Circular RNS: functions, applications and prospects

Bevezetés

a cirkuláris RNS-t (circrns) viroidként fedezték fel az RNS-vírusokban a 70-es évek közepén, kezdetben feltételezték, hogy endogén RNS splicing hiba . A számítási analízis és az RNS szekvenálási technikák fejlődésének köszönhetően ezek a félreértett körkörös struktúrák végül helyesen és mélyen felismerték mind a struktúrát, mind a funkcionalitást . Magjában a circrns egyszálú RNS, de abban különbözik a sokkal ismertebb lineáris RNS-től , hogy folyamatosan bezárult magában azáltal, hogy kovalensen összekapcsolta 5′ és 3′ végeit, így néhány lenyűgöző tulajdonságot mutat be, amelyeket még nem fedeztek fel teljesen: fehérje komplex állványzat, szülői gén moduláció, RNS-fehérje kölcsönhatások és mikroRNS (miRNS) szivacs, csak hogy néhányat említsünk . Ma már úgy tekintik, hogy alapvető szabályozási funkciót biztosítanak mind a növények, mind az állatok számára . Egyre több vizsgálati csoport mutatta be és igazolta olyan mértékben a körkörös RNS-ekben megjelenő hatékonyság és hatékonyság szintjét, amely tipikusan szükséges az életképes orvosi kezelésekhez és más biotechnológiai alkalmazásokhoz. Például gyakran beszámolnak arról, hogy a hagyományos biomarkerek jelentősen felülmúlják a javasolt circrns-helyettesítőket. A circrns-ek ígéretes képességeire vonatkozó egyre növekvő támogatás és bizonyítékok mellett több vizsgálatot és érdeklődést kell feltárni, nem csupán a struktúrák és mechanizmusok alapvető átfogó biológiai megértéséből, hanem a környező molekulákkal és környezetekkel való kölcsönhatásuk szisztematikus szintjén is. A circrns-ek a rák és más rosszindulatú betegségek megcélzásában rejlő potenciál és életképesség szempontjából egyenrangúak más újszerű kezelésekkel, például a személyre szabott orvoslással és az őssejt-terápiákkal.

Circrns jellemzők

a Circrns-ek általában 1-5 exonból állnak, és az exonokat szegélyező intronok legfeljebb 3-szor hosszabbak, mint lineáris megfelelőjük. A közelebbi elemzés számos komplementer inverter Alu ismétlődés jelenlétét tárta fel az intron szegmensekben , ami arra enged következtetni, hogy ez a különleges elrendezés valójában megkönnyíti az illesztési helyek könnyű megtalálását és elősegíti a körforgást. Mivel szorosan hurkolt szerkezetek, gyakorlatilag nincsenek 5 ‘és 3’ végszerkezetek, mint például a poli-a farok és az 5 ‘ sapkák a circrns-ben, immunissá téve őket az exonukleáz hasításával szemben . Empirikusan 2,5-szer hosszabb ideig tartanak, mint az emlősejtekben lévő lineáris társaik, amint azt az Enuka et al. . Ezeknek a fizikai tulajdonságoknak köszönhetően a közös laboratóriumi szűrési technikák, például az RNáz r lebomlása – egy enzim, amely kizárólag a lineáris RNS – t bontja le -, valamint a poli-a farokvizsgálat pontosan kiválaszthatja a szoros hurkolt struktúrákat a lineáris formák felett. Az elmúlt években számos kutatócsoport összpontosított a potenciális circrns izoformák azonosítására, olyan struktúrák, amelyek eredetileg ugyanabból a szülői DNS-ből expresszálódnak, de végső Érett formájában kissé eltérnek egymástól a spliceosomák specifitásának differenciálódása miatt, hogy felismerjék az exonokat és az intronokat a pre-mRNS szálon . Nevezetes csoportok közé tartozik Salzman, Jeck, Memczak, Guo és Zhang . Mint ilyen, a circrns hihetetlen sokfélesége elmagyarázta: az eukariótákban eddig 20 000 különféle típust azonosítottak, ez a szám a mai napig nyitott .

