az ellenszenves klórdekon peszticid átalakulása a Desulfovibrio sp által.86 a gyűrűnyílású klórmentesítésről a reduktív szulfidálási aktivitásra való átállással

a Desulfovibrio sp izolálása.86

a Desulfovibrio sp izolálása.A 86-ot a klórdekon-lebontó 865 konzorciumból érték el szulfát-redukáló körülmények alkalmazásával. Mivel a klórdekon átalakítására képes 86 baktériumkonzortiumot EGY MM + 5 nevű, klórdekonnal kiegészített dúsított ásványi közegből (MM) nyertük, a fő kémiai összetételt megtartottuk, de az elektrondonorokat és akceptorokat módosítottuk. Számos, a szulfát-redukáló baktériumok dúsítására használt közegkészítmény szerves savakat, például laktátot használ szén – és energiaforrásként (elektron donor) és szulfátot,amelyet eletron-akceptorként használnak a növekedéshez15,16,17, 18. Ebben az összefüggésben az MM + folyékony közegben lévő piruvátot laktáttal helyettesítettük, majd szulfátot adtunk hozzá (MMD folyékony közeg, lásd a “módszerek” részt). A dúsítást MMD agarra terítettük, majd a barna vibrio-szerű baktériumtelepeket (optikai mikroszkóp alatt megfigyeltük) két további lemezcsík segítségével tovább tisztítottuk (ábra. S1). Egy izolált baktériumtörzs azonos volt a Desulfovibrio sp – vel.86 a konzorciumtól 86 100% – os azonosságuk alapján 16S rRNS gének (egyenként 1538 bp).

a Desulfovibrio sp Genom analízise.86

a teljes genom egyetlen 3 464 070 bp kör alakú kromoszómából áll. A 61 genommal és 284 törzsvonallal végzett CheckM analízis19 azt mutatja, hogy a genom a Deltaproteobaktériumokhoz tartozik, és a CheckM teljessége 100% (nulla esszenciális marker hiányzik). A DNS átlagos G + C-tartalma 58,06%. Összesen 3342 kódoló DNS-szekvenciát (CDSs) jósoltak a kromoszómára, 4 pszeudogént és 10 különféle RNS-t (misc-RNS), 3 rRNS operont és 54 tRNS gént.

a Desulfovibrio sp három 16S rRNS génje.86 azonos. A legjobb BLAST hits (NCBI) voltak kulturálatlan Desulfovibrio sp. mikrobiális Üzemanyagcellákból származó klónok, például MFC63A04 (Genbank csatlakozási szám: FJ823865; lefedettség 98%; identitás 99,87%) 20. Egy filogenetikai fa, amely a termeszthető baktériumok rendelkezésre álló 16S rRNS-jét használja, megerősítette a Desulfovibrio sp közötti hasonlóságokat.86 és Desulfovibrio simplex DSM4141 (Genbank 16S rRNS csatlakozási szám: NR_117110; lefedettség 99%; identitás 99, 22%; genomiális szekvencia nem érhető el) (ábra. S2) 21. Genomi szinten a Desulfovibrio sp.86 az első helyen áll a Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27 774 Genom (GenBank:NC_011883). Ennek ellenére a Desulfovibrio sp.86 osztozik csak 1408 gének (43%) D. desulfuricans (több mint 80% aminosav identitás és 80% összehangolás lefedettség). Ezen túlmenően, az átlagos nukleotid identitások (Ani) között Desulfovibrio sp.86 és a szekvenált Desulfovibrio genomok alacsonyabbak, mint a fajok körülhatárolására általánosan elfogadott 95%-os Ani küszöbérték (ábra. S3) 22. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Desulfovibrio sp.A 86 valószínűleg a Desulfovibrio törzs új faja. Két szuperoxid-diszmutáz és egy kataláz gén jelenléte adja a relatív oxigéntoleranciát. Ahogy az várható volt, a Desulfovibrio sp.86 Genom mutat kiterjedt gén KOMPLEMENT kén anyagcsere, amely magában foglalja a kén légzési utak szervetlen források, mint a szulfát, szulfit, biszulfit és tetrationát, mint elektron akceptorok. Szerves kénforrásokat biztosíthatunk a kén biomassza (szulfokinovóz szulfokinovozil lipidek) szulfoacetát, a kén nem proteogén aminosav taurin keresztül szulfoacetaldehid, vagy alkánszulfonátok23.

