az Üstökösvizsgálatról szóló jelentéshez szükséges minimális információ (MIRCA): ajánlások az üstökösvizsgálati eljárások és eredmények leírására

a MIRCA iránymutatásokat a HCOMET COST Action tagjai dolgozták ki azzal a céllal, hogy javítsák az üstökösvizsgálati eredmények elemzését és jelentését (http://www.hcomet.eu/). A szerzők üstökösvizsgálati szakértők, akik legalább nyolc éves tapasztalattal rendelkeznek ezekkel a vizsgálatokkal (a szerzők közül 15 >20 éves releváns tapasztalattal rendelkezik). Internet alapú kérdőívet használtunk a szerzők véleményének mintavételére a részletek jelentésének fontosságáról (1.táblázat; kiegészítő adatok). A szerzők minden információt lényegesnek, kívánatosnak vagy nem fontosnak minősítettek,és az osztályozáshoz egy 75% – os kongruencia küszöböt használtak. Ha az alapvető információkra adott válaszok száma nem érte el a 75% – os egyetértési küszöböt, az alapvető információkra és a kívánatos információkra adott válaszokat összevonták, és az információt kívánatos információnak minősítették, ha a szerzők 75% – a egyetértett azzal, hogy az vagy lényeges, vagy kívánatos. Az 1. táblázatban az egyes ajánlásokhoz magyarázó megjegyzéseket fűzünk.

specifikus MIRCA ajánlások az üstökösvizsgálat minden egyes lépésére

1a lépés: Sejtek izolálása és egysejtű szuszpenziók készítése

mivel a comet-vizsgálat során egysejtű szuszpenziókat használnak, a nem egysejtűként nyert mintákat mechanikusan vagy enzimatikusan kell kezelni a sejtek extracelluláris mátrixhoz vagy egymáshoz való kötődésének megszakítása érdekében. A szövetek mechanikai megszakítással történő homogenizálása önmagában DNS-károsodást okozhat, míg a szövet enzimatikus emésztése a DNS-elváltozások eltávolításához vezethet az endogén DNS-javító enzimek aktivitása miatt, vagy növelheti a DNS-károsodás szintjét azáltal, hogy nukleázokat szabadít fel a sejtekből. A homogenizációs puffer összetétele kívánatos információ, különös tekintettel a DNS integritásának megőrzéséhez szükséges komponensekre (pl. etilén-diamin-tetraecetsav)24,25. Az egysejtű szuszpenziók izolálására vonatkozó eljárás leírása, beleértve a szövet homogenizálását is, kívánatos információnak minősül, amelyet cikkekben kell közölni.

a vérmintákat gyakran használják az emberi biomonitoring vizsgálatokban. Mivel a vér heterogén sejtpopulációt képvisel, a publikációkban elengedhetetlen a sejtpopulációra vonatkozó részletes információ. A szövegnek pontosan le kell írnia, hogy a minták teljes vér (beleértve a vörösvértesteket is), leukociták, mononukleáris vérsejtek vagy sejtek egy részhalmaza (például limfociták). Hasznos lehet továbbá a vénapunkció eljárásáról, az antikoaguláns típusáról és az azt követő sejtizolációs módszerről (Centrifugálási és mosási lépések) a kísérletet megismételők számára, tehát ez a kívánt információnak minősül. A sejtek vagy szövetek tárolási körülményeire vonatkozó információk, ha azokat fagyasztva tartják, valamint a fagyasztási módszer (pl. szárazjégen vagy folyékony nitrogénben történő gyorsfagyasztás vagy lassú fagyasztási eljárás) és a felolvasztási eljárás a jelentendő alapvető információnak tekintendők, mivel ezek a folyamatok bizonyítottan befolyásolják a DNS-migráció alapszintjét26.

