek a luciferáz közvetlen közelében biolumineszcencia rezonancia Energiaátadáshoz (BRET) vezetnek. Az ugyanabban a zsebben lévő összetett kötés kiszorítja a nyomjelzőt, a BRET jel pedig csökken. Ez nem hősokk módszer.
• DiscoverX InCELL impulzus: ENZIMFRAGMENTÁCIÓS (EFC) technológián alapul : a célfehérjét egy kis enzimdonor fragmenssel fuzionálják a következők közül:! – galaktozidáz (!-Gal). Egy hozzáadott reporter fehérje kötődik ehhez a fragmentumhoz, hogy helyreállítsa az aktív enzimet, amely hidrolizálja a szubsztrátot, és kemilumineszcens jelet generál, amely lehetővé teszi a fehérje bőségének számszerűsítését. A hő denaturálása után a fehérje aggregálódik, és korlátozza a nagyobb luciferáz komponens hozzáférését a fehérje célpontján lévő partneréhez.

a legfontosabb különbség a “rekombináns cetsa (rekombináns célelkötelezettség)” és az Alfa cetsa (Alfa-cetsa) (Alfa-cetsa) rendszerek között az, hogy nem alkalmazhatók natív és nem módosított sejtekre. Ennek számos negatív következménye van:

1. míg egy új antitestpár kifejlesztésének költsége és az azt követő kútonkénti költségek magasabbak lehetnek, mint egyetlen sejtvonal egyszerű transzfektálása, valószínű, hogy bármely felfedező programot különféle modellsejtvonalakkal kell tesztelni, minden transzfekció saját költségekkel jár, és a következő sejtvonalak klónozása további heteket vesz igénybe.
2. a címkézett fehérje előállítása mindig fiziológiai következményekkel jár a sejtre, és a címkézett fehérje (I) túlexpresszálható (rossz sztöchiometria vs. (II) nem a megfelelő celluláris rekeszben helyezkedik el, vagy (iii) nem kapcsolódik a kulcsfontosságú partnerfehérjékhez, és (iv) olvadási viselkedése eltérhet a natív fehérjétől. Ez azt jelenti, hogy egy vegyület látszólagos hatása nem tükrözi a beteg szövetében való valódi viselkedését. Ezek a problémák bármely átmeneti transzfekciós rendszerben felnagyíthatók.
3. a luciferáz inhibitorok hamis pozitív találatokat eredményezhetnek.
4. az ólomoptimalizálás későbbi szakaszaiban, amikor összetettebb és fiziológiailag relevánsabb sejtmodellekre (primer, natív sejtvonalak és szövetek) van szükség, a címkézett fehérje megközelítések egyszerűen nem alkalmazhatók.

K: Milyen információkat szolgáltat a cetsa (cetsa) vizsgálat?

A: a cetsa (cetsa) egy egyedi mérést ad a vegyületeknek a cél jelenlétéről, és célfoglaltságnak tekinthető. Ezt a kihasználtságot befolyásolja mind a vegyületek képessége, hogy bekapcsolják a célt, mind a vegyület azon képessége, hogy a megfelelő helyen jelen legyen (pl. van-e megfelelő oldhatósága, permeabilitása, metabolikus stabilitása és elérhetősége a megfelelő celluláris rekeszben). A nem sejtes Célelkötelezettségi vizsgálatok olyan affinitási méréseket kínálnak, amelyek csak a fehérje viselkedésével korrelálnak erősen mesterséges környezetben, gyakran tisztított rekombinánsan expresszált célfehérjéket használva.

K: használható-e a cetsa a SAR analízishez?

A: még nincs publikált példa arra, hogy a cetsa-t a vegyületek optimalizálására használták volna. A cetsa-nak a SAR-elemzéshez és a találati megerősítéshez való felhasználhatóságát és alkalmazhatóságát azonban Shaw et al. a cetsa-ból származó adatok összehasonlítása a gyakran használt biokémiai és sejtalapú vizsgálati adatokkal (Shaw et al. 2018 SLA felfedezés 1-12 DOI: 10.1177/2472555218813332). A kiadvány bemutatja, hogy a cetsa-nak milyen hozzáadott értéke van a szűréshez, a találati megerősítéshez és a SAR-generáláshoz két fehérje célpont esetében: a B-Raf és a PARP1 esetében.

cél/Mintatípusok

K: Hány célt validáltak eddig a cetsa-ban?

