cirkuláris RNS differenciális expresszió vérsejt populációkban és circrns dereguláció feltárása gyermekgyógyászati akut limfoblasztos leukémiában

circrnaomes B-, T-sejt és monocita populációkban

circrns expressziót vizsgáltunk egészséges donorok B-, T-sejt és monocita populációiban nagy mélységű ribodepletált RNS-12 minta SEQ adatai, 4 replikációval minden egyes sejtpopulációra rendezve perifériás vér mononukleáris sejtjeiből Pbmc-K (GEO series ID: GSE110159; kiegészítő módszerek és 1. Kiegészítő táblázat).

a Circrns számszerűsítését és annotálását a CirComPara25 biztosította, amely 9 circrns detektáló szoftvereszközt (CIRI226 Findcirc27; CIRCexplorer228 a BWA29, STAR30, Segemehl31 és TopHat232 aligners; DCC33; circRNA_finder34; és Segemehl31) kombinált a legmegbízhatóbb backsplices eléréséhez. Valójában két vagy több circrns detektálási algoritmus megosztott kimenete bizonyítottan csökkenti a hamis pozitív előrejelzéseket35, 36. A CirComPara elvégzi az olvasási előfeldolgozási minőségi szűrőket, mint például az adapter vágása, az olvasási átlagminőség kiválasztása és az olvasási hossz szerinti szűrés. Ezenkívül a CirComPara megszámolja az egyes circrns hátsó csomópontjaihoz igazított lineárisan illesztett olvasmányokat, hogy megbecsülje a circrns gazdagénjéből expresszált lineáris átiratok expresszióját. Ezeket az értékeket kombináltuk a kör alakú kifejezést mérő fordított olvasási számokkal, hogy kiszámítsuk a kör alakú és a lineáris izoformák közötti expresszió arányát (kör-lineáris expressziós Arány, CLP; lásd módszerek). Ezenkívül a CLP beágyazza a körkörös-lineáris expressziós korreláció fogalmát, így a CLP-variáció a körülmények között közvetíti a circrns és a gazdagén lineáris expressziója közötti függetlenség sebességét33.

összességében 68 007 circrns-t detektáltak 10 148 egyedi génből legalább két módszerrel. Amint arról Hansen et al.36, Az algoritmusok többnyire egyetértettek az erősen kifejezett circrns-ekben, míg azok, amelyeket csak egy algoritmus észlelt, általában alacsony olvasási számmal rendelkeztek (kiegészítő ábra. 1).

továbbá egy 6228 circrns-ből álló alcsoportot (3323 génből), amely legalább egy sejttípus összes biológiai replikációjában expressziót mutatott, és “nagy megbízhatóságú” (HC) circrns-nek nevezték (2.Kiegészítő táblázat). Az ebben a vizsgálatban jelentett circrns-ek összehasonlítása Nicolet et al.17 megerősített konkordancia az előző vizsgálatban lekért 489 HC circrns 83% – ánál, és 5824 további HC circrns-t tárt fel, amelyeket még nem vizsgáltak a vérsejtpopulációk expressziós variációja szempontjából (kiegészítő ábra. 2A).

a 6228 HC circrns – ből 5970 és 5821 expresszálódott B-és T-sejtekben, és 5144 monocitákban (ábra. 1a). A circrns-ek többségét (4763; 80%) mindhárom sejttípusban kimutatták, beleértve az mindenütt jelen lévő circZNF60937, circHIPK338 és új circrns-eket. Az új circrns-ek (pl. circPICALM) valószínűleg specifikusak a haemopoetikus kompartmentre. Circrns megosztott két sejttípus, ahol többnyire közös között limfociták.