Desulfovibrio sp.86 a klórdekont ismert transzformációs termékekké bontja le, valamint egy váratlan kéntartalmú vegyületet

az izolált Desulfovibrio sp klórdekonbontó képessége.A 86 törzset GC–MS (gázkromatográfiás tömegspektrometria) és LC-HRMS (folyadékkromatográfiás nagyfelbontású tömegspektrometria) technikákkal vizsgáltuk növekedési körülmények között, sikeresen alkalmazva a Desulfovibrio sp-re.86 izolálás (MMD folyékony közeg). Redukálószerként Na2S-t, anaerob N2/H2 (98/2; V/V) atmoszférát alkalmaztak kesztyűtartó rendszer segítségével. Ezek az inkubációs körülmények a klórdekon jel teljes eltűnéséhez vezettek a GC-MS–ben és az LC-HRMS-ben, és hasonló GC-MS és LC-HRMS TP profilokat eredményeztek, mint a Citrobacter sp esetében.866: monohidroklordekon A1, pentaklórindén B1, tetraklórindén B3-B4 és poliklórindén-karbonsavak C1-C2 és C3-C4 (ábra. 1a, b). A kesztyűtartó rendszerben a baktériumtenyészeteket 100 mL-es, hidrofób porózus fóliával ellátott injekciós üvegek segítségével végezték, hogy lehetővé tegyék a gázcserét és elkerüljék a szennyeződést. Ezt az inkubációs állapotot ” megújult légkör “állapotnak (RA) tekintették. Ebben a rendszerben a légkört rendszeresen megújították N2 / H2 – vel (98/2; V/V), és a dobozt nem termosztatikusan szabályozták, így a hőmérséklet 25 és 33 C között változott.86 tenyészetet MMD táptalajba helyeztünk 100 mL-es, Butil-gumi septa-val lezárt üveg fiolák felhasználásával, kemencében 30-on 60 C. A lezárt injekciós üvegeket kezdetben N2/H2 (98/2; V/V) gázzal tisztítottuk az anaerobiosis biztosítása érdekében. Ezt az inkubációs állapotot “zárt légkörű” körülményeknek (CA) tekintették.

a klórdekon transzformáció GC-MS és LC-HRMS monitorozása teljes szkennelési módban (tetszőleges egység) a Desulfovibrio sp által.86 RA körülmények között (kesztyűtartóban, anaerobiosis (N2/H2, 98/2, V/V), szobahőmérsékleten, nyitott injekciós üvegek porózus fóliával, 40 mg/L klórdekonnal kiegészített MMD táptalajban) és CA körülmények között (kemencében, anaerobiosis (kezdetben N2/H2, 98/2, V/V-vel kiöblítve), 30 db C, lezárt injekciós üvegek, MMD táptalajban 40 mg/L klórdekonnal kiegészítve); és a TP F1 azonosítása. a) A klórdekon transzformáció GC-MS monitorozása a Desulfovibrio sp által.86 körülmények között. b) a klórdekon transzformáció LC-HRMS monitorozása a Desulfovibrio sp által.86 körülmények között. C) a klórdekon transzformáció GC-MS monitorozása a Desulfovibrio sp által.86 körülmények között. d) a klórdekon transzformáció LC-HRMS monitorozása a Desulfovibrio sp által.86 körülmények között. In each graph, green circles represent chlordecone, red circles F1, blue triangles 10-monohydrochlordecone A1, pink squares 2,4,5,6,7-pentachloroindene B1 and purple diamonds 2,5,6,7-tetrachloroindenecarboxylic acid and 2,4,5,6-tetrachloroindenecarboxylic acid C1–C2. In RA conditions traces of B3-B4 and C3–C4 TPs were also detected. (e) Chlordecone transformation over the time in CA conditions, OD600 corresponds to the optical density at 600 nm in biotic conditions. (f) GC mass spectrum of F1 TP and its interpretation.

