gyulladás és fertőzés diagnosztizálása a húgyutakban proteomics segítségével

Mintaforrások a vizelet proteomikai adatainak vizeletdiagnosztikai célú értékeléséhez

az ebben a vizsgálatban profilozott 120 vizeletminta gyűjtése nem korlátozódott egy adott betegség diagnosztizálására, progressziójának értékelésére vagy kezelésére. A minták vizeletvizsgálatát (UA) a kezelőorvosok különféle okokból rendelték el, beleértve az akut sérülést, hüvelyi vérzést, szédülést/hányingert, hiperlipidémiát, II.típusú cukorbetegséget és kapcsolódó szövődményeket, hasi fájdalmat/hányingert, meghatározatlan magas vérnyomást, hólyag magas vérnyomást, idiopátiás poliuriát és feltételezett UTI-t. Mivel az UTI egy nagyon elterjedt fertőző betegség, amely a fent említett klinikai tünetek (pl. hasi fájdalom/hányinger) és kockázati tényezők (pl. cukorbetegség), ezekből a mintákból a bakteriuria vagy UTI gyakori diagnózisát vártuk. A proteomikus elemzések olyan mintákra korlátozódtak, ahol a vizeletvizsgálati jelentések kísérleti támogatást nyújtottak a bakteriálisan okozott UTI-k számára (lásd módszerek). Nem elemeztük a vizeletmintákat olyan esetekben, amikor a tünetmentes bakteriuria specifikus diagnózisa rendelkezésre állt. Kiterjedt UA-adatokat kaptunk mind a 120 mintára. Ez magában foglalta a mérőpálcás teszteket, a vizelet üledékeinek mikroszkópos vizsgálatát különböző sejttípusok és nyálkák esetében, valamint – az esetek 46% – ában-vizeletkultúra (UC) adatokat. A vizelet megjelenésére vonatkozó adatokat, például a zavarosságot, a színt és a vizelet pellet színét és térfogatát is felülvizsgálták. A vizeletvizsgálat eredményei lehetővé tették a húgyúti betegségek diagnosztizálására szolgáló hagyományos módszerek átfogó összehasonlítását metaproteomikus felmérések adataival (3.Kiegészítő fájl: A3. táblázat).

a neutrofilek, a veleszületett immunválaszok domináns effektorai a húgyutakban, sok mintában felelősek a gyulladás magas szintjéért

a Proteomikus adatok erős bizonyítékot szolgáltattak a neutrofilek fontos szerepére, mint a húgyúti gyulladás effektorai és hírvivői. A neutrofilek antimikrobiális és gyulladásos molekulákat bocsátanak ki az általuk termelt szekréciós granulátumokból, és fagocitózisuk után elpusztítják a fagolizoszómákban lévő betolakodó kórokozókat. A minta levélrendezésére optimalizált hierarchikus klaszterelemzés (HCLSO) négy olyan mintacsoportot azonosított, amelyekben a neutrofilek domináltak az emberi fehérje abundancia profiljában (23 eset 111 esetből; NAD1 klaszterek az 1.ábrán), valamint két olyan klasztert, amelyekben a neutrofil-specifikus fehérje mennyisége összehasonlítható a citoszkeletonnal (25 eset; NAD2 klaszterek az 1. ábrán). A citoszkeletális fehérjék erősen expresszálódnak az urogenitális traktust bélelő hámsejtekben, és a húgyúti patofiziológiai állapotok hiányában a vizelet üledék proteomjának többségét alkotják. A 48 nad klaszterprofil közül harmincöt pozitív volt egy uropatogén IDs szempontjából, beleértve a G. vaginalist is, jelezve azt a tényt, hogy a gyulladás domináns oka az adott betegeknél a bakteriuria és a behatoló mikrobákkal szembeni immunválasz volt. A kapcsolódási fa nad-klaszterei közötti távolság oka az azonosított humán fehérjék számának jelentős változása volt, mintánként 200-1500 Id között.

a vizelet pellet proteomikus profiljainak hierarchikus csoportosításának elemzése 110 mintához. Hierarchikus klaszterezést végeztünk kvantitatív humán fehérje adatkészleteken a TPA módszer alkalmazásával a MaxQuant szoftverben. Az adatkészleteket Pearson korrelációs elemzésnek vetettük alá a minta levélrendezés optimalizálásával és a teljes összekapcsolási klaszterezéssel a MeV szoftvereszköz segítségével . Eltávolítottuk a fehérje bőség hőtérképét az UP minták megjelenített hierarchikus fájáról. A bal oldali panel alja a jobb oldali panel tetejéhez csatlakozik, mivel a fa összeköttetésekre vonatkozik. A minta klaszterneveket, amelyeket a grafika jobb szélén mutatnak rövidítéseikkel, a szöveg részletesen tárgyalja. A színes sávok jelzik az egyes mintafürtök típusát, méretét és helyzetét a fában.

