Clostridium chauvoei kimutatása és azonosítása PCR-rel Clostridium chauvoei kimutatása és azonosítása klinikai izolátumokban, szarvasmarha-ürülékben és biogázüzem szubsztrátjaiban

minták feketeláb gyanús eseteiből

a feketeláb gyanús eseteiből származó izomminták esetében az FAA lemezeken végzett tenyésztés eredményei, majd a kolónia anyagából származó PCR egyetértettek, vagy még jobban teljesítettek, mint a biokémiai azonosítási módszer (2.táblázat). Ezek az eredmények összhangban vannak Uzal et al. . Ez a tanulmány kimutatta, hogy a PCR előtti tenyészetből származó DNS-előkészítés jobb eredményeket adott, mint a közvetlenül a biomasszára alkalmazott PCR.

a biokémiai azonosítási módszereket követő tenyésztés bonyolult a magas szennyezőanyag-tartalmú mintákban, mivel tiszta tenyésztésre van szükség, és az érzékenység lényegesen alacsonyabb volt, mint a tenyésztés és a PCR esetében. Nyolc esetben lehetetlen volt kimutatni a C. chauvoei-t tenyésztéssel és biokémiai azonosítással, de a szervezetet PCR-rel detektálták (2.táblázat). A fekete láb diagnosztizálásához az izomszövetet boncoláskor veszik, mivel a C. chauvoei mennyisége valószínűleg magasabb az izomszövetben, mint a vérben. Az egyetlen vérmintát helytelenül vették, de a kérdés fekete volt.

Hasonlóképpen, a feketeláb kitörésének korábbi vizsgálatában a tenyésztés és a PCR-rel történő kimutatás jobb eredményeket adott, mint a biokémiai elemzés . Az egyik esetben az egyik izom elsődleges tenyészetét a vér agarlemezen benőtte a C. septicum, de egyértelmű pozitív eredményeket adott a C. chauvoei számára a PCR-ben.

a feketeláb legtöbb klinikai esetben a C mennyisége. a fertőzött szövetekben a chauvoei magas, és PCR módszerrel könnyen kimutatható, függetlenül a szennyező növényektől. Ezenkívül a PCR módszer sokkal gyorsabb, mint a hagyományos biokémiai kimutatási módszer, amely legalább öt napot vesz igénybe, és fontos, hogy a törzs tiszta tenyészete legyen, ami hosszabb időt igényelhet a tenyésztéshez. A növényvilág szennyeződésének elkerülése érdekében az izomszövet nem lehet túl kicsi; körülbelül 100-200 g lenne megfelelő. Tiszta tenyészet nélkül a jövőben nem lehet törzs a későbbi vizsgálatokhoz, ami hátránya, hogy a PCR kimutatást egyedüli módszerként alkalmazzák.

C. chauvoei-vel kísérletileg fertőzött szarvasmarhákban PCR-analízist végeztek darált izomzaton és más szerveken, és a C. chauvoei-t minden vizsgált szervben kimutatták . A feketeláb feltételezett eseteiből származó darált izomdarabokat közvetlenül PCR-rel tesztelték, és összehasonlították a tenyésztéssel. A PCR-rel történő kimutatás jobb eredményeket adott , mint a tenyésztés és a biokémiai azonosítás, ami nem ért egyet a jelen vizsgálat eredményeivel, ahol a vér-vagy izomdarabok mindössze 12% – a (3 a 24-ből) meghaladta a PCR kimutatási küszöbét, míg a húslé minták 9% – a meghaladta a kimutatási küszöböt (2.táblázat). Gátló anyagok valószínűleg jelen vannak az izomszövetekben. A PCR-amplifikáció enzimatikus reakciójának inhibitorait azonosították a májban, a lépben és a vesében, és hasonló inhibitorok lehetnek jelen az izomszövetben is. A steril fiziológiás sóoldatban macerált izomdarabok eredményei (26%) nem feleltek meg jól a biokémiai teszt eredményeinek. Az izomszöveten vagy más hasonló mintákon végzett közvetlen PCR valószínűleg nem alkalmas a tenyésztési lépések helyettesítésére, amelyet biokémiai vizsgálatok vagy PCR követ.