a klórdekonnal végzett hathetes inkubálás után a peszticid már nem volt kimutatható ugyanazokkal az analitikai technikákkal. Ezzel párhuzamosan megjelent egy ismeretlen, F1 nevű klórozott vegyület. Csak a GC–MS-en keresztül volt kimutatható (25,6 perc) (ábra. 1c). Mint a korábban jelentett klórdekon degradációs kultúrákban5, 6, a fő klórdekon transzformáció az állófázisban jelent meg (ábra. 1e). Mivel az LC-HRMS-ben nem volt látható klórozott csúcs (ábra. 1d), az F1 szerkezeti tisztázását a GC–MS adatok értelmezésén alapoztuk (ábra. 1f). Feltételezve, hogy az M/z 507,8-as középpontú izotópminta tartalmazza a molekuláris iont, két lehetséges semleges képletet feltételeztünk az F1-re, a C10Cl10O2H2-re és a C10Cl10SH2-re. A forráson belüli fragmentumok nagyon hasonlóak voltak a poliklórozott bishomokubán alapú struktúrákban megfigyeltekhez, beleértve a klórdekont, a hidroklordekont,a klórdekolt és a mirex5,6, 24-et. Valójában az izotópos minták m/z 201.0, 235.9 és 271.9 feltehetően az ismert bishomocubane retrocyclodimerizációból származik, és pozitív töltésű C5-fragmenseknek felel meg. Az izotópos szimulációkkal való összehasonlítás a következő gyökös ionokra korlátozta a lehetőséget: + * + * és+*, n = 0,1. Ez utóbbi bisz-oxigénezett Generikus képlet nagyon valószínűtlennek bizonyult, mivel a ciklopentenilgyűrűn olyan gem-diol funkció vagy gem-klór-hidrin rész jelenlétét igényelte, amelynek ellenállnia kellett a durva GC kromatográfiás körülményeknek (> 200 kb). Ehelyett arra a következtetésre jutottunk, hogy egy kénrész, azaz. tiol funkció, valószínűleg jelen volt a bishomocubane policikluson. Az F1 számára az ábrán látható szerkezetet javasoltuk. 2a és javasolta a klórdektiol nevet, a klórdekol (klórdekon-alkohol) kénanalógját.

a chlordectiol kémiai standard szintézise és teljes jellemzése. (a) A klórdektiol szintézis és az NMR eltolódások kémiai reakcióvázlata CD2Cl2: 1H NMR eltolódásban, dőlt és aláhúzott, valamint 13C NMR eltolódásban, félkövéren; a hasonló színű körök egyenértékű szénatomokat jelölnek. (b) a C10Cl10O2H-m/z szimulációja, (c) a c10cl10sh-m/z szimulációja, (d) a szintetikus klórdektiol extrahált nagy felbontású tömegspektruma negatív módban (LC-HRMS).

a klórdektiol standard szintézise és annak megerősítése, hogy az F1 transzformációs termék azonos a klórdektiollal

az F1 szerkezetének megerősítése érdekében a standard klórdektiolt kémiailag szintetizálták és teljesen jellemezték. A klórdekon kémiai reduktív szulfidálásának eléréséhez két lépésre volt szükség. Az első a klórdekon gem-diol funkciójának a megfelelő ketonformával egyensúlyban történő átalakításából állt20,25 kén analóggá, azaz gem-tiol/tiokarbonil résszé. Ennek a lépésnek a végrehajtásához általában foszfortartalmú kénreagenseket alkalmaznak26,27. Itt használt foszfor-dekaszulfid (P4S10) is nevezik Berzelius reagens27,28 protokoll szerint a Zaidi és munkatársai, akik sikeresen szintetizált kámfortiol29 (ábra. 2a). A második lépés a gem-tiol köztitermék redukciója volt NaBH4 alkalmazásával. Tisztítás után fehér szilárd anyagot kaptunk 73% – os teljes hozammal (ábra. 2a). Az 1D-és 2D-NMR analízisek megerősítették a klórdektiol szerkezetét: (i) két 1H jel, amelyek egy-egy protonra integrálódnak és összekapcsolódnak (3,78 ppm, d, J = 5,5 Hz és 2,01 ppm, D, J = 5,5 Hz), a hsqc kísérletben a 3,78 ppm-nél lévő jel korrelál egy 13C jellel, amely lefelé tolódott (55,1 ppm), és (ii) összesen hat látható 13C jel tükrözi a szimmetria síkját, amely a jelen bishomocubane szerkezetben konzerválódott (ábra. 2a, füge. S19–23). Bár a mikrobiális transzformáció során az F1-et nem lehetett kimutatni LC-HRMS eszközzel a fejlett körülmények között, a szintetikus standard klórdektiol koncentrált mintája jelentős jelet adott. A kénatom jelenlétét és a várható c10cl10sh2 semleges képletet megerősítették (ábra. 2c,d), és a nyers képletek C10Cl10O2H2 kizárták (ábra. 2b). Végül a GC–MS analízis kimutatta a tökéletes egyezést(azaz ugyanazt a retenciós időt 25,6 percig, és ugyanazt a forráson belüli tömegspektrumot. S6) a szintetikus szabvány és a TP F1 között, így határozottan klordektiolként rendeli hozzá. Valójában az F1 a chlordecone TPs új családjának első tagja, amely először kénatomot tartalmaz.