a proteomikus adatokból származó neutrofil fehérje abundanciák jól korrelálnak a LE aktivitással és a leukocita számmal

a vizsgálat egyik fő motivációja annak meghatározása volt, hogy a vizelet üledékéből származó proteomikus adatok a vizeletminták gyulladásának szintjének számszerűsítésére szolgáló hagyományos vizsgálatokhoz képest. Meghatároztuk az aktivált neutrofilekben ismerten erősen expresszált 35 fehérje mennyiségét (kiegészítő Fájl 2: A2 táblázat) az összes fehérje bőségéhez viszonyítva minden egyes UP minta esetében, amint azt a diagram kék sávszegmensei mutatják a 2.ábrán. Nem váratlanul, a fent említett NAD1 klaszterekhez tartozó esetek 85% – a A grafikon 30% – nál nagyobb neutrofil fehérjetartalmú szakaszában volt (a bal oldalon). A 35 fehérje öt funkcionális csoportot tartalmazott: a kalciumkötő S100 család fehérjéit, az S100-A8, az S100-A9 és az S100-A12, amelyek a neutrofilek összes citoszolos fehérjetartalmának 40-50%-át adják; a gyulladás során neutrofil granulátumokból felszabaduló fehérjék, beleértve a mieloperoxidázt (MPO), katepszin G-t (CTSG), defenzin-1-et (DEFA1), elasztázt (elán), lizoszómát (LYZ), laktotranszferrint (LTF) és katelicidint (CAMP) ; a granulátumok fagolizoszómákkal való képződésében, kereskedelmében és fúziójában szerepet játszó fehérjék, beleértve a grancalcin-t (GCA), a plasztin-2-t (LCP1), az annexin A3-at (ANXA3), valamint tetraspanin (cd63 antigén); a neutrofil migrációt befolyásoló fehérjék egy REORGANIZÁLÓ extracelluláris mátrix környezetében, mint például az integrin am/62, a zselatináz (MMP9) és a neutrofil kollagenáz (mmp8); és NADPH-oxidáz, egy enzim, amely több alegységgel rendelkezik, beleértve a citokróm b-245-et (CYBA, 3.ábra), amely a fagocita sejtek fagolizoszómáinak membránjában helyezkedik el, és felelős az oxidatív burstért, amely közvetlenül megöli a kórokozókat. Ezen fehérjék közül sok, különösen a defenzin-1, nagy mennyiségben volt jelen az UTI-kre utaló mintákban (pl. SA_112 és PM_20, 3.ábra). A két esetben a bakteriális patogének a S. aureus (SA) és a P. mirabilis (PM) voltak, és nem váratlanul a 2.ábra ábrájának bal oldalán, egy NAD1 klaszterben egymás mellett helyezkedtek el (1. ábra). Elismerjük, hogy ezek az adatok a neutrofilek hozzávetőleges mennyiségét tükrözik, figyelembe véve azt a tényt, hogy az olyan fehérjék, mint a defenzin-1, LTF, S100-A8 és S100-A9, az urothelialis sejtek is felszabadulnak a húgyutakba. A fehérje levélrendezésre optimalizált hierarchikus csoportosítási elemzés (HCLPO) azonban azt mutatta, hogy ezek a fehérjék csoportosultak egymással, támogatva a neutrofilek domináns szerepének fogalmát a termelésükben (további Fájl 4: A1 ábra). Az eozinofil peroxidáz (EPX) és az eozinofil kationos fehérje (ECP), amelyek szintén a patogénekre adott válaszreakciót fejtik ki, nagyságrenddel kevésbé voltak bőségesek, mint a neutrofil eredetű fehérjék, így nem támogatták az eozinofilek fő szerepét a gyulladásos válaszban. A makrofág-specifikus migrációt gátló faktor (MIF) még alacsonyabb mennyiségben volt jelen, ami arra utal, hogy a makrofágok szinte hiányoznak az akut immunválasz résztvevői a kórokozó invázióját követően a húgyutakban.