A: A CETSA-ban (a legtöbb Alfa-cetsa-ban , némelyik HTRF-et használ) több mint 30 célpontot validáltak sikeresen, beleértve a nukleáris, mitokondriális, citoplazmatikus és plazmamembrán lokalizációval rendelkező célpontokat is.

eddig több mint 100 célt validáltak a Cetsa klasszikus (Western Blot alapú kimutatás).

a CETSA m/s egyszerre 6000-7000 célpontra generál információt.

k: minden célfehérjét meg lehet-e vizsgálni cetsa-ban (6c)?

R: egyes célok a cetsa-ban “vakok”, azaz. az összetett kötés nem változtatja meg hőstabilitását. Ez akkor fordulhat elő, ha a fehérje több doménnel rendelkezik, és a vegyület csak egy doménhez kötődik, és ha ennek az egyetlen doménnek a stabilizálása globálisan nem befolyásolja az egész fehérje hőstabilitását. Van néhány olyan fehérje, amely nem olvad el a tipikus hőmérsékleti tartományban, amelyet a cetsa 6 kísérletekben alkalmaznak.

A Pelagónak hozzáférése van egy nagy adatbázishoz, amely tömegspektrometriás leolvasású projektek hőstabilitási adatait tartalmazza (CETSA ~ MS), és ezt az információt figyelembe veszik, amikor a Pelago egy fehérje célpontjának “cetsa ~ bility” – jét értékeli, mielőtt egy alfa-cetsa (cetsa) ~ vizsgálat kidolgozására kerülne sor. Kérjük, vegye fel a kapcsolatot a Pelago-val, hogy ilyen információkat kérjen.

k :a Gpcr-ek alkalmazhatóak a cetsa-nak (cetsa), a cetsa-nak (cetsa)?

A: A Gpcr-ek néhány példáját cetsa-ban tesztelték. Az Astra Zeneca nemrégiben megjelent kiadványában (Kawatkar et al Chem Biology 2019) cetsa klasszikus vizsgálatokat hoztak létre membránhoz kötött fehérjék halmazára, beleértve a GPCR fehérje célt. Az egyik lehetséges kihívás a Cetsa-val a Gpcr-Eken a kimutatáshoz szükséges antitestek korlátozott elérhetősége lehet. Ezenkívül a Gprc-k integrált membrán lokalizációja kiszámíthatatlan olvadási viselkedéshez vezethet.

k: milyen típusú mintákat lehet vizsgálni a cetsa-ban (cetsa)?

A : Vannak példák a cetsa-ból származó, sokféle mátrixot használó cetsa-vizsgálatokra, beleértve az immortalizált sejtvonalakat, az elsődleges sejteket, az iPS-sejteket, a betegből származó Pbmc-ket, a szferoidokat, a tenyésztett sejtekből származó nukleáris frakciókat, az ex-vivo kezelt szöveteket, az in vivo állatkísérletekből származó szöveteket, a baktériumokat, az élesztőt, a zebrahalat és a rovarokat.

K: fagyasztható-e a minta a fűtési lépés után?

A : ez lehetséges, azonban ez eseti érvényesítést igényel, mivel a fagyasztási folyamat denaturálhat néhány fehérjét.

k: a sejtjeimnek bizonyos fehérjékkel (pl. kollagén vagy Matrigel); különös figyelmet kell fordítani a minta előkészítésének elkerülésére?

A: nem tapasztaltunk semmilyen problémát a bevont lemezeken tenyésztett sejtekkel kapcsolatban.

cetsa vizsgálati feltételek

k: melyek a tipikus Alpha cetsa vizsgálati optimalizálási pontok?