tamponokkal gyűjtött Izomminták

annak megvizsgálására, hogy szükséges-e izomszövetet küldeni a C. chauvoei elemzésére, vagy elegendő-e tamponokat használni a mintagyűjtéshez, postai szolgáltatást szimuláltak. A vizsgált 22 izomszövet közül 64% meghaladta a PCR kimutatási küszöbét. Az azonos mintákból származó tamponok esetében a postai szolgáltatás szimulációját követően a tamponok 36-47% – a meghaladta a kimutatási küszöbértéket (3.táblázat). Praktikusabb lenne az izomszövetek helyett tamponokkal mintát venni, ha a tamponok elegendőek a C. chauvoei elemzéséhez. Az izomszövetek azonban több pozitív mintát adtak, mint a tamponok, amikor mindkettőt tenyésztéssel és PCR-rel elemezték (3.táblázat). A C. chauvoei előfordulása a pozitív izomszövet-esetek tamponjain véletlenszerűnek tűnt. Úgy tűnt azonban, hogy alig vagy egyáltalán nem számít, hogy a tamponokat 1, 3 vagy 6 napig tárolták-e.

Biogázüzemekből származó minták

a Clostridium chauvoei-T 3 mintából 11 biogáz szubsztrátumban mutatták ki pasztőrözés előtt, de pasztőrözés vagy emésztés után nem lehetett kimutatni (4.táblázat). Az ilyen típusú mintákban található baktériumok származhatnak trágyából vagy a vágóhídról származó állati melléktermékekből, mivel mindkét forrást biogáz előállítására használják. A tanulmányban mintavételezett gazdaságok egyike sem küldi trágyáját a biogázüzemekbe a földrajzi távolság miatt, de az állatokat a helyi vágóhídra küldik. Feketelábas eseteket jelentettek a biogázüzem vízgyűjtő területén is.

a biogáz feldolgozása után az emésztett maradványokat műtrágyaként használják fel. A spóraképző baktériumok túlélhetik a pasztőrözést és az emésztést a biogázüzemekben, ezért a biogázüzemekből származó emésztett maradványok képesek lehetnek a feketeláb új területekre történő elterjesztésére. Azonban nem C. a chauvoei-t a feldolgozott termékben detektálták, így talán az emésztő környezete nem alkalmas a C. chauvoei számára, vagy az emésztő növényvilága kinövi a C. chauvoei-t. A klostridialis spórák hosszú ideig fennmaradhatnak a talajban, amelyet figyelembe kell venni a C. chauvoei emésztőben végzett további tanulmányaiban.

gazdaságokból származó minták

annak ellenére, hogy az elmúlt években valamennyi vizsgált gazdaság feketeláb gyanújáról számolt be, a székletből, a talajból és a szilázsból származó minták C. chauvoei-ra negatívnak bizonyultak. Ennek több magyarázata lehet. A spórák továbbra is jelen lehetnek az anyagban, de a kimutatási szint alatt. Ezenkívül PCR inhibitorok lehetnek jelen a mintákban, és a PCR gátolható . A szarvasmarhák ürüléke Illékony zsírsavakat (VFA) tartalmaz, a talajminták pedig fémnyomokat tartalmazhatnak, amelyekről ismert, hogy mindkettő befolyásolja a PCR-reakciót. A PCR előtti tenyésztési lépés azonban csökkenti a gátló anyagok hatását.