Circrns biogenezis és osztályozás

a circrns-ek kialakulása az exon-és intron-csoportok pozicionálásából és rejtjelezéséből ered, amelyek azok a szegmensek, amelyek a transzkripció után módosított végső termékben fenntartottak és elimináltak . Általában érett messenger RNS képződik, amikor a spliceosome nevű fehérje-RNS komplex katalizálja az intron szegmensek hasítását egy prekurzor-mRNS molekulában, általában az intron szegmenst mindkét végén szegélyező specifikus szekvenciák felismerésével. Az exonszegmensek összeolvadnak, míg az intronikus szegmensek ennek következtében eltávolodnak és lebomlanak. Ez a konvencionális felfogás nem veszi figyelembe az eltérést és a potencia különbségét az összes splice helyszínen , amelyek közül néhányat a spliceosome figyelmen kívül hagyhat, és elkerülhetetlenül a circrns szintéziséhez vezethet. Ezenkívül nem szabad figyelmen kívül hagyni az 5′ és 3′ splice hely térbeli elrendezésének hozzájárulását, mert ha az előbbi az utóbbitól lefelé helyezkedik el, akkor a spliceosome kedvezően kovalensen zárt körszerkezetet hoz létre egy lineáris exonikus molekula felett . Ez a mechanizmus, amelyet általában “Exon Rejtjelezésnek” neveznek, különböző típusú cirkrns-eket eredményez, beleértve az exonikus, intronikus, exon-intronikus és intergenikus . Rákspecifikus esetekben a belső struktúrát még nehezebb meghatározni a rosszindulatú daganatok kiterjedt és így invazív jellege miatt . Röviden bemutattuk a circrns-ek biogenezisét és funkcionalitását az ábrán. 1.

a körkörös RNS Biogenezisének és funkcionalitásának áttekintése. Magyarázat és lábjegyzetek: a a messenger RNS Érett formájában, amelyben mind az exonok, mind az intronok közötti kölcsönhatás hiányzik. B Lariat-vezérelt körforgás. Az upstream exon (1. exon) és a downstream exon (4.exon) kovalensen kötődik az mRNS összeillesztése miatt. Ez megkönnyíti az RNS lariat termelését a megmaradt párosított exonok mellett, amelyek a 2.és a 3. exonok. c RNS-kötő fehérje-és Intron-párosítás-vezérelt Cirkularizáció. Mindkét esetben az upstream és downstream intronokat (1-es és 3-as intronokat) párosítják, hogy a szendvics exonok (2-es és 3-as exonok) kölcsönhatásba léphessenek, az egyetlen különbség az, hogy az előbbi esetben egy külső RBP molekula csatlakozik az egyenlethez, hogy aktívan megkönnyítse a reakciót, míg az Intron-párosítás által vezérelt Cirkularizáció esetén az upstream és downstream intronok hidroxilcsoportja és foszfátcsoportja egymástól függetlenül párosul. a d ecircrns vagy Elcircrns a körforgás módjától függetlenül keletkezik. Bizonyos esetekben az intronikus szegmensek a hurokban helyezkednek el, ezért Elcircrns-eket eredményeznek, szemben a tisztán exonikus szegmenseket tartalmazó ecircrns-sel. az érett circrns-ek funkciói közé tartozik a miRNS-szivacsozás, amely kettős inhibitorként működik bizonyos kémiai reakciókban; a fehérje transzláció lehetséges, bár meglehetősen ritka, és kutatást végeznek annak megértése érdekében, hogy miben különbözik a lineáris RNS-fordításoktól; az RBP-fehérje komplex képződmények segítenek szabályozni és mérsékelni az útvonalakat, és közvetetten befolyásolják más circrns-ek termelését; mRNS kölcsönhatások, legyen az elősegítő vagy gátló