1b lépés: Szubsztrátsejtek előkészítése az in vitro DNS-javító vizsgálathoz

bármely eukarióta sejttípus használható szubsztrátsejtként az in vitro DNS-javító vizsgálathoz, és a sejttípus és a sűrűség ‘kívánatos’ információ, amelyet jelenteni kell. A szubsztrátsejtekben a DNS-léziók kiváltására használt genotoxikus vegyület módszeréről és típusáról, valamint az azt követő sejttárolási körülményekről kell beszámolni, míg a szubsztrátsejtekben kimutatható DNS-elváltozások teljes szintjéről (pl., a formamidopirimidin DNS-glikoziláz – érzékeny helyek száma az Ro19-8022 plusz fénnyel kezelt sejtekben) csak ‘kívánatos’ információnak tekinthető.

1C lépés: vizsgálati kontrollok

ebben a cikkben a vizsgálati kontrollok olyan mintákra vonatkoznak, amelyek minden comet vizsgálati kísérletben szerepelnek; ezeket néha referenciastandardoknak, belső kontrolloknak vagy műszaki kontrolloknak nevezik16,27. A vizsgálati kontrollok jellemzően krioprezervált alikvotok egyetlen sejtcsoportból, amelyek ki voltak téve egy DNS-száltörő szernek (pl., ionizáló sugárzás, hidrogén-peroxid vagy metil-metánszulfonát) vagy olyan kezelés, amely egy meghatározott típusú DNS-elváltozást okoz (például a fényérzékenyítő Ro19-8022 plusz fény, vagy kálium-bromát kezelés a DNS oxidációjának kiváltására). A standard alkáli üstökös vizsgálathoz és az enzimmódosított üstökös vizsgálathoz különböző vizsgálati kontrollok léteznek. Az enzimmódosított vizsgálathoz használt vegyületnek nem szabad DNS-szál töréseket generálnia, mivel ezek csökkentik az enzimérzékeny helyek dinamikus tartományát. A biomonitoring vizsgálatokban, valamint a keresztmetszeti, intervenciós és klinikai vizsgálatokban az exponálatlan sejtek használhatók vizsgálati kontrollként. A standard és az enzimmódosított comet vizsgálat során egyaránt lényeges a vizsgálati kontrollok károsodási szintjeinek és a vizsgálati variációknak (standard deviáció) a jelentése.

az in vitro DNS-javító vizsgálat belső kísérleti kontrollokat használ, amelyeket a javítási aktivitás kiszámításához is használnak, nem pedig önmagában a vizsgálati kontrollokat. Alapvető információ a nukleoidokban található DNS-javító bemetszések szintjének jelentése (i) reakciópufferrel inkubált, nem kitett szubsztrátsejtekből, a szubsztrát DNS-ben bekövetkező DNS-károsodás alapszintjének meghatározása (azaz a háttérkontroll); (ii) a reakciópufferrel inkubált, kitett sejtek, a károsító anyaggal történő kezelés eredményeként bekövetkező nem specifikus DNS-szálszakadások vagy abázisos helyek szintjének feltárása (azaz a kezelés kontrollja); iii.a mintából származó fehérjekivonattal inkubált, nem exponált szubsztrátsejtek a nem specifikus bemetszési vagy hasítási aktivitás (azaz a specificitás-kontroll) ellenőrzése céljából; és iv. lézió-specifikus enzimmel inkubált szubsztrátsejtek, hasonlóan az enzimmódosított comet-vizsgálat vizsgálati kontrolljaihoz (azaz az inkubációs reakció kontrolljához).

1D.lépés: negatív és pozitív kontrollok

ebben a cikkben a negatív és pozitív kontrollok az OECD iránymutatásában (TG 489) leírt kísérleti csoportokra vonatkoznak az állati szövetekben végzett in vivo üstökös-vizsgálathoz18. Így a negatív és pozitív kontrollok az egész kísérletre vonatkoznak. A pozitív kontroll közvetlen vagy közvetett hatású genotoxikus vegyületre utal, amely DNS-szál töréseket vagy enzimérzékeny helyeket eredményez a comet-vizsgálattal kimutatva. Az enzimmel módosított üstökös-vizsgálathoz nem áll rendelkezésre olyan pozitív kontrollok listája, amely megfelel azoknak a vegyületeknek, amelyeket az OECD az alkáli üstökös-vizsgálat (DNS-szál törések indukálására) pozitív kontrolljaként sorol fel meghatározott állati szövetekben. Ezenkívül az emberi biomonitoring vizsgálatok esetében nem létezik pozitív kontroll, mivel az egészséges embereket szándékosan nem lehet genotoxikus szernek kitenni. A pozitív kontrollokat már kötelezőnek tekintik a genetikai toxikológiai sejttenyésztési kísérletekben, és de facto alapvető információnak számítanak a comet-vizsgálatot használó cikkekben. Állatkísérletekben azonban gyakorlati célokból a vizsgálati kontrollokra vonatkozó üstökösadatok (pl., a fenti, ‘1C. lépés, vizsgálati kontrollok’ című szakaszban említett minták) elegendőek, míg a valódi negatív és pozitív kontrollok eredményei csak ‘kívánatos’ információnak tekintendők.