fehérje profilok, amelyek a neutrofilek, a komplementrendszer és az eritrociták mennyiségi hozzájárulását mutatják a vizeletből vett pellet minták teljes proteomjához. A grafikon három biológiai fehérjekategória összesített fehérjebundanciáját mutatja a teljes proteomhoz viszonyítva. Az x tengely felsorolja a 110 emberi alanyhoz kapcsolódó UP minták azonosítóit. A három kategória az aktivált neutrofilek által termelt fehérjéket (kék), az eritrocitákban erősen expresszált és érrendszeri sérülés esetén felszabaduló fehérjéket (zöld), valamint a komplementrendszer aktivitásához és koagulációjához kapcsolódó fehérjéket (piros) képviseli. Az összes fehérje mennyiségi meghatározására használt módszer az iBAQ módszer a MaxQuant szoftver eszközben. A minták sorrendje a neutrofil fehérje bőségén alapul, balról jobbra csökken. A gyulladás értékelésének közvetlen összehasonlításának lehetővé tétele érdekében a LE vizsgálat pontszámát az egyes sávok feletti ábra tartalmazza, amely egy mintát ábrázol. Az x tengely alatt egy további sáv ábrázolja, hogy mely mintákat társították az UTI-t okozó kórokozó azonosítójához (narancssárga színű szegmensek), kommensális baktériumok (zöld színű szegmensek) vagy a bakteriális IDs hiánya (nincs szín).

a kiválasztott neutrofil fehérjék bősége az UP mintákban. A jobb szélen a legendában felsorolt tizenhárom fehérje neutrofil granulátum fehérje. Három másik fehérje a fibrinogén-6 (FGB; koagulációban szerepet játszik), a hemoglobin-alegység (hba1; vaszkuláris sérülésre utaló jelek), valamint uromodulin (UMOD; egészséges donorok vizeletében bőséges). Az SA_112 és a PM_20 minták Az S. aureus (SA) és a P. mirabilis (PM) által okozott UTI-ket ábrázolták. Az LG_23 (Lactobacillus) profilja a gyulladás hiányát jelezte, és a húgycső kolonizációját, esetleg a vizeletminta kisebb hüvelyi szennyeződését is jelentette. Úgy tűnt, hogy a kp_10 (K. pneumoniae) hüvelyi fertőzést jelent, mivel a hüvelyi vérzést klinikailag diagnosztizálták a beteg számára. Az EC_13 (UPEC) és a KP_55 fehérjeprofiljai a gyulladás közeli hiányára utalnak, ezért valószínűleg húgycső kolonizáció. A fehérjéket az iBAQ módszerrel számszerűsítettük, minden esetben elosztva a teljes up proteom összesített iBAQ értékeivel.

NAD pontszám

a neutrofil fehérje mennyiségeknek a 2.ábra ábráján szereplő ábrázolása a NAD (neutrophil activation and degranulation) pontszámokból származik, amelyeket a (kiegészítő Fájl 3: A3 táblázat) is tartalmaz. A 2.ábra a negatív (N) – től a trace (T) – ig terjedő LE pontszámokat tartalmazza, 1, 2 és 3 minden minta esetében. Összességében erős korreláció figyelhető meg a neutrofil protein abundanciák és a LE pontszámok között. A LE pontszám a leukocita észteráz aktivitást méri, amely valószínűleg elsősorban az elasztázt (elán) és a mieloblasztint (PRTN3) képviseli, két neutrofil proteázt, amelyeket nyolc mintára számszerűsítettek a 3.ábrán. A grafikon bal oldalán található összes profil (2. ábra) és a 60, több mint 30%-os (iBAQ) neutrofil fehérjetartalmú minta közül ötvenhárom LE pontszáma 2 vagy 3 volt. A 40, kevesebb, mint 23% (iBAQ) neutrofil fehérjetartalmú minta közül huszonkilenc LE pontszáma negatívtól 1-ig terjedt. A tizenegy eset közül csak négyben, ahol a LE pontszám 2 volt, de a neutrofil fehérjetartalom viszonylag alacsony volt, a mikroszkopikus leukocita szám nagyobb volt, mint 11 sejt / nagy teljesítményű mező (HPF), a pyuria meghatározására használt küszöb. Összességében valamivel kevesebb egyetértés volt a leukocita szám összehasonlításában, amely a küszöbértéket 11 sejt/HPF-re állította, több mint 30% (iBAQ) neutrofil fehérjetartalommal: a 60 eset közül 14-nek volt száma 60 (további Fájl 3: Táblázat A3). Összefoglalva, a vizelet üledékeinek neutrofil tartalmának proteomikával történő értékelése legalább olyan pontosnak tűnik, mint a húgyúti gyulladás diagnosztizálására szolgáló le-vizsgálat. 35 neutrofilben dúsított fehérje abundanciájának összegét méri, és kevésbé érzékeny lehet a hamis pozitív eredményekre, mint a LE vizsgálat.

