hogyan tervezzünk grns-t a CRISPR genomszerkesztéshez?
a grns a cripr Cas9 rendszert a megfelelő genomi helyre vezeti a kettős szálú törés végrehajtásához.A CRISPR Cas9 rendszer targáló specifitását a 20 nukleotid határozza meg a grns 5′ végén. A grns bázis párosítja a célszekvencia komplementer szálát, a Cas9 nukleáz pedig kettős szálszakítást hajt végre.
a gRNA tervezése során figyelembe kell venni a következő dolgokat.
1) GC tartalom: A tipikus tartomány 40-80% között van . A magasabb GC-tartalom stabilizálja az RNS-DNS duplexet, miközben destabilizálja a célon kívüli hibridizációkat
2) Hossz: a hossz beállítható és 17-24 bázispár között mozoghat. A rövidebb szekvencia minimálisra csökkenti a célhatásokat. ( A 17 bp a vezető szekvencia hosszának legalacsonyabb határa, a vezető szekvencia bármely hossza, amely 17-nél rövidebb, statisztikai esélye van több genomi lókusz megcélzására.)
3) potenciális off-target hatások: Mismatch tolerancia és a cél helyén, ami off-target hatások. Ez csökkenthető a genom-wideoff célhatás keresésekkel.
sok olyan webhely létezik, amely segít a gRNAs tervezésében. Ezek közül néhány a Chop Chop (Harvard), a Broad Institute sgrna designer és a Biotools.
itt elmagyarázom, hogyan kell használni a Chop Chop weboldalt,
1) Menj ide https://chopchop.cbu.uib.no/
2) faj kiválasztása
3) Válassza ki a fajspecifikus génazonosítót, vagy vágja le és illessze be a kérdéses nukleotidot, és kezdje el az elemzést.
az elemzés elvégzése után a helyspecifikus grns grafikus ábrázolása jelenik meg. Minden lehetséges grns megmutatja a lehetséges célhatásokat is. Válassza ki azokat, amelyeknek kevesebb a célhatása.