2.lépés: a sejtek beágyazása agarózba

a comet vizsgálatot eredetileg három réteg agaróz felhasználásával fejlesztették ki üveglemezeken, a középső réteg tartalmazza a sejteket. Az agaróz felső rétege azonban nem szükséges, és bizonyos eljárások nem alkalmaznak alsó réteget (például Gelbond filmvizsgálatok). Kívánatos a diák típusát és méretét (pl., felület), mivel a sejtek aránya a gél széle közelében növekszik, ahogy a gél mérete csökken, és a gél szélén lévő nukleoidokban lévő DNS a nukleoidokban lévő DNS-től eltérően vándorolhat a gél közepe felé.22. Az agaróz végső koncentrációja (a sejtekbe ágyazva) elengedhetetlen a jelentéshez, mivel a DNS migrációja a gél sűrűségétől függ.

3.lépés: a sejtek lízise

a comet-vizsgálatban számos eljárás létezik a sejtek lizálására. A lízisoldat összetételére vonatkozó információk elengedhetetlenek. Bizonyos sejttípusoknál szükség lehet egy további enzim inkubációs lépésre (pl. proteináz K-vel), és az inkubáció részleteit is lényeges információként kell jelenteni. Egyes jelentések azt sugallják,hogy a lízis időtartama befolyásolhatja bizonyos típusú DNS-elváltozások stabilitását28,29, 30, ezért a lízis időtartama és a lízisoldat hőmérséklete kívánatos információ.

4a lépés: Javító enzimkezelés az enzimmódosított comet assay-ben

mivel a lízisoldat gátolhatja a javító enzim aktivitását, kívánatos annak megállapítása, hogy a lízis lépés és az enzimkezelés között mosási lépést hajtottak-e végre (azaz a mosópuffer összetétele, a mosások száma és időtartama). Alapvető fontosságú a javító enzimek forrásával kapcsolatos információk továbbítása, mivel kimutatták, hogy a különböző gyártóktól származó enzimek mind aktivitásukat, mind a nukleobázis elváltozásokkal szembeni specifikusságukat tekintve különböznek16. A legtöbb comet vizsgálatban titrálási görbe kísérleteket végeznek az enzimkezelés optimális körülményeinek azonosítására31; azonban az enzim titrálási görbék eredményeit ritkán jelentik, és itt kívánatos információként vannak besorolva (ehelyett egy korábbi vizsgálatra lehet hivatkozni), bár elengedhetetlennek tartjuk a kezelés időtartamának és hőmérsékletének jelentését. A gélre felvitt enzimkoncentráció lényeges információ; előnyösebb az enzimegységekben (U/ml) megadott koncentráció, bár a fehérjekoncentráció (mg/ml) szintén hasznos. Az inkubációs egység típusa (pl. inkubátor, csúszda vagy 12 géles rendszer) és az inkubációs mód a jelentendő ‘kívánatos’ információ. Meg kell állapítani, hogy az inkubálást (i) enzimfürdőben vagy a tárgylemezen lévő csepp-és fedőréteggel, (ii) standard 2-géles változatban, 12-géles vagy többkútos rendszerben, vagy (iii) párásított dobozban, inkubátorban, fűtőlapon vagy fűtött csúszda árokban hajtották-e végre.