A: Ha a nulláról indul, először az immunvizsgálatot kell kifejleszteni és optimalizálni. Fontos és érdemes befektetni egy nagyon érzékeny Alfa-vizsgálat kifejlesztésébe, mivel ez lehetővé teszi a cetsa-vizsgálatban szükséges sejtszám csökkentését. Mivel a cetsa (cetsa) (cetsa) vizsgálat elpusztítja a kimutatandó fehérje egy részét, a cetsa (cetsa) (cetsa) vizsgálathoz általában több sejtre/kútra van szükség, mint a többi sejtalapú vizsgálathoz. Kérjük, olvassa el a PerkinElmer guides for alpha assay development, hogyan kell eljárni, és a hasznos tippeket, és a cetsa 6 Toolbox kézikönyvek, ha a toolbox (Anti mouse Ig X Anti rabbit Ig beads) megközelítés.

ezután a cetsa (cetsa) vizsgálati optimalizálási pontok a következők:

• sejtsűrűség titrálás
• a sejtlízis puffer kiválasztása
• a sejtek inkubációs ideje a vizsgált vegyülettel
• hőmérséklet a sejtek inkubálásához a vizsgált vegyülettel
• olvadási és eltolódási görbék létrehozása
• a hőmérséklet kiválasztása az izotermikus dózis-válasz kísérletekhez
• munkafolyamat-és automatizálási beállítások

k: miért biztosítanak különböző cetsa (cet) cella-lízis puffereket, és mi a hatása a különböző cetsa-lízis pufferek használatának?

A: A lízis puffer a vizsgálat számos aspektusa szempontjából fontos. Szerepe többszörös: a sejtek lizálása és a célfehérje potenciálisan felszabadítása a partnerfehérjéktől, amelyek zavarhatják az antitest felismerését, annak érdekében, hogy a cél elérhető legyen az antitestek általi kimutatáshoz; a célfehérje stabilizálása a vizsgálat stabilizálása érdekében; a potenciális epiturbancia hatás elkerülése vagy minimalizálása; a megfelelő fizikai-kémiai feltételek biztosítása (pH, Ionos szilárdság és a sók jellege, mosószer típusa és koncentrációja, … ) az immunvizsgálathoz, … mivel a különböző immunvizsgálatok eltérő optimális feltételekkel rendelkezhetnek,és mivel a különböző fehérje célok és a különböző sejttípusok eltérő követelményeket támaszthatnak az optimális vizsgálati teljesítményhez, 5 különböző sejtlízis puffert készítünk. Ezek különféle sejtlízis feltételeket biztosítanak. Ez azonban nem jelenti azt, hogy bizonyos esetekben további komponensek is hozzáadhatók, például további mosószer típusok, a további vizsgálati teljesítmény javítása érdekében.

k: vannak-e proteázgátlók a cetsa (cetsa) cell lysis pufferekben?

A: az 1., 4. és 5. CETSA-sejtlízis pufferek tartalmaznak néhány kétértékű kation kelátot, amelyek várhatóan gátolják az ilyen kétértékű kationokat igénylő proteázokat (például mátrix metalloproteinázok). Ezen kívül nincs más proteáz-gátlók szerepelnek a CETSA® sejt lízis puffer, mivel ezek általában nem szükséges a teljesítmény Alfa CETSA® vizsgálatok. Bizonyos sejttípusokhoz vagy szövetmintákhoz azonban érdemes tipikus proteináz inhibitorokat, például leupeptint adni.

k: melyek a tipikus olvadási hőmérsékletek?

A: az olvadási hőmérséklet (TM) az a hőmérséklet, amelyen a célfehérje populáció fele denaturálódott (azaz az Alfa cetsa-ban, ahol az Alfa-jel fele elveszett). A céltól függően az olvadási hőmérséklet leggyakrabban 40-60 C között van, az átlagos olvadási hőmérséklet 52 C. egyes fehérjék, mint például a membránhoz kapcsolódó fehérjék, általában stabilabbak és magasabb olvadási hőmérsékletük lehet. A cetsa (cetsa) 65 C feletti olvadási hőmérsékletű fehérjékre vonatkozó vizsgálati adatait befolyásolhatja az a tény, hogy a membrán permeabilitása és sejtintegritása a sejtek hevítésekor megzavarodik, ezáltal befolyásolva a vizsgálat élettani jelentőségét.

tapasztalataink szerint az olvadási hőmérséklet célspecifikus, és függ a vizsgálati mátrixtól és az alkalmazott lízis puffertől.

k: a Tm várhatóan ugyanaz lesz, ha ép sejtekkel és megszakadt sejtekkel dolgozunk?

A: nem feltétlenül, mint a sejtek megzavarásakor, a fehérjéket stabilizáló fehérje-fehérje kölcsönhatások elveszhetnek, ami az ép sejtekhez képest megváltozott olvadási hőmérséklethez vezethet. Egy példát Lásd az Alpha CETSA (CETSA) MEK1 vizsgálati adataiban.

k: milyen fűtési hőmérsékletet kell választanom az összetett teszteléshez?