az eritrocita fehérjetartalom bősége a vaszkuláris sérülés diagnosztikai indikátoraként szolgál

a húgyúti vaszkuláris sérülést, amely jellemzően gyulladással jár, a hemoglobin mérőpálcával és a vörösvértestek mikroszkópos számlálásával értékelik a hagyományos vizeletvizsgálat során. Figyelembe véve a különböző fehérjék magas dúsulását az eritrocitákban, képesek voltunk kidolgozni a hagyományos hematuria tesztekkel egyenértékű proteomikus megközelítést. 32 vörösvérsejt-fehérje, köztük a hemoglobin alegységek, a 3-as sáv anion transzportfehérje, a 7-es sáv Integrált membránfehérje és a szén-anhidráz-1 összesített bőségét határoztuk meg az egyes UP-minták teljes fehérjetartalmához viszonyítva, a 2. ábrán látható zöld sávszegmensek mutatják. Ezek a fehérjemennyiségek ERY pontszámként vannak felsorolva (kiegészítő Fájl 3: A3 táblázat) minden mintához. Nem volt bizonyíték arra, hogy a NAD-pontszámok vagy a Le-vizsgálati eredmények jó korrelációt mutattak volna az ERY-pontszámokkal, ami arra utal, hogy még a kórokozó kimutatása esetén is (a 2.ábrán látható vízszintes sáv színezése mutatja), a húgyúti neutrofil infiltráció nem mindig jár jelentős hematuriával és szöveti sérüléssel. A hematuria küszöbértékének meghatározása a mérőpálca-tesztnél 2+, az ERY-pontszámnál pedig 4,5% volt, az esetek 81% – ában egyetértés volt. A 21 esetben, amikor a pontszámok nem értettek egyet, mikroszkopikus vörösvérsejtszámot értékeltek. A hematuria bizonyítékaként 10-nél nagyobb sejt / nagy teljesítményű mező (HPF) szám felhasználásával megállapítottuk, hogy az esetek kétharmadában a mikroszkópos elemzés egyetértett a proteomikus adatokkal. Arra a következtetésre jutunk, hogy a proteomikus ERY pontszámok jó kvantitatív becslést adnak a hematuria a vizeletben.

a komplement aktivitásban és koagulációban szerepet játszó fehérjékben dúsított vizeletminták

megfigyeltük, hogy a HCLPO analízis minden vizeletproteomikus profilra 21 fehérjét csoportosított, amelyek funkcionális szerepet játszanak a koagulációs útvonalakban és/vagy a komplement rendszerben (további Fájl 4: A1.Ábra). Az ezekre a gyulladásos utakra vonatkozó fehérje abundancia mérésének indoklása szintén kiterjedt funkcionális kölcsönhatásokról szóló jelentéseken alapult . 42 olyan fehérjét azonosítottunk, amelyek a komplement rendszer aktivitásához és koagulációjához (CAC) kapcsolódnak, amelyek összesített abundanciáját minden egyes UP minta CAC-pontszáma tartalmazza (kiegészítő Fájl 3: A3 táblázat). A komplement rendszer hozzájárul az akut fázis válaszhoz és a veleszületett immunitáshoz, és a különálló komponensek pro – vagy gyulladáscsökkentők. A központi komponens a C3 KOMPLEMENT komponens. A C3 az opsonin C3b-be és az anafilatoxin C3a-ba érlelődik, és a vese tubuláris sejtjeiben történő termelődést követően kiválasztódik a vérplazmába és a húgyutakba . A C3 szerepet játszik a felső húgyúti fertőzésben, valamint az upec felvételében és nyugalmában az uroepithelialis sejtekben, ami valószínűleg összefügg a visszatérő UTI-k klinikai problémájával . Annak ellenére, hogy a komplementaktivitáshoz és a koagulációhoz kapcsolódó fehérjék mennyisége nem volt olyan magas neutrofil fehérjék, a HCLSO analízis két mintacsoportot hozott létre, amelyek a fában szomszédosak, összesen 12 mintával, az ilyen fehérjék viszonylag nagy bőségével jellemezve (a CAC klaszterek az 1.ábrán). A CAC klaszterek alacsony számú esetet tártak fel egy kórokozó azonosítójával (3/12). A CAC pontszámokat a 2.ábrán ábrázoltuk, amelyet az egyes minták (oszlopok) piros sávszegmensei ábrázoltak. A CAC-fehérjék nagy összmennyisége nem korrelált jól a neutrophil-fehérjék nagy mennyiségével, ami arra utal, hogy a komplementrendszer (pl. C3 és C4) és a koaguláció (pl. fibrinogén) által közvetített gyulladásos aktivitás külön szabályozható a kórokozó inváziója vagy más, a húgyutakat érintő stressz hatására a betegeknél. A magas CAC és ERY fehérjemennyiségek gyakrabban fordultak elő párhuzamosan. Sok koagulációs és komplementfehérje valóban bőséges a vérplazmában. Ez a testfolyadék vaszkuláris sérülés esetén a húgyúti lumenbe szivárog. A CAC pontszámok mérésével egyenértékű vizeletvizsgálati teszteket ritkán alkalmazzák a klinikai laboratóriumokban.