a Desulfovibrio sp.86 klórdekon transzformációs termékek lebontására

A1, B1, C1-C2 és F1 vegyületek, amelyek a TP-k négy családját reprezentálják, amelyek valószínűleg a Desulfovibrio sp jelenlétében képződnek.86-ot szintetizáltak a korábban ismertetett kémiai protokollok szerint6, és itt fejlesztették ki az F1 számára. Mindegyiküket a Desulfovibrio sp jelenlétében inkubálták.86 tenyészetek olyan körülmények között, amelyekről kimutatták, hogy elősegítik a reduktív szulfidációt (lezárt injekciós üveg; CA feltételek) vagy a klórmentesítést gyűrűnyílással (nyitott injekciós üveg; RA feltételek). Az összes minta Kettős GC–MS és LC-HRMS monitorozását végeztük.

egy hónapos inkubálás után CA körülmények között a 10-monohidrochlordecone A1 teljesen átalakult két ismeretlen klórozott vegyületté, amelyeket alig választottak el GC–MS alkalmazásával (retenciós idők: 24,3 perc F2 és 24,5 perc F3, ábra. 3, füge. S7–S11). Azonos forráson belüli tömegspektrumot mutattak, amely nagyon hasonló volt az F1 fragmentációs mintájához (ábra. S8). Az összes detektált forráson belüli fragmens egy klóratommal kevesebb volt, mint az F1 tömegspektrum analógjai. Az F2 és F3 vegyületeket tehát a 10-monohidrochlordektiol diasztereoizomerjeinek feltételeztük (ábra. 3c). Ezt megerősítette a két 10-monohidrochlordectiol standard kémiai szintézise a 10-monohidrochlordecone A1-ből a klórdektiol F1 szintézisére korábban alkalmazott eljárással (ábra. S24–27). Ezeknek a kémiai standardoknak ugyanaz a retenciós ideje (24,3 és 24,5 perc) és ugyanaz a tömegspektruma, mint a biológiai F2 és F3 (ábra. S8). A TPS B1, C1-C2 és F1 a Desulfovibrio sp-vel végzett hat hónapos inkubáció után sem változott.86 körülmények között.

a klórdekon transzformációs termékek sorsa a Desulfovibrio sp.86 az inkubációs körülményektől függően. (a) A klórdekon transzformációja RA körülmények között és (b) CA körülmények között. A c) A1, d) F1, e) B1 és f) C1–C2 átalakítása.

RA körülmények között végzett hat hónapos inkubáció után a klórdektiol F1 részlegesen átalakult 10-monohidrochlordektiol F2 és F3, valamint két másik, GC-MS–vel kimutatott klórozott faj, az F4 (retenciós idő: 17,9 perc) és az F5 (retenciós idő: 26,6 perc) (ábra. 3D, ábra. S12). E két vegyület egyike sem adott kimutatható jelet LC-HRMS-ben. A GC-MS elemzés lehetővé tette a C10Cl6SH4 javaslatát az F4 nyers képleteként (ábra. S14), és C11Cl10SH4 az F5 (ábra. S15). A metil-klórdecsulfidot kémiailag szintetizálták és teljesen NMR-vel jellemezték (ábra. S28–31). A metil-klórdecsulfid és a biológiai F5 GC retenciós idejének és GC tömegspektrumának tökéletes megfeleltetése (ábra. S13) megerősíti feltételezett identitását. Figyelemre méltó, a szerkezet F5 (ábra. 3d) az F1 S-metilezett formáját jelenti. Az F4 pontos jellege még tisztázatlan (lásd SI-kiegészítő szöveg). Az összes többi TP változatlan maradt RA körülmények között.