Circrns funkció: mikroRNS szivacsok

a circrns szerkezetének egyedisége miatt nem kódolják a fehérjéket, mint a lineáris formák . A vizsgálatok alátámasztó empirikus bizonyítékokkal igazolták, hogy bizonyos circrns-ek mikroRNS szivacsként működnek, és hatékonyan akadályozzák mechanizmusukat. A mikroRNS-ek 21-nt hosszú, nem kódoló RNS-szekvenciák, amelyek segítik a génexpresszió poszt-transzkripciós szabályozását, jellemzően azáltal, hogy az mRNS-ekhez kapcsolódnak, és gátolják annak fehérjévé történő transzlációját versenyképes vagy nem versenyképes módon. Magrégióik szerint családokba sorolják őket, attól függően, hogy azonos nukleotidszekvenciával rendelkeznek-e a 2-7 . A circrns-ek rendelkeznek azzal a komplementaritással, hogy ellensúlyozzák a mikroRNS-ekhez való kapcsolódást, felismerve a miRNS-ek magterületeit, és versenyszerűen deaktiválva őket. Két circrns különösen, illetve CDR1as és circSRY, a reflektorfénybe a tudományos kutatás jelenleg. Megfigyelték, hogy a CDR1as 70 konzervált kötődési helyet tartalmaz a miRNS-7 számára, ami messze szignifikáns, mint bármely más lineáris miRNS szivacs. Szivacsos képességét Memczak et al. , amely a CDR1as molekulák megkötését alkalmazta a Mir-7 emelkedett expressziója ellen a zebrafish agyában, hogy alátámasztó bizonyítékokat szerezzen a cdr1as gátló aktivitásáról a célzott miRNS ellen a későbbi zebrafish középagyi fejlemények figyelemmel kísérésével. A CircSRY-t viszont egér herékben tesztelik, és észreveszik a Mir-138 magrégió elleni kiegészítő támadását . Mivel 16 specifikus kötőhelyet tartalmaz, amelyek száma még mindig lenyűgöző az összes szivacsmolekula között, szivacs funkcionalizációs hipotézisük megerősítést nyer .

Circrns funkció: kölcsönhatás az RBPs-szel és a fehérje transzlációval

néhányan azt találták, hogy a circrns szabályozza a gén transzkripcióját és expresszióját más utakon keresztül. Kölcsönhatásba léphetnek az RNS-kötő fehérjékkel (RBP-k), mint például a circ-Foxo3, és együtt olyan komplexet alkotnak, amely befolyásolja a sejtek túlélését és proliferációját a p21 és a CDK2 kölcsönhatásával ; néhányuk erősíti az mRNS stabilitását duplex struktúrák kialakításával, mint például a Cdr1a-k esetében. Egy ellentmondásosabb megjegyzésben olyan csoportok, mint Legnini I. et al. és Pamudurti N. R. et al. felfedezték, hogy bizonyos circrns-ek fehérjéket képesek lefordítani, egyet egér myoblastokban, egyet pedig légyfejekben . Az ilyen hírek új hipotézist hoznak létre a circrns képességekről, amelyeket hagyományosan nem kódolónak tartanak . A hepatitis vírusból-egyszálú circrns-ből-lefordított fehérjék első felfedezése óta néhányan igazolták a circrns transzlációs képesség aktiválását egy IRES (belső riboszóma belépési hely) behelyezésével a start kodon előtt . Sokkal többet kell tenni, hogy teljes mértékben megértsük ezeknek a circrns-eknek a pontos transzlációs mechanizmusát, és hogy miért működnek, míg mások többsége nem.