a húgysavsók és a kapcsolódó vizelet üledék proteomikus profiljainak kicsapódása

a CAC klaszterekben lévő 12 UP minta szemrevételezéssel végzett vizsgálata azt mutatta, hogy kilenc vizeletminta erősen zavaros, és tíz vizeletpellets viszonylag nagy, rózsaszín-világosbarna színű. Ezek a jellemzők összefüggésbe hozhatók a húgysav magas telítettségi szintjével és a húgysav sók kicsapódásával, különösen 6 alatti pH-értéknél a vizeletben. A húgysav kicsapódása a húgyúti kőképződés prekurzor állapota lehet . Ésszerű feltételezni, hogy a minták zavaros megjelenése hozzájárult ahhoz, hogy a mikroszkópia során tévesen azonosítsák a csapadékot baktériumként. Csak egy klinikai adat állt rendelkezésre a vesekövek előfordulásáról (GV_64). Bár ennek a betegnek a proteomikus profilja nem volt része a CAC klaszternek, a minta vizuális jellemzői zavarosságot és rózsaszín-világosbarna vizelet pellet színt is jeleztek. Feltételezzük, hogy a vizelet oldható frakciójában viszonylag bőséges fehérjék kötődnek a só kicsapódásához, ezért hozzájárulnak a fehérje bőség mintázatának megkülönböztetéséhez a megfelelő UP mintákban. Valójában a vizeletben általában oldódó és a vizeletpelletekben általában alacsony abundanciájú fehérjék mennyisége nőtt néhány CAC klasztermintában az UTI és a só kicsapódásának bizonyítéka nélküli kontrollhoz képest (LG_21). Ilyen fehérjék például az IgG-lánc, az AMBP (bikunin) és a fibrinogén-lánc, amint azt a 4.ábra mutatja. A defenzin-1 fehérjék, valamint a hemoglobin HBA1 és HBD alegységei a legerőteljesebben növekedtek az LG_21 adataihoz képest. Bár a 4.ábrán látható fehérjék többségéről ismert, hogy a helyi károsodás következtében megemelkedett a vizeletben és a plazmában, és hozzájárulnak az akut fázis válaszhoz, ezek az adatok nagy mennyiségi variabilitást mutattak. Ezekből az adatokból nem lehet következtetni a kóros jelentőségre, különösen a húgyúti sérülésre. Proteomikus profilokat jelentettek a közelmúltban a vizeletkő mátrixról . A kőmátrixban leggyakrabban megfigyelt fehérjék közé tartoztak az IgG nehézláncok, a fibrinogén alegységek, az S100-A8, a lizozim C és az LTF fehérjék, amelyek szintén szerepelnek a 4.ábra ábráján. További vizsgálatokra van szükség a proteomikus elemzés értékének értékeléséhez a vizeletsót tartalmazó vizeletminták biomarkereinek azonosítására kicsapódik, pl. a vesekőképződés kockázatának felmérésére.