4b lépés: Extraktum előkészítése és inkubálása in vitro DNS-javító vizsgálathoz

kívánatos a fehérjekivonatok előállításához felhasznált sejtek számának vagy szövettömegének jelentése, míg alapvető fontosságú a szubsztrát DNS-hez hozzáadott sejt-vagy szövetkivonatok végső fehérjekoncentrációjának jelentése. Az extrakciós puffer összetétele (‘kívánatos’ információ) kevésbé döntő fontosságú, mint az inkubációs puffer összetétele (‘Alapvető’ információ), mivel ez utóbbi befolyásolhatja a DNS-migráció háttérszintjét. Az enzimmódosított comet-tesztre vonatkozó információknak megfelelően kívánatos a titrálási kísérletek eredményeinek vagy az ugyanazon laboratóriumból származó korábbi vizsgálatok referenciáinak jelentése, ahol ezeket elvégezték. A gélbe ágyazott szubsztrátsejtekhez hozzáadott extraktum mennyisége ‘kívánatos’ információ. Elengedhetetlen a lappangási időszak időtartamának és hőmérsékletének jelentése, mivel ezek befolyásolják a javítási bemetszések számát. Ami az enzimmel módosított comet vizsgálatot illeti, az inkubációs mód az in vitro javítási vizsgálathoz szükséges ‘kívánatos’ információ. Az inkubációs reakció kontrolljaként használt enzim azonosságára vonatkozó információk (a szubsztrátsejtekben lévő DNS-léziók mennyiségének feltüntetése) és a nem exponált szubsztrátsejtekben a DNS-javító bemetszések háttérszintjéhez használt puffer összetételére vonatkozó információk elengedhetetlenek, mivel ezek kulcsfontosságúak a DNS-javító bemetszési aktivitás megbízhatóságának bizonyításához.

5.lépés: lúgos kezelés

a magas lúgos pH-értékű oldat megszakítja a DNS-szálakat összetartó hidrogénkötést, és bizonyos nukleobázis elváltozásokat DNS-szálszakadásokká alakít át. Így a lúgos kezelés időtartama befolyásolhatja a DNS-migráció szintjét a későbbi elektroforézisben32, 33, 34. A lúgos oldat összetételére, a pH-ra, a hőmérsékletre és a kezelés időtartamára vonatkozó konkrét információk tehát alapvető fontosságú információk.

6.lépés: elektroforézis

a DNS-migráció legfontosabb mozgatórugói az elektroforézis időtartama és az elektromos potenciál (feszültségesés az elektroforézis tartályplatformján)35. Alapvető fontosságú, hogy az elektroforézis puffer összetételét, az elektroforézis erősségét (feszültséggradiens (v/cm) az elektroforézis tartály platformja felett) és az elektroforézis időtartamát jelentsék. Az elektroforézis során fellépő magas hőmérséklet hatással lehet A DNS-migrációra36, így az elektroforézis oldat hőmérsékletére vonatkozó információ alapvető fontosságú, és ehhez a hőmérséklet állandó szinten tartása érdekében tett lépések leírása is társulhat (pl. a platform hűtése vagy a puffer keringtetése).

7. lépés: Semlegesítés

ez a lépés magában foglalja a felesleges lúgos oldat eltávolítását a tárgylemezekről a hatékony festés biztosítása érdekében. Kívánatos a semlegesítő oldat összetételének leírása.

8.lépés: festés és megjelenítés

a DNS-kötő színezékek eltérő kötődési affinitással rendelkeznek a DNS-hez,ezért a képelemző szoftverben az elsődleges comet-teszt leíróinak kiszámítását különbözőképpen befolyásolhatják36,37, 38. A festék típusa Alapvető információ, míg a koncentráció kívánatos információ, csakúgy, mint a festés és a vizualizáció közötti idő. A különböző típusú mikroszkóplámpák fényintenzitása eltérő. Ezenkívül a lámpa korától és az üstökösök pontozása során bekapcsolt időtől függően változik. Nincs azonban szabványos eljárás a fény intenzitásának mérésére és a DNS-migráció szintjének megfelelő korrekciójára. Ezenkívül úgy tűnhet, hogy ugyanaz az üstökös különböző szintű DNS-migrációval rendelkezik különböző mikroszkóp nagyításoknál. Ezért kívánatos a pontozáshoz használt mikroszkóp nagyítás jelentése. Kívánatos az üstökösök reprezentatív képeinek megjelenítése (pl., kontroll kevés vagy semmilyen migrációval, mérsékelt és kiterjedt DNS-migrációval) a DNS-migráció jelentett szintjei mellett.