Circrns alkalmazási potenciál

gyakorlati szempontból a circrns-ek életképes biomarkerek a betegségek diagnosztizálásában és kezelésében, mivel zárt kör alakú szerkezetük miatt az exonukleázok nem képesek könnyen lebontani őket. Egyes esetekben a circrns-ekről kiderült, hogy a hagyományos biomarkereket ütik. Például a circ-PVT1 felszabályozása gyomorrák (GC) szövetekben fokozza a Mir-125 szivacsos aktivitását, majd ezt követően ösztönzi a GC proliferációját ; a hsa_circ_0000190 azzal is felhívta magára a figyelmet, hogy éppen ellenkező módon működik – a GC-vel való érintkezéskor csökken a szabályozás, és tesztelik, hogy érzékenyebb és specifikusabb, mint az olyan biomarkerek, mint a CEA és a CA 19-9 . Egy másik példa a hepatocelluláris Carcinoma (HCC), ahol a jelen biomarker túlsúlyban van alfa-fetoprotein (AFP) . Az AFP gyenge érzékenységet mutat, amelynek során a HCC-ben szenvedő betegek 40% – a tesztelte a normál AFP szintet. Az érzékenység növelésének konstruktív módja más markerekkel való kombináció, ami nem hatékony megoldás. Alternatív megoldásként, Xingchen Shang et al. javasolta a circ_005075 és a tumor mérete közötti összefüggést, életképes prognosztikai biomarkerként sorolva fel, amely mind hatékonyságában, mind potenciáljában jobb stabilitásuk és specifikusságuk miatt. Ez arra utal, hogy a HCC-k kialakulása és inváziója szorosan kapcsolódik a circrns-ekhez, bár teljes mechanizmusa még mindig nem tisztázott. Mindazonáltal a rákkutatásra alkalmazható megvalósítható circrns biomarkerek listája nem korlátozódik kizárólag erre a két betegségre. Összefoglaltuk a rendelkezésre álló tanulmányokat a különféle emberi betegségekben részt vevő circrns-ekről, amelyek megtalálhatók az 1. táblázatban.

további friss tanulmányok azonosították és próbálják dekódolni a circrns-ek dúsulását és stabilitását az exoszómákban, egy olyan kombináció, amely tovább javíthatja a circrns-ek célzási képességét. Az exoszómák extracelluláris vezikulumok, amelyek fő feladata a különböző sejttartalom, vegyi anyagok és tényezők szállítása, így lehetővé téve a sejtek közötti kölcsönhatást és választ . Mint ilyen, jelentős számú sejtes változás és szöveti válasz annak a következménye, hogy a megfelelő, azonos kompatibilitású vezikulum sikeresen elérte-e rendeltetési helyét, illicitált válaszokat vagy szállított tényezőket . Az exoszóma mechanizmusának megértése elősegítheti a tumor mikrokörnyezetének és az intercelluláris hálózatnak a közvetítését, ezért a közelmúltban nagy érdeklődést váltott ki az exoszóma circrns iránt a megerősített hatékonyság és a rosszindulatú vagy hibásan működő sejtek célzási képességének fényében.