Összefoglalva, az A1 (RA körülmények között képződött) reduktív szulfidáción ment keresztül, csakúgy, mint a klórdekon; mindkét inkubációs körülmények között a poliklórindének (B1 és C1-C2) nem tűntek Lebonthatónak a Desulfovibrio sp által.86, míg az F1 (CA körülmények között gyártva) RA körülmények között átalakítható (ábra. 3).

bakteriális reduktív szulfidációhoz vezető inkubációs körülmények vizsgálata

a klórdekon transzformációs útvonalait befolyásoló fizikai-kémiai vagy fiziológiai paraméterek megkérdőjelezése a Desulfovibrio sp tenyészetekben.86, GC-MS monitoring (B1 és F1 jelenlét bizonyítékaként RA és CA feltételek, illetve) választottuk.

két kéntartalmú szervetlen vegyület, a na2s redukálószer és a Na2SO4 elektron akceptor volt jelen az eredeti MMD folyékony közegben. Az Na2S más kénezett vagy nem kénezett redukálószerekkel, azaz ciszteinnel és titán(III) – citráttal (TiCi) történő helyettesítésével lezárt injekciós üvegekben végzett első kísérletsorozat a klórdektiol F1 hasonló szintjéhez vezetett (1.táblázat). A TP B1 nyomait is megfigyelték minden kísérletben, beleértve az Na2S-t, a pozitív kontrollt (1.táblázat).

a második kísérletsorozatot Na2S redukálószerként és alternatív kén-alapú elektron akceptorként tervezték lezárt fiolákban (2.táblázat). A 90%-os 34S-dúsított szervetlen szulfát alkalmazása olyan klórdektiol terméket eredményezett, amely hasonló 34S-dúsítási szintet mutatott (90% 34S-F1/10% F1, ábra. S16). A tenyészet fejtérének GC-MS elemzése h234s és H3C34SH jelenlétét is feltárta (ábra. S16), ami azt mutatja, hogy Desulfovbibrio sp.86 előállított H2S szulfátból. Ezeket a gázokat CA körülmények között, MMD közeg alkalmazásával detektáltuk a tenyészet fejterében, míg RA állapotban hiányoztak a tenyészet fejteréből, amely megfelelt a kesztyűtartó légkörének (ábra. S17). A szulfát hiánya nem gátolta a Desulfovibrio sp-t.86 a növekedés azonban B1 képződést eredményezett (2.táblázat)5. A szulfát szulfit, biszulfit vagy tioszulfát általi eltávolítása minden esetben klórdektiol F1 képződéséhez vezetett.

az üvegeket használó harmadik kísérletsorozat a kultúrával érintkező gázfázis jellegének hatását vizsgálta. A kesztyűtartóban lévő nyitott injekciós üvegek és a kemencében lévő lezárt injekciós üvegek CA állapota között számos paraméter különbözött (légkör jellege és térfogata, hőmérséklet). Több injekciós üveget tartalmazó jar rendszer használata, szelektíven tanulmányozzuk a légkör megújulásának hatását a klórdekon transzformációra a Desulfovibrio sp által.86 MMD közegben. Mindegyik esetben a hidrofób porózus filmekkel ellátott nyitott injekciós üvegeket eredetileg kiválasztott gázzal megtisztított üvegekbe helyeztük. Az összes üveget inkubáltuk 30 C. néhányukat többször átöblítették, hogy utánozza a kesztyűtartó rendszert, míg másokat zárva tartottak.

az 1-4-es üvegek két azonos, nyitott, MMD-vel, klórdekonnal és Desulfovibrio sp-vel töltött injekciós üveget tartalmaztak.86 inokulum, és egy negatív abiotikus kontroll. Ezek közül két edényt hetente kétszer öblítettünk, 1 edényt (N2/H2 (98/2; V / V)), 2 edényt N2-vel (ábra. 4A), míg a 3. és 4. tégelyeket kezdetben N2-vel és (N2 / H2 (98/2; V / V)), illetve maradt unflushed (ábra. 4b).