B-, T-sejtek és monociták circRNAome összehasonlítása. a) A B-, T-sejtekben és monocitákban kifejezett 6228 nagy konfidenciájú (HC) circrns átfedése; b) a HC circrns expressziós profilok főkomponens-elemzése; c) validált circrns-ek Az RNase r kezelés után. A B2M, a GAPDH és a HPTR mRNS−ek pozitív kontrollként jelennek meg; a relatív expresszió 2-CQ-ként kerül kiszámításra, ahol a CQ a kezelt RNáz és az összes PBMC RNS közötti különbség; d) a circrns-ek száma génenként, az egyes sejttípusokban kifejezve.

a felügyelet nélküli főkomponens-elemzés viszonylag kis eltéréseket mutatott a circrns expressziós profilokban ugyanazon sejtpopuláció replikációin belül, és rámutatott a circrnaome különbségekre, amelyek egyértelműen megkülönböztették a sejttípusokat (ábra. 1b).

21 HC circrns expresszióját VALIDÁLTUK RT-PCR-rel különböző egészséges donorok Pbmc-jeiben (3.Kiegészítő táblázat; 1. táblázat; ábra. 1c). Ez a validáció 15 különböző gén exonikus circrns-ét, az IKZF1 két alternatív izoformáját, valamint az Y kromoszómából származó férfi-specifikus ZFY-t, egy circrns-t (18:63280887-63281214: -) az egyedi nagy BCL2 intron 328 bp-jének cirkularizációjából, valamint egy feltételezett új génből (“intergenikus”, lásd alább) származó circrns-ből származik. A circrns-ek körkörös szerkezetét megerősítette a circrns-ek megfigyelt dúsulása az RNáz r kezelés után, és QRT-PCR-rel detektálta a hátsó csomópontra jellemző divergens primerekkel14, 27. Sőt, az összes előre jelzett backsplice csomópontot Sanger szekvenálással igazolták.

több kör alakú izoformák és circrns-ek új génekből

majdnem minden circrns (99,4%) annotált génekből származik, túlnyomórészt backsplice csomópontokkal, amelyek átfedik az ismert exonokat (98,9%). A 71 circrns közül, amelyek mindkét végén intronikus régiók voltak, a leggyakoribbak a limfocita-specifikus circBCL2, amelyet validáltak, circHLA-E, circrassf3és számos circMBL1 izoforma.

a circrns gazdagének csaknem fele több (legfeljebb 20) kör alakú izoformát expresszált (ábra. 1d). Megfigyelték egy vagy néhány elterjedt izoforma preferenciális backsplice junction használatát és expresszióját. Az izoformák legnagyobb számát monocitákban az AGTPBP1 (20) és a PICALM (15), lymphocytákban pedig az UBAP2 (19) és az ATM (17) expresszálta.

harmincnégy circrns intergenikus régiókból származik. Intergenikus circrns-ek, amelyek ugyanazt a hátlapot használják, különböző kombinációkban három lókuszt azonosítottak, amelyek több izoformát fejeznek ki. Öt” intergenikus ” circrns származik egy feltételezett új génből az Xq11.2 régióban (chrX:65051462-65113813) (kiegészítő ábra. 3). A lokusz leggyakoribb circx(intergenikus) (X:65051462-65075912:+) circx-je, amelyet korábban memczak és kollégái is kimutattak a vérben12, validált (ábra. 1c).

ezután megvizsgáltuk, hogy a kifejezés milyen mértékben támogatja a körkörösséget a hátlapi csomópontokat átfedő lineáris átiratok tekintetében. A CLP értékek 0-tól 1-ig terjednek: 0 akkor jön létre, ha nincs körkörös expresszió, 0 < CLP < 0,5 a circrns-eket kevésbé bőségesen fejezi ki, mint a megfelelő lineáris izoformák, 0,5 azt jelenti, hogy a körkörös és lineáris átiratok ekvivalens bőséggel rendelkeznek, 0.5 < CLP 6 a kör alakú izoformákat a megfelelő lineáris átiratoknál nagyobb mennyiségben fejezik ki. Különösen CLP = 1, ha a circrns-hez viszonyított lineáris expressziót nem észlelik. Érdekes módon 10 circrns esetében nem észleltek lineáris expressziót. Ezenkívül a CLP figyelemre méltóan magas volt (>0,95) 14 circrns esetében (4.Kiegészítő táblázat), beleértve a circGUSBP2-t és a circNBPF10-et, a medián CLP 0,99-1 között volt az összes sejtpopulációban (4. Kiegészítő táblázat), és a circAFF2, amely magas CLP-t mutatott a monocitákban (0,97). Preferenciális transzkriptum cirkularizáció Érett vérsejtekben specifikus genes5,39 és / vagy nagyobb a cirkuláris stabilitás a lineáris RNS-ekhez képest16,40 magyarázhatja ezeket az eredményeket.