a kiválasztott fehérjék bősége a mintákban, amelyek bizonyítják a vizeletben a só kicsapódását. Az nm_-vel kezdődő UP minták (mikrobák nélkül) nem mutattak bakteriális kolonizációra utaló bizonyítékot, de a vizelet üledékeinek vizuális megjelenése húgysav-só kicsapódására utal, és két CAC-klaszterben voltak jelen. Az LG_21 (Lactobacillus) a gyulladás hiányát jelentette. A gv_64 mintához (G. vaginalis) társított beteget vesekővel diagnosztizálták. A 3. ábra jelmagyarázatában leírt fehérjék mellett a C3 KOMPLEMENT komponens (C3), a ceruloplasmin (CP), a plazminogén aktivátor inhibitor-3 (PAI-3), az AMBP (bikunin), a hemoglobin (HBD) alegység és az immunglobulin-lánc (ig gamma). Mindezek a fehérjék szerepet játszanak az akut fázisválaszban, amelyet általában a szövetkárosodás és a kórokozó invázió kezdeményez. A mintaprofilok a fehérjemennyiségek nagy variabilitását mutatják, bár egyes mintákban a különálló akut fázisú fehérjék növekedtek a kontroll LG_21-hez képest.

urethralis kolonizáció kommensális baktériumok által, amelyek nem váltanak ki gazdaszervezet immunválaszokat

erősen párhuzamos DNS-szekvenálási technológiák kimutatták, hogy a vizelet nem teljesen steril, és a vizelet mikrobiom fogalma érdekes kutatási témaként alakult ki . Valószínű, hogy a húgycső külső részeit, különösen a nőknél, perineális és hüvelyi forrásokból származó baktériumok kolonizálják. Az is nyilvánvaló, hogy a tiszta fogású vizelet nem optimális gyűjtése női betegekből a vizelet fehérjékkel és kommenzális baktériumokkal való szennyeződését eredményezheti a hüvely üregéből. Az itt bemutatott adatok magyarázhatók, de nem különböztetik meg a két fent említett forgatókönyvet. Az ebben a vizsgálatban kapott vizeletproteomprofilok körülbelül 25% – a fiziológiailag normális környezetben (pl. uromodulin és citokeratinok) a vizeletbe szekretált fehérjék szempontjából dúsult, vagy bőségesen termelődtek a húgyutak és a hüvely traktusait bélelő nyálkahártya-felületek által leadott hámsejtek. A HCLSO elemzés négy klasztert azonosított (1.ábra), egy nagy klaszter 15 UP mintával, női betegekből származik, csak két kivétellel. A profilok nagy mennyiségben mutattak ki citoszkeletális fehérjéket (pl. deszmoszomális fehérjéket (pl. deszmoplakint és periplakint), valamint cornified sejtburok fehérjéket (pl. citokeratinokat, cornulint és kis prolinban gazdag proteint 3). Az első két kategóriába tartozó fehérjék a legtöbb sejttípusban jelen vannak , beleértve az urothelialis sejteket is, míg a húgycső húsában és a hüvelyi traktusban elhelyezkedő rétegzett laphámhám bőségesen termel fehérjéket ezekből a kategóriákból . A vizelet üledékeinek mikroszkópos vizsgálata megerősítette a megnövekedett laphámsejt-tartalmat a négy klaszterben jelen lévő minták többségénél (további Fájl 3: A3 táblázat), a továbbiakban uromodulin és hüvelyi baktériumokkal rendelkező laphámsejt-klaszterek (USEV). Az Uromodulin, a húgyutak víz/elektrolit egyensúlyához hozzájáruló fehérje szintén bőséges volt az USEV klaszter mintáiban. A hüvelyi baktériumokat (Lactobacillus és G. vaginalis) 22 mintából 30 mintából azonosították, és ezek közül 5 mintában nem voltak baktériumok. A proteomikus adatok megerősítették az USEV klaszterek gyulladásának nagyon alacsony szintjét az esetek 74% – ában a NAD pontszámok szerint, amint az a minták helyzetéből kitűnik a 2.ábra ábráján. Az USEV klaszter reprezentatív profilja az LG-23, 20%-os NAD-pontszámmal és a gyulladáshoz kapcsolódó fehérjék alacsony abundanciájával, kivéve a defenzin-1-et és az S100A8-at (3.ábra). Az SA_112 és a PM_20 profilokhoz képest az LG_23-ban a gyulladáshoz hozzájáruló összes fehérje kevésbé volt bőséges. A G. vaginalis opportunista kórokozó lehet a húgyúti és hüvelyi traktusokban. A gazdafehérje-profilok csoportosítása az USEV-klaszterekben, amelyeket a Lactobacillus, G. vaginalis vagy mindkét faj IDs-jére választottak ki, jelezte az erős immunválasz hiányát ezekkel a baktériumfajokkal szemben. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a proteomikus analízis diagnosztikai értékkel bír, bizonyítva, hogy a nők urogenitális traktusában nincs fertőzés.