A: A stabilizáló vegyületek esetében ajánlott a legalacsonyabb hőmérsékletet választani a legnagyobb vizsgálati ablak mellett, mivel várhatóan ez adja a legérzékenyebb vizsgálatot (alacsonyabb EC50 értékek). A destabilizáló vegyületek esetében ajánlott a legmagasabb hőmérsékletet kiválasztani a legnagyobb vizsgálati ablakkal. A 65cc feletti hőmérséklet hatással lehet A sejtpermeabilitásra és csökkentheti az adatok jelentőségét.

k: azonos olvadási hőmérsékletre kell számítanom a cetsa classic (Western Blot) és az Alpha cetsa (cetsa) esetén?

A: nem feltétlenül: a látszólagos olvadási hőmérséklet mindkét módszer között változhat, mivel a detektálási módszerek eltérőek.

k: fontos a minta melegítési idejének szigorú ellenőrzése?

A: Igen ez rendkívül fontos a szabályozáshoz, mivel a hosszabb melegítési idő a dózis-válasz görbe megfelelő eltolódását eredményezheti (lásd alább a tartózkodási időre vonatkozó megjegyzéseket). A szokásos fűtési idő 3 perc.

rövid tartózkodási idővel rendelkező vegyületek (azaz magas disszociációs sebesség állandó koff; tartózkodási idő T egyenlő 1 / koff) gyorsabban disszociál a céltól, amikor melegítik, összehasonlítva a hosszú tartózkodási idővel rendelkező vegyületekkel. Ezért az EC50 vagy az ITDRF50 érték várhatóan növekszik a fűtési idők növekedésével. További magyarázatok a cetsa-féle elméletről lásd: Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundb Oncklk T. (2018) az intracelluláris Gyógyszerkötés és kinetika kvantitatív értelmezése a celluláris Hőeltolódási vizsgálat segítségével. Biokémia 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. Elméletileg lehetséges lehet a különböző vegyületek tartózkodási idejének kimutatása a célponton, a fűtési idő változtatásával, de erről még nem állnak rendelkezésre közzétett jelentések.

k: a kézikönyv arra utasítja, hogy a hősokk után vagy jégen hűtsük le, vagy 3 percig 25 6CC-on. Fontos ez a hűtési lépés, és fontos a hűtési idő szigorú ellenőrzése?

A: A minta gyors lehűtése biztosítja a hősokk fázis megfelelő szabályozását. Ha egyszerűen hagyjuk, hogy a hőmérséklet segítség nélkül lehűljön, minden bizonnyal eltérő hűtési sebességet eredményez a különböző kutakban, és befolyásolja a rendszerbe juttatott hősokk mennyiségét. A hűtési fázis nem olyan kritikus, mint a fűtési fázis, de gyorsan és következetesen kell végrehajtani.

K: használhatom a PerkinElmer “Biomarker” és a “SureFire” (nem cetsa ) készleteket a cetsa (nem cetsa) vizsgálat elvégzéséhez?

A: elméletileg bármely teljes fehérjetesztelés alkalmas lehet a cetsa-ban történő alkalmazásra, bár minden rendszert optimalizálni és validálni kell. A cetsa (cetsa) módszer azonban szabadalmaztatott, és engedélyre lesz szükség a Pelago Bioscience-től. Ezenkívül csak a kijelölt célkészletek használatát támogatja a PerkinElmer. A szerszámkészlet használatát a Pelago Bioscience támogatja, és csak a licenctulajdonosok számára érhető el.

k: ki lehet olvasni az Alfa jelet közvetlenül a minták melegítésére használt PCR lemezről?

R: Ez előnyt jelentene a pipettázási lépések száma, a mintafogyasztás és az automatizálás egyszerűsége szempontjából, de a PCR lemezek használatának lehetősége a teljes folyamat során – a mintakezeléstől a kimutatásig – még nem bizonyított. A PCR lemezek gyakran nagyon rugalmasak, ami nem egyenletes jelhez vezet a lemez felett, vagy nem rendelkeznek megfelelő méretekkel ahhoz, hogy a lemezolvasók kezelhessék őket. A jól-jól keresztbeszélgetés az ilyen PCR-lemezeken is kérdés lehet.