a circrns-ek eredete végső soron a donorsejtek megfelelő miRNS-szintjétől függ, amelyek mind immun, mind nem immun jellegűek lehetnek. Az exoszóma RNS-ek minimalizálhatják a DNS károsodását a sejtciklus felgyorsításával, amint azt a Mir-217 túlzott expressziójának egy közelmúltbeli esete mutatja, ami a clclin-D1 és EZH2 expresszió csökkenését eredményezi. Úgy gondolják, hogy ez a viselkedés összefügg a neoplasmia képződményeinek deregulált proliferációjával . Sőt, számos kísérleti eredmény arra a következtetésre jutott, hogy közvetlen kapcsolat van az exoszómák és a neoplasztikus transzformáció között, valamint a circrns mechanisztikus hatása a tumor mikrokörnyezetére . Figyelembe véve a hasnyálmirigy ductalis adenokarcinómáját (PDAC) például összefüggésbe hozták az exoszóma Circ-PED8A rendellenes magas expressziójával ; az exoszóma circNRIP1 elősegíti a metasztatist a gyomorrákban (GC) a Mir-149-5p szivacsosításával, egy másik tanulmányban. Talán a legjelentősebb az exoszóma circPTGR1 szerepe a hepatocelluláris Carcinoma (HCC) kialakulásában , amelynek során az exoszóma circrns szabályozása ösztönözte a tumor invázióját. Ezeknek a nagyon korrelációs eredményeknek köszönhetően az exoszóma circrns-eket diagnosztikai mutatóként javasolják a megfelelő rosszindulatú daganatokhoz annak alapján, hogy a válaszadó hogyan változik az expressziós szint és kiváló stabilitásuk, veleszületett célzott szállítási mechanizmusával párosulva . Jelenleg több mint 1000 circrns-t azonosítottak az exoszómákban az egész emberi testben, további kutatásokat végeztek az extra exoszóma-circrns-rák kombinációk felfedezésével kapcsolatban.

circrns kihívások és kilátások

annak ellenére, hogy egyre több kutatást végeztek a circrns népszerűségének növekedésével párhuzamosan, a legtöbb circrns biológiai funkciója továbbra is rejtély. Megfigyelték például, hogy a circrns-ek többsége a citoplazmában járőrözik, de a sejt magjából származnak, ezért felmerül a kérdés, hogyan illeszkednek át az apró nukleáris póruson. Továbbá az a tény, hogy a kör alakú exonok közül sok (85%) átfedésben van a fehérjét kódoló szekvenciákkal, de a circrns-ek többsége nem kódolja a fehérjéket, még meg kell vizsgálni. Klinikai szempontból további vizsgálatokra van szükség ahhoz, hogy teljes mértékben helyettesítsék a hagyományos diagnosztikai eljárásokat. Az olyan aggályokkal, mint a traumát okozó betegszövet-extrakció és a drága circrns-kimutatás a szövetekben, továbbra is foglalkozni kell, miközben teljes körű megértést kapnak másodlagos struktúráikkal és egymás közötti eltérő szerepeikkel kapcsolatban. A megfelelő circrns biomarkerek megfelelő beadásának elmulasztása a betegeknél elhomályosíthatja a klinikai eredményeket, amelyeket a javasolt circrns-ek keletkezéséről, lokalizációjáról és lebomlásáról szóló jobb kép megszerzése révén kell leküzdeni.

ennek ellenére a circrns-ek továbbra is vonzó lehetőségek számos biológiai terápiás eszköz kifejlesztésére. Már beszámoltak mind in vitro, mind in vivo RNS-konstrukcióról, amelyek az I. csoport permutált intron-exon (PIE) szekvenciáit használják a spliceosomal-backsplice-site határoló szekvenciák komplementer célzására, és ez a mechanizmus extrapolálható bármilyen ismert szerkezetű szekvenciára vagy fehérjére, ha úgy kívánjuk. Mellékesen megjegyezném, hogy a circrns diagnosztikai lehetőségeinek sokféleségének kiszélesítésében sok javításra van szükség. Egy példában, a vér jelenlegi molekuláris elemzése megmarad a genomi-DNS sejtmentes fragmenseinek elemzésekor; Nagyszerű jövőbeli kilátás lenne a betegségre jellemző extracelluláris vezikulák mintavételének megfontolása a betegség kialakulásának és progressziójának részletesebb figyelemmel kísérése érdekében. Ezek az ötletek alapozzák meg a szelektív fehérje szabályozás és a programozott sejtjelzés további javaslatait. Amint azt a folyamatban lévő kísérletek újra és újra bizonyították, a circrns-ek magabiztosan megmutatták szivacsos és biomarking-potenciáljukat, ami arra késztet bennünket, hogy feltárjuk a régóta félreértett circrns-ek titkait.