gázvezérelt kísérletek sematikus ábrázolása. (a) öblített üvegek, (b) öblítetlen üvegek, (c) öblítetlen üvegek szulfátmentes Desulfovibrio sp.86 kultúra.

az utolsó két üveg (5.és 6. üveg) három nyitott, MMD-vel, klórdekonnal és Desulfovibrio sp-vel töltött injekciós üveget tartalmazott.86, plusz egy kultúra szulfát nélkül. Ezeket az üvegeket kezdetben (N2/H2 (98/2; V/V)) öblítették, majd 2 hónapig öblítetlenül hagyták (ábra. 4c).

az üvegekkel párhuzamosan két lezárt, szulfát nélküli MMD-vel, klórdekonnal és Desulfovibrio sp-vel töltött injekciós üveg.86-ot átöblítettünk ideiglenesen szintetizált H2S-sel (ábra. S4).

kéthónapos inkubálás után, 30 C-nél TP B1-et mutattak ki a kiöblített 1.és 2. üvegekbe helyezett injekciós üvegekben (3a. táblázat), míg a TP F1-et csak a 3. és 4. nem öblített üvegekbe helyezett injekciós üvegekben (3b. táblázat). Az abiotikus kontrollokban nem volt TP. Az 5.és 6. üvegekben az F1 mind szulfátban, mind szulfátmentes Desulfovibrio sp-ben volt jelen.86 nyílt tenyészet (3C táblázat). Ugyanígy a Desulfovibrio sp.86 H2S-sel átöblített szulfátmentes tenyészet szignifikáns F1 TP szintet mutatott, míg a negatív kontrollban nem figyeltek meg transzformációt (3D táblázat).

további kémiai kísérletet végeztünk a H2S klórdekon transzformációra gyakorolt hatásának felmérésére. Klasszikus kémiai protokollt alkalmaztak, amely lehetővé tette a B és C TPs képződését (klórdekon, titán-citrát, B12-vitamin, víz). N2 atmoszféra alatt B és C TP-ket kaptunk, H2S atmoszféra alatt azonban csak A1-et állítottunk elő (ábra. S18).

ezek az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a klórdektiol F1 képződéséhez zárt inkubációs rendszerre van szükség redukáló atmoszférával. Azonban H2 mint a kezdeti gáz atmoszféra nem kötelező, míg a jelenléte H2S szükséges. Kémiailag a H2S jelenléte megakadályozza a gyűrűnyitó deklórozási folyamatot.

a klórdekon-reduktív szulfidáció környezeti jelentősége

újravizsgáltuk a Martinique-sziget klórdekonnal szennyezett környezeti mintáinak korábbi gyűjteményét (nyolc talaj és két ágyas üledék), amelyekben a klórdekon TPs különböző szintjeit jelentették.6. Az itt közölt új kéntartalmú TP-k közül a két ágyas üledékmintában (927 és 928) észlelhető F1-szinteket találtunk, a becsült koncentráció körülbelül 50 Kb/kg, illetve 20 Kb/kg nedves üledék (S1 táblázat). Ezzel párhuzamosan ezeknek a mintáknak a metabarcoding elemzéséből származó bakteriális populációs sokféleségi adatok (ábra. 5.ábra. S5) dolgozták fel a környezeti minták hierarchikus csoportosulásának helyreállítása érdekében rendszertani összetételük szerint6. Megfigyelték, hogy a szulfát-redukáló baktériumok sokkal inkább jelen vannak az ágyi üledékekben, mint a többi rekeszben,amint azt korábban jelezték30,31, 32.

a környezeti minták hierarchikus csoportosításából előállított dendrogram a bakteriális populáció sokfélesége szerint (az R pvclust v.1.3-2 csomagból, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl117). 200 000 szekvenciát vettek minden környezeti mintára, és normalizálódtak. A kimutatott phyla százalékos arányát itt a deltaproteobacteria osztályba tartozó szulfát redukáló baktériumokra, a Firmicutes és a Nitrospirae phyla-ra összpontosítottuk. Piros színnel az elfogulatlan (au) p-érték, zöld színnel pedig a bootstrap valószínűségi érték (bp). SRB = szulfát-redukáló baktériumok.