9a. lépés: pontozás és adatelemzés

ez a lépés az elsődleges üstökösvizsgálat leírójához (pl.. % DNS a farokban, farokhossz, farokmomentum vagy vizuális pontszám), a mintánként elemzett üstökösök száma és a DNS-migráció általános szintjének kifejeződése (pl. az üstökös pontszámok mediánja vagy átlaga). Nem fontos az egyes üstökösök egyedi eredményének jelentése az egyes gélekben; ezek kombinálódnak a teljes kárszint kiszámításához. Mivel nem zárható ki, hogy a különböző képelemző szoftvercsomagok eltérő módon számíthatják ki az elsődleges comet assay prediktort, elengedhetetlen a használt szoftver (szoftvernév, gyártó, verzió) jelentése. Az összes elsődleges leíró osztja azt a korlátozást, hogy szakértelemre van szükség az üstökös-vizsgálat során, hogy megértsék, mit jelentenek, míg ha kalibrációs görbét hoznak létre (ionizáló sugárzás felhasználásával, amely ismert frekvencián szüneteket indukál), az eredmények átalakíthatók a változatlan nukleotidokhoz vagy nukleobázis-párokhoz viszonyított relatív léziós frekvenciává; ezek az adatok egyértelműek és olyan információkat közvetítenek, amelyeket minden kutató megérthet39. Korábban beszámoltak arról az eljárásról, amellyel ionizáló sugárzást alkalmazó kalibrációs görbét kapunk, és a DNS-vándorlási szinteket a változatlan nukleotidokhoz vagy nukleobázispárokhoz viszonyított léziós frekvenciává alakítjuk40. Ezért kívánatos az eredmények 109 változatlan nukleotidra vagy 106 nukleobázispárra jutó elváltozások szintjeként történő jelentése.

9b lépés: Az enzimérzékeny helyek vagy a szubsztrát DNS-ben lévő bemetszések nettó számának kiszámítása az in vitro DNS-javító vizsgálathoz

a DNS-javító enzimekkel történő inkubáció növeli a DNS-migráció szintjét, mivel mind a DNS-szál töréseinek alapszintje, mind az enzimspecifikus léziók hozzájárulnak a DNS-szál töréseinek teljes számához. Mivel a DNS-károsodás alapszintjének és az enzimspecifikus elváltozásoknak tulajdonítható DNS-migráció különböző genotoxicitási mechanizmusokból származhat, nem elegendő csak az enzimkezelés utáni DNS-károsodás teljes szintjét jelenteni. Ehelyett elengedhetetlen, hogy a genotoxicitást enzimérzékeny helyekként jelentsék, ahol az enzimmel kezelt tárgylemezeken a DNS-migráció alapszintjét kivonták a DNS-migrációból.

mivel az in vitro DNS-javító vizsgálat ugyanazokat a szubsztrátsejteket használja az összes sejt-vagy szövetkivonat-mintával, szükségtelen, hogy ugyanazon kísérletben (azaz a vizsgálat futtatásakor) minden egyes minta esetében párhuzamos háttér-és kezelési kontrollok legyenek. Több szubsztrátum is lehet (pl., mind a bázis -, mind a nukleotid-kivágási javító aktivitás elemzésekor), ezért külön kontrollokra van szükség a DNS-javító vizsgálat minden típusához. Alapvető fontosságú, hogy a szubsztrát DNS-ben a javító kivonat által végzett nettó bemetszéseket jelentsék.

9c lépés: Az eredmények statisztikai elemzése

a statisztikai elemzések elengedhetetlenek. A statisztikai elemzés típusa a vizsgálat kialakításától függ,és követi a genetikai toxikológia és biomonitoring területén végzett statisztikai vizsgálatok általános feltételezéseit41, 42.