C Óta. a chauvoei talajbaktérium néhány szezonális változás előfordulhat, például a heves esőzések hozzájárulhatnak a spórák terjedéséhez, és a talajban lévő spórák mennyisége könnyebben elérhető lehet a szarvasmarhák számára. A legtöbb mintavételt kora ősszel végezték, amikor napos volt az idő, így a mintákban a spórák koncentrációja várhatóan alacsony lesz. Lehetséges, hogy a Minták száma nem volt elegendő a környezetszennyezés kimutatásához. Gyakorlati okokból azonban nagyon sok környezeti minta ritkán áll rendelkezésre a terepről.

a feketeláb gyanús esetei a gazdaságokban elsősorban borjaknál és üszőknél fordultak elő, de egy gazdaság egy kifejlett tehén esetéről számolt be. A tizenegy a-K gazdaság közül hétnél a mintavétel idején oltási rutin volt érvényben (1.táblázat).

a gazdaságok közül kettő trágyát tárolt a szétterítés előtt, a többiek pedig nem, de egyik gazdaság sem terjesztett trágyát legelőn. A helyi állatorvosok a jelentések szerint több feketelábas esetet láttak a cserjések tisztítását követően a szigeten, különösen Alvaret-en (egy kopár mészkő síkság, közel 40 km hosszú és 10 km széles, különleges növényvilággal a vékony talajtól és a magas pH-értéktől függően). Alvaret általában használják legelő a szomszédos gazdaságok. A mintavétel évében nem sok cserjés tisztítást végeztek.

PCR

a kulturális eljárások drágák és időigényesek, és a C. chauvoei-t kinövő egyéb anaerob baktériumokkal való szennyeződés gyakran problémákat okoz . PCR alkalmazása esetén mind az életképes, mind a nem életképes sejtek DNS-ét amplifikálják. Ha csak életképes sejteket kell kimutatni, dúsítási lépés alkalmazható . Ebben a vizsgálatban a PCR előtti FAA-lemezeken tenyésztést alkalmaztak a nem életképes baktériumok és a hamis pozitív PCR-reakciók kimutatásának elkerülésére. A DNS-t tiszta kultúrákból könnyű amplifikálni, de problémák merülnek fel a szennyezett mintákkal, például a biohulladékból származó mintákkal. A DNS PCR-rel történő kimutatását számos anyag akadályozhatja, beleértve a huminsavakat, a VFA-t, a zsírokat és a fehérjéket . A PCR előtti tenyésztési lépést azonban dúsítási lépésként alkalmaztuk, ezért csökkenti a gátló anyagok hatását. A nyüzsgő Növényvilág miatt nem lehetett megtisztítani az FAA lemezeket.

a PCR-módszer kimutatási küszöbértéke

a kimutatási szint 200 cfu/g volt. ez a kimutatási szint alacsonynak tűnhet, de azzal magyarázható, hogy az olyan mintákat, mint a trágya, a talaj és a biogáz szubsztrát, erősen szennyezi a környező Növényvilág. Sasaki 10 cfu/g kimutatási szintet jelentett, nyilvánvalóan tisztább mintákban. Mivel azonban a kimutatási szint a vizsgálatunkban 200 cfu / g volt, és mivel az ilyen minták várhatóan alacsony számú C. chauvoei-t tartalmaztak. Így a jelen tanulmányban alkalmazott módszer gyakorlatilag nem alkalmazható.

környezeti tényezők

a PCR – módszer kimutatási küszöbértéke az előkultúra után jelenleg aligha alkalmas az állatok fertőzésmentességének biztosítására vagy a legelők állapotának meghatározására. Ehelyett a jelenleg alkalmazott ajánlásokat kell alkalmazni, mivel a módszer nem használható az oltási rutinok alapjául. Azokon a területeken, ahol a feketeláb endémiás, a legeltetés előtti éves vakcinázás ajánlott, a költségek és a szükséges idő ellenére.

ez a tanulmány arra utal, hogy a C. chauvoei nem halad át a biogáz-folyamaton. A biohulladékban lévő C. chauvoei száma az emésztőben a módszer kimutatási küszöbértéke alá csökkent, így az emésztett maradványok elterjedésének kockázata elhanyagolható. További tanulmányokra van szükség a biogáz-folyamaton keresztüli klostridialis túlélésről, mielőtt határozott következtetéseket lehet levonni. A megemésztett maradványok műtrágyaként való alkalmazásának előnyei azonban talán meghaladják a feketeláb elterjedésének kockázatát.