urethralis kolonizáció opportunista patogének által

az USEV klaszterek három olyan esetet tartalmaztak, amelyekben gyakori húgyúti patogéneket azonosítottak, az UPEC-et és a K. pneumoniae-t. A két eset (EC_13 és KP_55) alacsony NAD és ERY pontszámokat mutatott, ami megegyezett a neutrofil által kiváltott gyulladás és érrendszeri sérülés hiányával. A 3. ábrán látható fehérjék relatív abundanciája e két esetben, valamint hasonlóságuk az LG_23 esetében megfigyelt mintával alátámasztotta azt az elképzelést, hogy az UTI-re jellemző immunválaszokat nem a baktériumok kolonizációja váltotta ki. Az, hogy az esetek tünetmentes bakteriuriát (ASB) jelentenek-e, nem értékelhető az ASB molekuláris szintű immunválaszaival kapcsolatos ismeretek hiánya miatt. Összefoglalva, ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy a proteomikus profilok azonosíthatják a húgycső uropatogének általi kolonizációjának eseteit a veleszületett immunrendszer aktiválása nélkül.

hüvelyi szennyeződés urogenitális fertőzések bizonyítékával

a HCLSO elemzés egy UP mintaklasztert hozott létre, amelyet hüvelyi szennyeződésnek (VCO) klaszternek hívtunk, az 1.ábrán látható. A VCO klaszterprofilok magas citoszkeletális, desmosomális és cornifikált sejtburokfehérjék abundanciáját mutatták, de alacsony vagy közepes uromodulin mennyiségeket, ami arra utal, hogy ezekben a mintákban a hüvelyi fehérjetartalom megnövekedett. A VCO pontszámot, öt fehérje mennyiségi arányát fejezték ki a Cervicovaginalis hámszövetben, viszonylag magas specifitással a Tiger adatbázis szerint az uromodulinhoz képest. Ezek a fehérjék a kornifelin, a cornulin, a serpin B3, a galektin-7 és a proteoglikán mucin-5B voltak. A neutrofil-specifikus gyulladásgátló molekulák, mint például az S100-A12 fehérje és a lizozim (LYZ), valamint a vaszkuláris sérülésre utaló vagy arra reagáló fehérjék (HBA1 és fibrinogén-6) nagyobb számban voltak jelen a VCO klaszterben az USEv klaszterhez képest, amint azt a KP_10 esetében az LG_23-hoz képest a 3.ábra mutatja. A VCO klaszter 14 mintát tartalmazott, kivéve egy női betegből származó mintát, amelyek fele egy uropatogén ID-jéhez kapcsolódott. Öt mintában azonosították a G. vaginalis-t vagy a lactobacillust. A klinikai bizonyítékok hüvelyi vérzést javasoltak a beteg számára a kp_10 mintára vonatkozóan, alátámasztva az urogenitális vagy hüvelyi fertőzés diagnosztizálását K. pneumoniae-val. A VCO pontszámok szerepelnek további Fájl 3: táblázat A3. A Wilcoxon rank sum teszt, amely a VCO és USEV klaszterek VCO pontszámait hasonlította össze, 0,017 p-értéket eredményezett, ami arra utal, hogy a pontszám hasznos a vizeletminták nagyobb hüvelyi szennyeződésének észleléséhez. Nem lehet egyértelmű értékelést végezni a VCO pontszám hasznosságáról az UTI megkülönböztetésére a hüvelyi fertőzéstől.

a vizelet üledékeinek Proteomikus elemzése a vizeletkultúrához hasonló érzékenységű és specificitású mikrobákat azonosítja