K: kémiai denaturálás (például karbamid vagy guanidin használata) használható hő helyett?

A: A hőmérséklet használatának előnye a hősokk leadására az, hogy erősen ellenőrzött módon történik, amely valószínűleg állandó a minták között, és egy jól ellenőrzött időkereten belül korlátozott. A kémiai denaturációs folyamat működhet egy tisztított fehérje kivonatban; de a komplex sejtkörnyezetben a sejttérfogat változása, pufferelési képesség, lipidtartalom stb.valószínűleg azt jelenti, hogy a különböző sejtvonalak különböző denaturációs jellemzőket mutatnak az adott fehérje számára.

mivel a denaturáció (melegítési idő) kritikus fontosságú, ezt meglehetősen nehéz ellenőrizni, ha kémiai denaturációt alkalmazunk. Ezen kívül a hőt a sejtek megzavarása nélkül lehet alkalmazni, lehetővé téve a valós celluláris környezetben történő tesztelést. Ez nem lenne a kémiai denaturáció esete, mivel a sejteket meg kell szakítani, hogy lehetővé tegyék a cél elérését a denaturáló szerhez, ezért elveszítik az intracelluláris koncentrációkat, a fehérje asszociációkat stb.. Ezért nem javasoljuk a hősokk kémiai denaturálással történő helyettesítését.

Alfa-cetsavizsgálat

Q: A cetsa (cetsa) vizsgálat kifejlesztésekor monoklonális antitestekre van szükségem, vagy poliklonális antitesteket is használhatok?

A: mind a monoklonális, mind a poliklonális antitestek felhasználhatók, természetesen az antitestek minőségétől függően. A monoklonális antitestek előnyt jelentenek a stabil reagensellátás szempontjából, mint bármely más antitesteket alkalmazó kimutatási módszer esetében.

K: poliklonális antitestek alkalmazása esetén a következő tétel ugyanúgy működik-e a cetsa-vizsgálatban?

A: Tapasztalataink szerint, soha nem szembesültünk olyan helyzettel, amikor a poliklonális antitest következő tétele másképp viselkedett a cetsa-vizsgálatban a korábbi tételekhez képest. A cetsa-t azonban a cetsa-t újra kell validálni a poliklonális antitest következő tételével.

k: van-e más ajánlás az antitest kiválasztására?

A: ha rendelkezésre állnak, az antitesteket úgy kell kiválasztani, hogy azok a célfehérje különböző epitópjait fedjék le, annak érdekében, hogy maximalizálják annak esélyét, hogy megfelelő antitestpárt találjanak, amely működni fog az Alpha cetsa (cetsa) vizsgálatban.

a meredekebb görbéket (magasabb Domblejtést) és kevesebb hátteret eredményező Antitestpárok előnyösek, mivel általában specifikusabb jelet adnak. Az alacsony domb lejtése annak a jele lehet, hogy egy antitestpár képes felismerni az újra hajtogatott fehérjét.

k: az Alpha cetsa (alfa cetsa) csak az endogén célfehérje, vagy az endogén célfehérje plusz kötött kis molekula elleni antitestek?

A: az eddig kifejlesztett készletek alapján az antitestek csak a fehérje célpont ellen vannak.

Q: Számíthatok-e arra, hogy a kimutatási antitest affinitások különböznek a kötött és nem kötött kis molekulától a célfehérjéig?

A: az epitóp helyeken a fehérje hajtogatását befolyásoló kis molekulák valóban veszélyeztetik az antitestkötés megváltoztatását. Ezt a jelenséget “epiturbance”-nek nevezik, és az antitest alapú cetsa (cetsa) gátlása lehet . Az epiturbancia általában nem figyelhető meg a Cetsa klasszikus vizsgálati formátumban (Western blot), mivel ebben az esetben a fehérje teljesen denaturálódik az antitest kimutatási lépés előtt.

k: csak az IgG használható a cetsa ons eszköztár készletekkel?

A: Valójában az anti-nyúl és anti-egér gyöngyök antitestjei specifikusak az IgG-re, és nem ismernének fel más antitest osztályokat (azaz IgA, IgM stb.nem szabad kiválasztani).

k: van-e előnye az Alpha cetsa (Cetsa) használatának a Cetsa (Western blot) klasszikushoz képest?

