Cistron

PTX Biogenezise

az öt PTX alegységet összefüggő cistronok kódolják egyetlen policisztonikus operonon belül , amelynek kifejezését a BvgA/S rendszer szabályozza. Ezen a kétkomponensű rendszeren keresztül a toxintermelés modulálható MgSO4 vagy nikotinsav jelenlétével, vagy alacsony hőmérsékleten történő növekedés során (áttekintéshez lásd ). A BvgS egy belső membránon átívelő fehérje, amely több kináz aktivitást expresszál. Aktív állapotban foszforilezéssel aktiválja a BvgA-t. A foszforilált bvga, egy citoplazmatikus transzkripciós szabályozó, ezután kötődik a PTX gén promoter régió operátor helyeihez, ahol kölcsönhatásba lép az RNS polimerázzal és aktiválja a transzkripciót. Bár a bvgs jelzését zavaró modulátorokat azonosítottak, a jelzés kiváltásához szükséges BvgS ligandum nem ismert, ami arra utal, hogy a BvgS alapértelmezés szerint aktiválódik .

a transzkripció után az egyes alegységeket hasítható szignálpeptideket tartalmazó preproteinekként állítják elő. A belső membránon keresztüli transzlokáció után (valószínűleg egy Sec-függő útvonalon keresztül) a szignálpeptideket eltávolítják. Bár a szignálpeptidek a leader peptidáz I szubsztrátjainak tipikus jellemzőit mutatják, az Escherichia coli leader peptidáz I általi hasításuk nagyon hatástalan. A B. pertussis lep gén koexpressziója E. coliban jelentősen növeli a PTX alegységek érését . A periplazmikus térben intra-alegység diszulfid kötések képződnek, majd a holotoxint a külső membránon keresztüli szekréció előtt összeállítják. A PTX összesen 11 alegységen belüli diszulfidkötést tartalmaz, egyet S1-ben, kettőt S4-ben és S5-ben, és hármat S2-ben és S3-ban . A PTX-ben jelen lévő összes cisztein részt vesz a láncon belüli diszulfidkötésekben . A diszulfidképződés fontos a toxin biogenezisében, mivel bármelyik cisztein megváltozása az S-ben1 megakadályozza, hogy ez az alegység összeálljon a B oligomerrel . A megfelelő diszulfidképződés a DSBA/DsbC rendszeren alapul, amely a PTX összeszereléséhez és szekréciójához elengedhetetlennek bizonyult . Azonban a dsbc mutációi, amelyek a három diszulfid izomeráz egyikét kódolják, nyilvánvalóan nincs hatással a toxin összeszerelésére, bár rontják annak szekrécióját, ami arra utal, hogy a DsbC egy olyan komponensre hat, amely kifejezetten a PTX szekrécióhoz szükséges.

a PTX biológiai aktivitásához nincs szükség szekrécióra, de a holotoxin teljes összeszerelése fontos a hatékony szekrécióhoz, mivel a csak S1 vagy csak a B oligomer termelésére tervezett törzsek szekréciós hibát mutatnak . Egy teljesen működőképes B oligomer azonban S1 hiányában bizonyos fokig szekretálható, ami azt jelzi, hogy az S1 jelenléte nem abszolút követelmény A B oligomer szekrécióhoz. Ezzel szemben az S1 önmagában nem szekretálható A B oligomer hiányában, ami arra utal, hogy a szekréciót meghatározó tényezők a B oligomeren belül helyezkednek el, bár az S1 jelenléte minden bizonnyal fokozhatja a szekréció hatékonyságát. Az S1 gén bizonyos mutációi erősen káros hatással vannak a szekrécióra, különösen az Arg-57 környékén, ami arra utal, hogy az S1 ezen régiója szerepet játszik a PTX szekréciójában. A B oligomer hiányában az S1 valószínűleg a külső membránra oszlik, talán annak C-terminális, hidrofób doménjén keresztül. Ez lehet A B oligomerrel való összeszerelés helye a külső membránon keresztüli szekréció előtt .

a holotoxin-összeállítás molekuláris lépései még mindig kevéssé ismertek. A mutáns törzsek egyes alegységei, amelyek nem termelik a többi alegységet, gyorsan lebomlanak. Úgy tűnik, hogy az alegységek bizonyos kombinációi kölcsönösen stabilizálják egymást . Például az S2 alegység stabilitását nagymértékben növeli az S4 jelenléte és fordítva, ami összhangban van a holotoxin kristályszerkezete által feltárt S2–S4 dimerképződéssel. Az is lehetséges, hogy az S2–S4 dimer részegységei az S1 alegységgel S3 és S5 hiányában jönnek létre. Az S2-S4 dimer nem bizonyult szekretált B. pertussis, míg az S1 hozzáadása ehhez a dimerhez bizonyos szintű szekréciót eredményezhet.