76 UP mintából azonosítottunk baktériumokat, és Candida albicans-t egy UP mintából (az összes elemzett eset 63% – a). Mindössze 55 esetben végeztek vizeletkultúrákat, amelyek 44% – A azonosított legalább egy kórokozót, 24% – a kommensális organizmusokat, 17% – uk pedig nem mutatott mikrobiális növekedést (további 3.Fájl: A3. táblázat). A kórokozó azonosításával összefüggésben a proteomikus adatok és az UC eredmények nem mindig egyeztek meg (1. táblázat). Úgy tűnik, hogy több ok is hozzájárul a nézeteltérésekhez. A metaproteomikus adatok értelmezésének kihívásai az azonosított mikrobiális fehérjék alapján következnek. Először is, a kevésbé gyakori uropatogének fehérje-azonosítói hiányozhatnak, mivel fehérjeszekvenciáik hiányoznak a keresett adatbázisból. Az adatbázisban szereplő baktériumfajokat proteomikus analízissel azonosították (K. pneumoniae és E. faecalis) két esetben, de az UC adatok filogenetikailag közeli Enterobacter aerogenes és E. faecium Fajok jelenlétére utaltak. Másodszor, a vizeletben alacsony mennyiségben jelen lévő mikrobiális organizmusokat nehezebb azonosítani nagyon bőséges mikrobák jelenlétében, különösen, ha a mikrobiális fajok kiterjedt szekvenciaazonossággal rendelkeznek az ortológ fehérjék között. Az EC_85 és KP_11 profilok (5.Kiegészítő fájl: A1 adatkészlet) szemléltetik ezt a problémát, különösen az Enterobacteriaceae családot, amely az összes UTI többségét okozza. Pontatlan genomikai megjegyzések, pl. a hiányzó gének egy faj esetében (amelyek jelen vannak az UP mintában) az ortológ fehérjék azonosítását eredményezik, amelyeket egy rokon faj genomjában helyesen jegyeztek fel (de hiányoznak az UP mintában). A kis triptikus peptideket egy sörétes proteomikus elemzésben azonosítják, ami a keresési algoritmus helytelen fehérje-hozzárendelését valószínűbbé teszi nagy szekvencia-identitás esetén. Harmadszor, a vizeletben alacsony számban jelen lévő baktériumok azonosítója, kevesebb, mint ~ 10 000 sejt / mL, magas gazdaszervezet proteomikus háttérrel kombinálva kihagyható, mert a gazdaszervezet és a mikrobiális fehérjéket nem külön vizsgálják az LC-MS / MS.a bakteriális organizmusok alacsony CFU-száma az UC adatai szerint alacsonyabb egyezési arányt mutatott a proteomikus azonosítókkal, mint a magas CFU-szám (további Fájl 3: A3 táblázat). Ezzel szemben a mikrobák proteomikus azonosításának megvan az az előnye, hogy kultúrától függetlenek, és információt szolgáltatnak a virulenciáról, az antibiotikum-rezisztenciáról, a tapasztalt stresszről és az azonosított kórokozók növekedési állapotáról. Az ilyen átfogó adatokat feltáró két példát a (kiegészítő Fájl 5: adatkészlet A1). Egy adatkészletben (EC_85) az UPEC, a G. vaginalis és a Lactobacillus fehérjéit profilozták. A másik adatkészletben (KP_11) az UTI oka a K. pneumoniae volt. Az 1. táblázat áttekintést nyújt a nitrit teszt összehasonlításáról, amely a nitrátcsökkentő képességük alapján azonosítja az Enterobacteriaceae-t a vizeletben, valamint az UC eredményeket a proteomikus adatokkal. A pozitív nitrittesztek 90% – a valóban az UPEC vagy a K. pneumoniae kórokozóval rendelkező bakteriuria eseteire vonatkozott, és változatlanul azonosították a proteomikus és UC módszerekkel is. A proteomikus analízissel ellentétben a nitrittesztek tíz esetben nem voltak elég érzékenyek az Enterobacteriaceae azonosítására. A nitrittesztek nem voltak pozitívak 21 esetben, amikor a proteomikus elemzésekből származó azonosító G. vaginalis volt. A kórokozó-azonosítók különbségeit illetően proteomikus kontra UC módszerekkel, a 6-hemolitikus streptococcusokat UC kísérletekkel azonosították három esetben, míg a proteomikus adatok a G. vaginalis jelenlétére utaltak. Amint azt az 1.táblázat mutatja, az UPEC és kisebb mértékben a K. pneumoniae megfelelő azonosítóinak száma magas volt. Összefoglalva, a proteomikus módszer nagyobb érzékenységet mutatott, mint a nitrit teszt, valamint az UC-hez hasonló érzékenységi és specificitási szintek. A vizeletmintában a magas gazda proteomikus háttér csökkenti a mikrobiális azonosítás érzékenységét.