a sejttípusok összehasonlítása feltárta a sejttípus-specifikus circrns expressziót és az alternatív cirkularizációs mintákat

ezután a B -, T-sejt és monocita populáció circRNAomes különbségeinek meghatározását céloztuk meg. A három populáció páros összehasonlítása összesen 1369 szignifikánsan differenciálisan expresszált circrns-t (DECs) azonosított a sejttípusok között (5.Kiegészítő táblázat), amelyek 880 génből származnak. A DEC expressziós profilok hierarchikus csoportosítása tükrözi az egyes cellatípusokban szabályozott circrns-eket (ábra. 2a). DECs kizárólag vagy túlexpresszált egy sejttípus jelzett populáció-specifikus circrns (ábra. 2b): 622 volt jellemző a B-sejtekre, 183 A T-sejtekre és 438 a monocitákra (összesen 1243; 5.Kiegészítő táblázat). Ezenkívül 72 DECs-t szabályoztak mindkét limfocita populációban (ábra. 2b-d). A B-sejtre jellemző circrns-ek génjei nem eredményeztek szignifikánsan dúsított Kegg-útvonalakat, amelyek ennek ellenére tartalmazták a B-sejt receptor jelátviteli útvonalában részt vevő géneket, mint például a SOS2 és az NFKB1, vagy kapcsolódnak a B-sejt funkcióihoz. Éppen ellenkezőleg, a T-sejt jellegzetes circrns-eket expresszáló gének jelentősen gazdagították a T-sejt receptor jelátviteli utat. Ezenkívül a monocita-jellegzetes circrns-ek génjei jelentősen gazdagították a monocita funkciókhoz kapcsolódó számos biológiai folyamatot és útvonalat. Ehelyett más sejttípusra jellemző gazdagének sejtfunkciói nem kapcsolódtak közvetlenül a származási sejthez (6.Kiegészítő táblázat).

a circrns-ek differenciális expressziója Érett vérsejt-populációkban. (a) hierarchikus csoportosítás (euklideszi távolság; teljes klaszterezés) 1369 expressziós profil szignifikánsan differenciálisan expresszált circrns (DECs) a sejttípusok között. (B) Venn-diagram, amely az egyes populációkban túlexpresszált circrns-ek átfedését mutatja: a nem metszéspontú részek felvázolják a sejttípus-specifikus túlexpresszált circrns-eket. (c) A DECs Gazdagénjei csak egy sejttípusban vannak túlexpresszálva: a metszésponti régiók különböző cirkuláris izoformákat expresszáló géneket képviselnek, amelyek különböző sejttípusokban vannak túlexpresszálva. (d) 15 circrns expressziójának qRT-PCR validálása, amelyek közül 13 szignifikánsan túlexpresszálódik monocitákban (M), T-sejtekben (T), B-sejtekben (B) vagy mindkét limfocita populációban (T + B). Az RNS-seq adatokkal összhangban a circZFY és a circGRHPR nem volt szignifikáns különbség. A hátlapban részt vevő génexonok zárójelben jelennek meg a circrns név után. Kifejezés a B-sejtek átlagához viszonyítva. Mann-Whitney U-teszt, p-érték * < 0.05, ** < 0.01.