A: Az Alpha cetsa (cetsa) (alfa-cetsa) vizsgálati módszer nagyobb érzékenysége, valamint az átviteli és automatizálási szempontok mellett, a membránfehérjék Cetsa (cetsa) klasszikus módszerrel történő elemzésének esetleges nehézségei miatt az Alpha (Cetsa) (cetsa) a cetsa (klasszikus) módszernél jobban teljesít, mivel nem igényel elválasztási lépést.

cetsa adatelemzés és értelmezés

K: Milyen álpozitív találatok érhetők el a cetsa-ban (cetsa)?

A: egyes fehérjék hőstabilitását befolyásolhatja az összetett kezelés, még akkor is, ha a vizsgált vegyület nem kötődik közvetlenül hozzájuk. Ezek a közvetett hatások lehetnek például fehérje-foszforiláció, fehérje-toborzás egy partnerfehérje által, vagy a sejt Redox állapotának általános változása. A cetsa (cetsa) vizsgálat párhuzamosan történő futtatása ép sejteken és károsodott sejteken megkülönböztethető a közvetlen és közvetett hatások között, mivel ilyen közvetett hatások nem várhatók a sejtek megzavarása és az anyagcsere-folyamatok leállítása esetén.

Vegyületvizsgálati intereferencia az Alfa-cetsa-ban is megfigyelhető, mivel a vegyületek viszonylag nagy koncentrációban vannak jelen a kimutatási lépésben. Ez adhat félrevezető eredményeket, és fontos, hogy végre egy számláló képernyőn azonosítani ezeket a vegyületeket.

k: hogyan értelmezhető a cél destabilizáció?

A: A destabilizáció a célfehérjét stabilizáló fehérjekomplex összetett kötődésének megzavarásából eredhet. Tapasztalataink szerint a membránfehérjék olvadási hőmérséklete általában magasabb, és inkább destabilizálódnak, mint stabilizálódnak vegyületkötéssel. A kinázok esetében ez az ATP elmozdulásából is származhat. Ebben az esetben hasznos lehet az ép sejteken (fiziológiás ATP-koncentráció) és a károsodott sejteken (ATP-veszteség) végzett cetsa-vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása. Egyes célpontok esetében (lásd az ErbB2 Alpha cetsa! kit kézikönyvet) megfigyeltük, hogy az irreverzibilis inhibitorok destabilizálják a célt, míg egy reverzibilis inhibitor stabilizálja a célt.

k: van-e mód az epiturbance hatás elkerülésére?

V: kis mennyiségű mosószer, például 0,01% SDS hozzáadása megakadályozhatja az epiturbance jelenséget. Magyarázat lehet, hogy az SDS hozzáférést biztosít az antitesthez még a vegyület jelenlétében is. Néhány cetsa-sejtlízis puffer kis mennyiségű SDS-t tartalmaz, ezért elkerülheti a más lízis pufferekkel szembeni epiturbációt. Nem zárhatjuk ki, hogy bizonyos esetekben további biztonsági adatlapokat kell hozzáadni.

meg kell jegyezni, hogy az ilyen epiturbancia hatás nem korlátozódik a cetsa (cetsa) vizsgálatokra, hanem bármely immunpróba során is előfordulhat.

K: Counter-screen / Hogyan ellenőrizhető, hogy a cetsa 6 találatom hamis pozitív-e?

A: a cetsa-ban van egy egyszerű módszer, amely lehetővé teszi annak meghatározását, hogy a vegyület magára a célfehérje (de)stabilizálására hat-e, vagy zavarja-e a kimutatási módszert: összehasonlíthatjuk (1) a vegyületeknek a sejtekhez történő hozzáadását, majd a hőkezelés inkubálását és elvégzését, valamint (2) először a sejteket melegítjük, majd a vegyületet csak utána adjuk hozzá. Ha az összetett aktivitás csak az 1. tesztben található meg, akkor valóban aktív a célnál. Ha az 1-ben és a 2-ben összetett aktivitást találunk, akkor ez azt mutatja, hogy valamilyen módon zavarja a detektálási technológiát (lásd a PerkinElmer Protein-Protein interaction guide-ot a potenciális alfa interferenciák listájához).

K: Milyen álnegatív találatok érhetők el a cetsa-ban (cetsa)?