a PTX transzportja a B. pertussis külső membránján keresztül egy IV-es típusú szekréciós rendszerre (T4SS) támaszkodik, amely kilenc különböző fehérjéből áll, ptla-n keresztül PtlI . Ezek a fehérjék homológ t4sss más baktériumok, köztük Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, és Rickettsia prowasekii . A ptl gének közvetlenül az öt strukturális PTX gén után helyezkednek el, és a ptx promoter irányítása alatt állnak . Úgy tűnik azonban, hogy a Ptl fehérjék alacsonyabb szinten termelődnek, mint a PTX alegységek, amit a phoA gén különböző ptx és ptl génekkel való transzlációs fúziója bizonyít . Bizonyos Ptl fehérjék termelése korlátozó lépésnek tűnik a PTX szekréciójában. Az exponenciális növekedés során a baktériumok becslések szerint három toxinmolekulát/perc/ baktériumsejtet választanak ki, és azt találták, hogy az alegységek felhalmozódnak a periplazmikus térben, mind egyedi alegységekként, mind holotoxinokká. Az alegység felhalmozódása az exponenciális növekedés során történik, annak ellenére, hogy bizonyos Ptl fehérjék szintje sejtenként 30-1000 molekulára nő. Így a toxintermelés vagy összeszerelés helyett a szekréció lehet sebességkorlátozó. Kíváncsi, hogy a Ptl fehérjék hiányában egyes alegység–kombinációk, például az S2-S4 dimer S1 jelenlétében szekretálhatók, bár a holotoxin szekréciója erősen függ a Ptl fehérjék jelenlététől.

úgy gondolják , hogy a Ptl fehérjék egy komplexet alkotnak, amely mind a belső, mind a külső membránon átível, és úgy tűnik, hogy mindegyik (legalább PtlA-H) szükséges a toxin szekrécióhoz, amint azt az egyes ptl gének mutációi vizsgálják . A transzban a vad típusú ptl + törzsekbe bevezetett mutációk egy része domináns negatív szekréciós fenotípust eredményezett, megerősítve, hogy legalább a PtlC-PtlH egy multimer komplex része. A PTX szekréció kulcsfontosságú lépése nyilvánvalóan a peptidoglikán réteg átjutásának képessége, és a PtlE kimutatták, hogy expresszálja a peptidogykanáz aktivitást . Ez a 276 maradékhosszú fehérje aktív lokális hasonlóságot mutat más glikohidrolázokkal, és az ezen a helyen található alanin szubsztitúciók kimutatták, hogy nagymértékben csökkentik a rekombináns PtlE peptidoglikanáz aktivitását. Ugyanezek a szubsztitúciók a természetes PtlE-ben is megszüntetik a ptx szekrécióját B. pertussis, határozottan arra utal, hogy a PtlE az a peptidoglikanáz szükséges ahhoz, hogy a toxin átjusson a peptidoglikán rétegen.

a PTX szekréció valószínűleg energiát is igényel. A Ptl fehérjék közül kettő, a PtlC és a PtlH feltételezett adenozin–trifoszfát (ATP) kötő helyeket tartalmaz, és így biztosíthatja a toxin szekrécióhoz szükséges energiát. Kimutatták, hogy mindkét fehérje szükséges a szekrécióhoz, és mindkét esetben a feltételezett ATP-kötő helyek elengedhetetlenek a működéshez. Mindkettő esetében domináns negatív fenotípus figyelhető meg, amikor a mutáns allélokat a vad típusú alléllel együtt fejezik ki, ami arra utal, hogy mindkettő multimerként működik, vagy a szekréciós komplex részét képezi. Kimutatták, hogy a PtlH kapcsolatban áll a belső membránnal, és a PtlH ATP-kötő helyének mutációi befolyásolják annak sejthelyét, és megszüntetik a kölcsönhatását más Ptl fehérjékkel . A PtlC pontos szerepe még nem ismert. A PtlD egy belső membránfehérje is, amely öt transzmembrán domént tartalmaz. Ez szükséges a PtlE, PtlF és PtlH stabilitásához a C-terminális 72 maradékokon keresztül. Ez a C-terminális régió azonban nem elegendő a toxin szekréciójához . A PtlF a külső membránfehérjék (OMP) jellemzőit mutatja, de társulhat a belső membránhoz is. Nem redukáló körülmények között a PtlF és a PtlI komplexként vándorol a nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis során, ami azt jelzi, hogy a PtlI diszulfidkötés útján kötődik a PtlF-hez . A PtlI és a PtlF közötti megfelelő diszulfidkötés a DsbC-től függhet, mivel a dsbc gén mutációi befolyásolják a szekréciót anélkül, hogy befolyásolnák a toxin összeállítását .