bár a sejttípusra jellemző circrns-készletek diszjunktak voltak, a specifikus izoformákat expresszáló génkészletek átfedése alternatív sejttípus-specifikus cirkularizációs mintákat jelzett. Megjegyzendő, hogy 37 gén két sejttípusra jellemző circrns-t fejezett ki, és a több sejttípus-specifikus circrns-sel rendelkező gének 14,7% – át tette ki (ábra. 2c). Négy circAKT3 izoforma sejttípus-specifikus expressziót mutatott, három A B – és egy a T-sejtek esetében; négy circMBNL1 is sejttípus-specifikus volt, 3 A B-sejtek és egy a monociták esetében. Ezenkívül hat különböző grk3 kör alakú izoformát specifikusan túlexpresszáltak A B-sejtekben, míg két másik csak monocitákban volt túlexpresszálva.

a QRT-PCR-rel végzett mennyiségi meghatározás B-sejtekben, T-sejtekben és 5 független egészséges donorból válogatott monocitákban megerősítette az RNS-seq eredményeket mind a 15 vizsgált circrns-re vonatkozóan, alátámasztva az adatok robusztusságát és reprodukálhatóságát (ábra. 2D és kiegészítő ábra. 4).

az 5 circrns-ből álló B-sejtekben szignifikáns up-regulációt igazoltak, beleértve a circAFF3-at (4-6 exon), a circIL4R-t (6-7 exon), a circetbp1-et (2.exon). Sőt, magas circrns expresszió a 9p13.2 genomi régióból, beleértve a PAX5-et is (kiegészítő ábra. 5) validálták: a circPAX5 (2-5.exon) és a circZCCHC7 (2. exon) egyaránt B-sejtspecifikusak voltak, míg a circGRHPR B-sejtekben történő felszabályozásának tendenciája megegyezett az RNS-seq adatokból származó becsléssel. A PAX5 feltűnő szerepet játszik a B-sejtek elkötelezettségében41 és a pax5 és a ZCCHC7 lineáris transzkriptumok együttes expresszióját leírták a közös limfocita prekurzorokról a pre-pro-B sejtekre való progresszió során42. A 9p13 együttes szabályozására utal.2 locus, circPAX5, circZCCHC7 and circGRHPR isoforms were all overexpressed specifically in B-cells. CircPAX5 and circZCCHC7 were previously detected in CD19 + cells14. Both circZCCHC7 and circGRHPR were identified in CD34 + cells and, according to data on RNA base modification promoting efficient initiation of protein translation from circRNAs in human cells, are likely to encode peptides10.

Regarding T-cells, significant overexpression was confirmed for circIKZF1 (exons 2–3), circTNIK (exons 5–7), circTXK (exons 2–6) and, in agreement with previous reports17, for circFBXW7 (exons 3–4). Also an increasing trend for circZFY (exons 2–3) in T-cells and for circAFF2 (exon 3) in monocytes, in agreement with Nicolet et al.17, confirmed RNA-seq results, while significant upregulation of circX(intergenic) and circBCL2(intronic) in lymphocytes and of circHIPK3 (exon 2) in monocytes was validated.

Nicolet et al.17 102 circrns-t találtak különbözően kifejezve a vérsejtek típusaiban és stádiumaiban, amelyek közül 98-at detektáltunk az adatainkban. Különösen, 42 circrns-ek eredményeztek differenciálisan kifejezve összehasonlításunkban is, 31 amelyek sejttípus-specifikusak voltak. Összességében adataink, ahol a circrns klaszterekkel egyetértésben korábban érett sejtpopulációkhoz kapcsolódtak (kiegészítő ábra. 2b). A lymphoid sejtspecifikus klaszterekhez korábban hozzárendelt circrns-ek a legnagyobb expressziót mutatták a B-sejtekben vagy a T-sejtekben, beleértve a circZCCHC7-et és a circFBXW7-et, amelyeket kísérletileg validáltunk. A korábban monocita-specifikusnak tekintett 10 circrns-ből kilencet emlékeztettünk arra, hogy elemzésünk jobban kifejeződött monocitákban, beleértve a circAFF2-t is. Azonban a jelen vizsgálatban sejttípus-specifikusként definiált 1243 circrns többsége, köztük 11 a 15 circrns-ből, amelyeknél a sejttípus-specifikus túlexpressziót QRT-PCR igazolta ebben a vizsgálatban (ábra. 2D), nem képviseltették magukat a Nicolet et al.