A: Ha egy vegyület sejtes környezetben nem éri el a célt, akkor a biokémiai vizsgálatokban pozitívnak, a cetsa-ban pedig negatívnak tűnhet . Ez nem hamis negatív, hanem csak azt tükrözi, hogy a vegyület nem képes elérni a célt valós celluláris körülmények között, ami része a módszer erősségének.

K : Hogyan viszonyulnak a cetsa (cetsa) értékei a funkcionális vizsgálatokhoz / van-e értelme a hőeltolódás amplitúdójának?

A: A cetsa-adatok elemzésekor szem előtt kell tartani, hogy a vizsgálat elve meglehetősen eltér a tipikus funkcionális vizsgálatoktól, például a fehérje foszforilációjának, az ionkoncentrációknak, a cAMP-nek és más jelátviteli markereknek, vagy a fenotípusos elemzésnek a magas tartalmú szűrésnél, ezért az adatokat ennek megfelelően kell értelmezni.

a hőeltolódás amplitúdója nem az összetett affinitás mértéke.

az EC50 vagy ITDRF50 értékek bizonyos vizsgálati körülményekre (hőmérséklet, melegítési idő,…) vonatkoznak. Ez nem különbözik a funkcionális vizsgálatoktól, ahol az EC50 értékek például specifikusak a stimulációs időkre.

K : lehetséges-e az antagonisták és az agonisták megkülönböztetése a cetsa (cetsa) vizsgálatokban?

A: általában ez nem egy olyan információ, amelyet a cetsa (cetsa) vizsgálataiból nyernek ki, hanem a kiadvány Shaw et al. (2018) Tudományos jelentések | (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. a jelentések, hogy csak agonisták sikerült stabilizálni az androgén receptor, a CETSA® assay fejlett, míg antagonista nem volt közvetlen hatása a CETSA® vizsgálat, de lehet kimutatni, mint a versenytársak, a hatás az agonisták a CETSA® vizsgálat. Ezért ebben a konkrét esetben a cetsa (cetsa) vizsgálat képes volt különbséget tenni az androgénreceptor agonisták és az antagonisták között. Ez nem jelenti azt, hogy ez lehetséges, bármely cél, mivel számos olyan példa, ahol a CETSA® assay közvetlenül észleli, mind agonisták, valamint antagonisták.

Q: Használható-e a cetsa (cetsa) a vegyület toxicitásának kimutatására?

A: A sejtre toxikus hatást gyakorló vegyületek várhatóan bizonyos fehérjék szintjének megváltozásához vezetnek (degradációs és/vagy transzkripciós hatások révén), valamint egyes fehérjék termosztabilitásának megváltozásához (poszttranszlációs módosítások vagy a sejtek Redox állapotának általános változása révén). Pelago vizsgálja annak a lehetőségét, hogy létrehoz “CETSA® ujjlenyomatok”, ami kapcsolatba hozható a különböző típusú toxicitás, a CETSA® MS adatokat. Ez olyan célok ismeretét is generálhatja, amelyeket a kábítószereknek nem szabad elérniük az ilyen toxicitás elkerülése érdekében. Ha úgy tűnik, hogy egy konkrét cél a toxicitással függ össze, akkor az Alpha cetsa (alfa cetsa) használata a gyógyszeripar számára választott módszerré válhat.

K: használható-e háztartási fehérje a cetsa (cetsa) vizsgálat normalizálására?

A: a normalizálás általában nem szükséges a cetsa-vizsgálatokban, mivel a vizsgálat fontos kimenete az EC50 érték. Bizonyos esetekben azonban, például amikor szövetmintákkal dolgozunk, az adatpontonként felhasznált anyag mennyisége igen jelentős mértékben változhat, és ekkor a normalizálás kívánatos lehet. A Cetsa-ban (Western blot) a SOD1-et gyakran használják, mivel olvadáspontja 80 cc, ami jó állandó referenciává teszi bármely célpont számára, és mivel 18 kDa molekulatömege megkönnyíti a kimutatást Western blotokon. A GAPDH alacsonyabb olvadási hőmérséklete miatt nem ajánlott (55 Kb C), így nem lehet szabályozni a magasabb olvadási hőmérsékletű célpontokat.

ha normalizálni akarja az Alpha cetsa (cofire) vizsgálatot, akkor a cofilin kipróbálható (van egy AlphaLISA SureFire ultra készlet a teljes cofilinhez, előzetes cetsa (cetsa) adatokkal, de még nincs teljesen validált készlet)