ezután megvizsgáltuk, hogy a körkörös izoformák bősége a lineáris expresszió tekintetében megváltozott-e a sejttípusok között. A mintafeltételek közötti CLP-variációk jelzik a circrns és a gazda-gén lineáris expresszió közötti függetlenség mértékét. Először azt figyeltük meg, hogy a nagyobb körkörös expressziós arányú circrns-ek száma (CLP > 0,5) a lymphoid sejtekben volt a legmagasabb (185 monocitákban, 333 és 364 B-sejtekben, illetve T-sejtekben), ami összhangban van a korábbi megfigyelésekkel egy kisebb circrnas-halmazon17. Ezután 687 circrns-t azonosítottunk (495 génből) gazda-gén független expresszióval (7.kiegészítő táblázat). A DECs-k között a 163-ban a cirkuláris expresszió arányának szignifikáns változása volt a sejttípusok között, összhangban a differenciális abszolút expresszióval, jelezve, hogy ezeknek a circrns expressziós szintnek a sejtpopulációk közötti megfigyelt variációi nem a lineáris expresszió megfelelő variációjának tudhatók be. A CircIKZF1, amelyre a T-sejtek upregulációját validálták, szintén magas CLP-vel expresszálódott a T-sejtekben. Különösen 25 circrns mutatott magas és szignifikánsan változó körkörös expressziós arányt (kiegészítő ábra. 6), beleértve a validált circX – et(intergenikus) és három további intergenikus circrns-t, amelyek mind túlexpresszáltak A B-és T-sejtekben. A CircSMARCA5 volt a legmagasabb abszolút és relatív körkörös expresszió a B-sejtekben, míg szignifikánsan alacsonyabb volt a T-sejtekben és a legalacsonyabb a monocitákban (kiegészítő ábra. 7).

Circrns-ek expressziója a B-sejt prekurzor akut limfoblasztos leukémia hat citogenetikai altípusában

a fent leírt transzkriptómára kiterjedő circrns-erőforrásból kiindulva megvizsgáltuk a circrns-ek expresszióját és lehetséges deregulációját a BCP-ALL-ben a circrns-ek célcsoportja szempontjából. A kiválasztott circrns-ek limfocita specifitást mutattak és / vagy leukémiával összefüggő lókuszokból származtak. Ezeket a kritériumokat követve tíz circrns validált upregulációval B-sejtekben, T-sejtekben vagy mindkét limfocita populációban (ábra. 2D) kiválasztásra került a BCP-ALL mennyiségi meghatározására, beleértve az ismert génekből (AFF2, AFF3, BCL2, FBXW7, IKZF1, IL4R, PAX5, SETBP1 és ZCCHC7) származó circx(intergenikus) circx-eket és az újonnan azonosított, lymphocytákban erősen expresszált circx-eket. Ezenkívül a circZFY, a circrns magas szinten expresszálódik a férfi alanyok vérsejtjeiben; a circHIPK3, amelynek onkogén tulajdonságai ismertek a szilárd rákokban43; és a circPVT1, amely a közelmúltban kapcsolódik az akut limfoblasztos leukémia22-hez, szerepeltek.

a 13 kiválasztott circrns expresszióját qRT-PCR-rel mértük 32 BCP-all betegből származó xenograft (PDX) mintában (8.kiegészítő táblázat).

az összes leukémiás mintát először egészséges donorok B-sejtjeivel hasonlították össze (kiegészítő ábra. 8.ábra. 3a) a deregulált circrns expresszió ellenőrzésére leukémiás sejtekben. Hét circrns esetében az expresszió szignifikánsan különbözött az összes mintában a B-sejtekhez képest. CircIL4R, circZCCHC7 and circX(intergenic), all highly expressed in lymphocytes, were less expressed in ALL. Conversely, overexpression of circAFF3, circHIPK3, circPVT1 and circPAX5 in BCP-ALL emerged. Differently from circPVT1 and circHIPK3, a functional characterization of circPAX5 and circAFF3 is still lacking. Thus, custom functional predictions, in terms of possible miRNA- binding sites, RNA binding protein (RBP) binding sites, and coding potential were obtained (Fig. 3b and Supplementary Fig. 9).

Circrns expresszió betegből származó BCP-minden mintában és a circAFF3 és circPAX5 várható funkcióiban. (a) 12 circrns relatív expressziója QRT-PCR-rel értékelve egészséges PBMC-ből származó B-sejtekben és 32 BCP-all betegből származó xenograft minta különböző genetikai altípusokkal: MLL átrendeződött (n = 4), BCR-ABL (3), ETV6-RUNX1 (6), TCF3-PBX1 (4), magas hiperdiploid (>50 kromoszóma, 7), “egyéb” (negatív az említett átrendeződésekre, 8). A B-sejtekhez viszonyított expresszió. Csak jelentős p-értékek (<0.05) jelennek meg (Kruskal-Wallis teszt, Benjamini, Krieger és Yekuteli eljárással korrigálva többszörös tesztelésre). A “B-sejtek” P-értékei a B-sejtekre vonatkoznak, szemben az összes BCP-összes mintával (Mann Whitney U-teszt, csak a bemutatott jelentős értékek). (b) a circAFF3 és a circPAX5 funkcióinak és kölcsönhatásainak előrejelzése, beleértve a miRNS-kötő helyek előrejelzését, az RNS-kötő fehérjék (RB) és a legalább 150 nt-os nyitott olvasókeretek (ORF-ek) által esetleg felismert szekvenciamotívumokat a hátlapra kiterjedően.

továbbá feltártuk a circrns-ek célcsoportjának expresszióját a fő BCP – minden citogenetikai altípusban (ábra. 3a). A citogenetikai altípusokat specifikus genetikai elváltozások jellemzik, beleértve a visszatérő transzlokációkat (MLL átrendeződések, BCR/ABL, ETV6-RUNX1 és TCF3-PBX1 fúziók) és a hiperdiploid kariotípust. A citogenetikai altípus jellemzése fontos szerepet játszik a leukémiás betegek kockázati prognózisában és kezelési rétegződésében. A különböző altípusú leukémiás sejtek eltérő biológiai jellemzőkkel, génexpressziós profilokkal és specifikus miRNS jelekkel rendelkeznek44,45. Ebben az összefüggésben új információkat adtak az akut leukémiák heterogén természetéről a megfigyelt szignifikáns circrns expressziós különbségek a citogenetikai altípusok között (ábra. 3a). A CircAFF2 erősen expresszálódott a TCF3-PBX1 BCP-ALL-ben és kisebb mértékben az ETV6-RUNX1 BCP-ALL-ben, összehasonlítva a B-sejtekkel és más citogenetikai BCP-ALL alcsoportokkal. A CircBCL2 (intronic)etv6-RUNX1 fúziókkal volt szabályozva. A circetbp1 és a circX(intergenikus) egyaránt nagyon csökkent az MLL átrendezett mintákban. A CircIKZF1 alacsonyabb volt a BCR-ABL-ben és a hyperdiploid leukémiákban, mint az ETV6-RUNX1 altípusban, ahol az expresszió a B-sejtekhez hasonló szinten konzerválódott.